马铃薯晚疫病致病菌的保存方法及专用培养基

摘要

本发明公开了马铃薯晚疫病致病菌的保存方法及专用培养基。本发明的马铃薯晚疫病致病菌的保存方法包括如下步骤：将马铃薯晚疫病菌菌株接种于装有无菌的黑麦麦粒与水混合物的容器中，在12℃-18℃、黑暗和容器封闭的条件下保存。本发明根据马铃薯晚疫病菌在水中能存活的特点，提供了一种在无菌的黑麦粒与水的混合物中保存马铃薯晚疫病菌菌株的方法。实验证明，该方法保存时间长，且保存后的菌株仍保持较高活性；另外，本发明方法操作简便、成本低、降低了操作过程中杂菌的污染几率。因此，本发明方法马铃薯晚疫病菌及病害的研究工作提供了基本保障，具有重要的实际应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种马铃薯晚疫病致病菌的保存方法及专用培养基。

背景技术

马铃薯是我国第四大粮食作物，在东北、西北、西南、华北等地区均可种植。自2005年起，中国的马铃薯产量已跃居世界第一位。晚疫病是马铃薯和番茄生产上最重要的病害之一，在我国各大马铃薯主产区均有发生，西南地区因气候原因常年发病，其他地区也因气候差异，发病时间不同，分布在3-10月份。该病害为土传病害，同一生长季内侵染频繁，能侵染寄主的叶片、茎杆和薯块，在一周内导致植物整株死亡。侵染初期叶片表现为水渍状病斑，气候湿润条件下肉眼可见白色霜状霉层。

马铃薯晚疫病的病原菌为致病疫霉(Phytophthora infestans de Bary)，该病原菌属于卵菌，是一种寄生性很强的兼性寄生菌。主要以游动孢子形成的休止孢产生芽管，自气孔或皮孔直接侵入马铃薯，通常在黑麦番茄培养基或V8培养基上培养。该菌在离体条件下难以长期保存。一般的保存方法，如斜面保存法，因用于制备斜面的培养基容易干燥，保存时间通常不到一年，而且通常制备斜面时需要先对培养基灭菌，然后再进行培养基分装的工作，增大了污染的几率。孢子冻干保存法，液氮保存法等需要专用的设备，其保存成本也较高。对于这一世界性的病害，病原菌菌株的长期保存对于深入的研究该病害至关重要。因此，寻找一种较长期的保存方法是非常必要的。

菌龄的定义：从将菌接种在新鲜的黑麦番茄培养基上开始计起，培养的天数即为菌龄。

每升黑麦番茄培养基按照如下方法配制：将50-60g黑麦粒、100ml新榨番茄汁(蕃茄需去皮)和0.4g CaCO₃混合，用蒸馏水定容至1升。

每升水琼脂培养基(1.6％)按照如下方法配制：将16g琼脂粉溶于蒸馏水中，用蒸馏水定容至1升。

黑麦麦粒去掉颖壳后，包括胚、胚乳和种皮。

发明内容

本发明的目的是提供一种马铃薯晚疫病致病菌的保存方法。

本发明所提供的马铃薯晚疫病致病菌的保存方法，包括如下步骤：将马铃薯晚疫病致病菌接种于装有无菌的黑麦麦粒与水混合物的容器中，在12℃-18℃、黑暗和容器封闭的条件下保存。

上述过程中，所述黑麦麦粒与水混合物中，黑麦麦粒与水的配比为(0.1g-0.2g)∶1.4mL，具体为0.1g∶1.4mL或0.15g∶1.4mL或0.2g∶1.4mL。

上述过程中，所述马铃薯晚疫病致病菌在接种时的菌龄为5-14天或7-14天，具体为7天或10天或14天。

上述过程中，所述马铃薯晚疫病致病菌以菌丝块的形式接种；菌丝块的大小为(1～5)mm×(1～5)mm×(1～5)mm，优选为(2～3)mm×(2～3mm)×(2～3)mm，具体为2mm×2mm×2mm或3mm×3mm×3mm或5mm×5mm×5mm；所述接种量为1-5块菌丝块：0.1g-0.2g黑麦麦粒：1.4mL水，优选为2-5块菌丝块：0.1g-0.2g黑麦麦粒：1.4mL水，具体为5块菌丝块：0.1g黑麦麦粒：1.4mL水或4块菌丝块：0.15g黑麦麦粒：1.4mL水或2块菌丝块：0.2g黑麦麦粒：1.4mL水。

上述过程中，所述菌丝块按照包括如下步骤的方法制备：将马铃薯晚疫病致病菌接种于黑麦番茄培养基上，培养5-14天或7-14天，在菌落中心位置切取菌丝块，即得到所述菌丝块；所述培养的时间具体为7天或10天或14天。

上述过程中，在所述接种后，在所述保存前，包括如下步骤：将所述接种后的菌培养至长出白色菌丝；所述保存的温度为12℃、15℃或18℃；

所述将马铃薯晚疫病致病菌接种于黑麦番茄培养基上培养中和所述将接种后的菌培养至长出白色菌丝中，所述培养在温度为16℃-18℃和黑暗的条件下进行；所述培养的温度具体为16℃或17℃或18℃；

所述将所述接种后的菌培养至长出白色菌丝中，所述培养的时间为2-4天，具体为2天或3天或4天。

上述过程中，所述黑麦麦粒和所述菌丝块均浸没在所述水的水面之下，所述黑麦麦粒、所述水和所述菌丝块的混合物的体积占所述容器体积的3/5以下。

实验证明，当混合物的体积占容器体积的4/5时，污染率很高；而占3/5时就没有污染。

上述过程中，所述装有无菌的黑麦麦粒与水混合物的容器按照如下(1)或(2)所示方法得到：

(1)将所述黑麦麦粒与水混合物装入容器中，再灭菌；

(2)将所述黑麦麦粒与水混合物先灭菌，再装入无菌的容器中；

所述黑麦麦粒与水混合物按照如下方法制备：将黑麦麦粒放入水中，浸泡12-24小时，得到黑麦麦粒与水混合物。所述浸泡时间具体为12小时、18小时或24小时。

上述过程中，所述容器为离心管、冻存管或玻璃试管；

上述过程中，所述黑麦麦粒为去掉颖壳后的黑麦麦粒；

上述过程中，所述水为蒸馏水或去离子水；

上述过程中，所述接种在无菌条件下进行；

上述过程中，所述马铃薯晚疫病致病菌为马铃薯晚疫病致病疫霉(Phytophthorainfestans de Bary)；

上述过程中，所述容器为2mL的冻存管时，所述黑麦麦粒用量为0.1-0.2g，所述水的用量为1.4mL；所述黑麦麦粒用量具体为0.1g或0.15g或0.2g；

上述过程中，所述保存的时间可为1年或2年。

本发明的另一个目的是提供一种用于保存马铃薯晚疫病致病菌的培养基。

本发明所提供的用于保存马铃薯晚疫病致病菌的培养基，按照包括如下步骤的方法得到：将黑麦麦粒放入蒸馏水或去离子水中，浸泡12小时-24小时，得到的混合物即为用于保存马铃薯晚疫病致病菌的培养基；所述浸泡时间具体为12小时、18小时或24小时。所述黑麦麦粒与所述蒸馏水或去离子水的配比为(0.1g-0.2g)∶1.4mL，具体为0.1g∶1.4mL或0.15g∶1.4mL或0.2g∶1.4mL。

上述培养基中，所述黑麦麦粒为去掉颖壳后的黑麦麦粒。

本发明根据马铃薯晚疫病菌在水中能存活的特点，提供了一种在无菌的黑麦粒与水的混合物中保存马铃薯晚疫病菌的方法。实验证明，该方法保存时间长，且保存后的菌仍保持较高活性，在管内水分不干的前提下，保存后菌的成活率可以达到90％；另外，本发明方法操作简便、成本低、降低了操作过程中杂菌的污染几率。因此，本发明方法马铃薯晚疫病菌及病害的研究工作提供了基本保障，具有重要的实际应用价值。

附图说明

图1马铃薯晚疫病在田间马铃薯叶片上的症状。

图2马铃薯晚疫病菌菌株在黑麦番茄培养基上培养7天时的形态。

图3在冻存管中保存的晚疫病菌菌株。

图4用10×10规格的冻存管盒保存冻存管。

图5将游动孢子悬浮液接种在马铃薯叶片上。

图6接种7天后叶片上产生的大量游动孢子囊。

图7黑麦粒形态。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

供试植物材料：马铃薯品种夏波蒂，购自内蒙古呼和浩特市正丰马铃薯种业股份有限公司。

实施例1，马铃薯晚疫病菌的分离培养和保存

一、马铃薯晚疫病病样的采集和病菌的分离培养

从中国马铃薯主产区甘肃省采集共分离得到100株马铃薯晚疫病菌。具体方法为：将田间采集到的发病植株(图1)加入干燥的报纸中带回试验室。为保证湿度，将新近配制的水琼脂培养基(1.6％)倒入一次性的9cm塑料培养皿中，每皿倒入约12-14mL培养基，然后在超净台里放凉使其凝固。取出采回的病样，选出被病原菌侵染并仍含有健康部分的叶片；调节自来水大小为小股流下，将叶片尤其是叶片背面冲洗干净(主要是洗去叶背面已产生的游动孢子囊)，然后用灭完菌的滤纸吸干叶片表面的水。叶片经编号后取病健交界处，使叶背面朝上放入培养皿中，每皿可放3-4片。接着放入16-18℃培养箱中黑暗培养12-16小时，使叶片重新长出新的孢子囊和孢囊梗。在解剖镜下挑取新产生的孢子囊转移至黑麦番茄培养基上，16-18℃条件下黑暗培养2-4天，待黑麦培养基上长出菌丝时再转移至新的黑麦番茄培养基上进行纯化培养。得到纯化菌株。结果，纯化得到的菌株为马铃薯晚疫病的病原菌致病疫霉(Phytophthorainfestans de Bary)。

致病疫霉(Phytophthora infestans de Bary)在文献(Guo LY，Zhu×Q，Hu CH，RistainoJB，2010.Genetic structure of Phytophthora infestans populations in China indicates multiplemigration events.Phytopathology 100，997-1006.)中公开过，公众可从中国农业大学获得。

二、保存

下述各保存方法中所用的黑麦粒是去掉颖壳后剩余的部分(下文中仍称作麦粒)，包含了胚、胚乳和种皮。其形态如图7所示。

(一)方法I

1、将0.1g(3粒)健康黑麦粒放入2mL冻存管，再加入1.4mL蒸馏水，使蒸馏水浸泡黑麦粒12小时，然后将装有黑麦粒和蒸馏水的冻存管高压蒸汽灭菌，在无菌条件下将冻存管盖子拧紧，放入培养箱或冷藏柜中备用。

2、纯化培养菌株：将马铃薯晚疫病病原菌致病疫霉(Phytophthora infestans deBary)接种于黑麦番茄培养基上，16℃条件下黑暗培养7天，在菌落中心位置切取菌丝块，菌丝块大小为2mm×2mm×2mm。

3、接种和保存：在无菌条件下，将5个菌丝块放入已经灭完菌的含有黑麦粒和水混合物的2mL冻存管中(黑麦粒和菌丝快均浸没在水面之下)(黑麦粒、菌丝块和水的混合物的体积占冻存管体积的五分之三)，拧紧盖子，16℃培养2天使冻存管中长出可见白色菌丝，然后将冻存管放入冻存盒中、于12℃和黑暗条件下保存，必要时还可用封口膜(Parafilm)将冻存管口封上，较少水分散失。

按照如上方法将菌株保存1年和2年。

(二)方法II

1、将0.15g(4粒)健康黑麦粒放入2mL冻存管，再加入1.4mL蒸馏水，使蒸馏水浸泡黑麦粒18小时，然后将装有黑麦粒和蒸馏水的冻存管高压蒸汽灭菌，在无菌条件下将冻存管盖子拧紧，放入培养箱或冷藏柜中备用。

2、纯化培养菌株：将马铃薯晚疫病病原菌致病疫霉(Phytophthora infestans deBary)接种于黑麦番茄培养基上，17℃条件下黑暗培养10天(图2)，在菌落中心位置切取菌丝块，菌丝块大小为3mm×3mm×3mm。

3、接种和保存：在无菌条件下，将4个菌丝块放入已经灭完菌的含有黑麦粒和水的2mL冻存管中(黑麦粒和菌丝快均浸没在水面之下)(黑麦粒、菌丝块和水的混合物的体积占冻存管体积的五分之三)，拧紧盖子，17℃培养3天使冻存管中长出可见白色菌丝(图3)，然后将冻存管放入冻存盒中(图4)、于15℃和黑暗条件下保存，必要时还可用封口膜(Parafilm)将冻存管口封上，较少水分散失。

按照如上方法将菌株保存1年和2年。

(三)方法III

1、将0.2g(5粒)健康黑麦粒放入2mL冻存管，再加入1.4mL蒸馏水，使蒸馏水浸泡黑麦粒24小时，然后将装有黑麦粒和蒸馏水混合物的冻存管高压蒸汽灭菌，在无菌条件下将冻存管盖子拧紧，放入培养箱或冷藏柜中备用。

2、纯化培养菌株：将马铃薯晚疫病病原菌致病疫霉(Phytophthora infestans deBary)接种于黑麦番茄培养基上，18℃条件下黑暗培养14天，在菌落中心位置切取菌丝块，菌丝块大小为5mm×5mm×5mm。

3、接种和保存：在无菌条件下，将2个菌丝块放入已经灭完菌的含有黑麦粒和水的2mL冻存管中(黑麦粒和菌丝快均浸没在水面之下)(黑麦粒、菌丝块和水的混合物的体积占冻存管体积的五分之三)，拧紧盖子，18℃培养4天使冻存管中长出可见白色菌丝，然后将冻存管放入冻存盒中、于18℃和黑暗条件下保存，必要时还可用封口膜(Parafilm)将冻存管口封上，较少水分散失。

按照如上方法将菌株保存1年和2年。

实施例2菌株保存活力检测

(一)保存后马铃薯晚疫病菌的存活率测定

从实施例1的方法II中保存时间分别为2年和1年的2mL冻存管中各挑取一粒黑麦粒放入9cm含有黑麦番茄培养基的平板上，在18℃条件下黑暗培养7天，显微镜观察是否长出新的菌丝或游动孢子囊。长出新的菌丝或游动孢子囊的菌即判定是存活的。如此分别检测100个保存管中的菌，统计存活管数占100个管数的比例。实验设3次重复，结果取平均数。结果保存2年的管中90％的管中菌是存活的；保存1年的管中90％的管中菌是存活的。

实施例1的方法I和III中保存1年和2年的菌的成活率检测结果与上述无显著差异。

(二)保存后马铃薯晚疫病菌的致病型测定

从实施例1的方法II中保存时间分别为2年和1年的2mL冻存管中各挑取一粒黑麦粒放入9cm含有黑麦番茄培养基的平板上，5-7天待长出新的菌丝后切取5mm的菌丝块放入新的含有黑麦番茄培养基的培养皿中黑暗培养7-10天，此时产生大量的游动孢子囊。用无菌水将游动孢子囊洗下，制成5000个孢子囊/mL悬浮液。将制成的孢子悬囊浮液在4℃条件下放置2.5h，然后在室温(25℃)放置0.5h以促使游动孢子囊释放出游动孢子，此时的孢子悬囊浮液也记作孢子悬浮液。剪取在14-16℃条件下生长4-6周的马铃薯品种夏波蒂的中部复叶，叶背面朝上铺在含有润湿滤纸的9cm塑料培养皿中，取10μL制备好的游动孢子悬浮液接种在叶片背面，接4片叶子(图5)。然后将接种后的叶片放入16℃人工气候箱中，16h光照/8h黑暗条件下培养7-10天后观察结果。

判断致病的标准：叶片背面产生大量的游动孢子囊和孢子梗。

结果表明，保存2年的马铃薯晚疫病菌和保存1年的马铃薯晚疫病菌均能使马铃薯品种夏波蒂叶片致病，并产生大量的游动孢子囊和孢子梗(图6)。

实验设3次重复，结果无显著差异。

实施例1的方法I和III中保存1年和2年的菌的检测结果与上述无显著差异。