马铃薯晚疫病菌的快速检测和马铃薯抗晚疫病新型受体基因的筛选

摘要

马铃薯是世界上最重要的四种粮食作物之一，中国是世界上马铃薯种植面积最大的国家，产量约占全世界总产量的四分之一。由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的马铃薯晚疫病是生产上的毁灭性病害，仅在中国每年造成的直接经济损失就超过10亿美元。 对病原菌快速灵敏的检测和对病害的准确诊断是有效防治晚疫病的关键。目前虽然已开发出一些较为准确的致病疫霉诊断技术，但是需要较长的诊断时间和复杂的操作过程。不仅如此，目前报道的致病疫霉检测方法都需要热循环设备和电泳仪，有时候甚至需要更昂贵的荧光分析设备，这在基层和欠发达的地区难以适用。因此迫切需要建立一种能快速检测致病疫霉菌的方法。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)不仅特异性强、灵敏度高，而且操作简单、扩增产物易检测，因此更适合在农业生产中应用。本研究基于环介导等温扩增技术，选用致病疫霉特异的类转座子序列PiA3aPro为新型靶标设计并筛选了一套特异性强、灵敏度高的LAMP引物，以此为基础建立了检测致病疫霉的技术体系。该体系反应条件为64℃，70min，选用HNB为指示剂，用肉眼即可观察结果。在特异性检测中，对来自世界各地分离到的15株致病疫霉进行检测，结果发现均能显示为阳性，而其它多种疫霉、腐霉、真菌以及细菌的供试菌株中仍显示为阴性。在灵敏度检测中发现，该体系最低能检测到浓度为10fg·μL-1的致病疫霉DNA。通过在土壤中人工添加孢子的实验发现，PiA3aPro-LAMP体系能够从每0.25克土壤中含10个致病疫霉游动孢子的样品中检测出该病菌。综上所述，本研究在建立了一种快速、灵敏、特异、可视化的致病疫霉菌的LAMP检测方法。该LAMP检测体系可在70min内检测完样品，在显著的缩短了检测时间的同时，也显著的降低了检测成本，能在基层和出入境口岸等大批量植物的快速检测中发挥巨大的作用。 目前，选育及使用抗病品种和喷洒化学农药是晚疫病防治的主要措施，但是由于病原菌繁殖和进化速度快，品种抗性和药剂防治效果极易丧失，所以需要建立可持续的综合防治措施。提高植物自身基础抗病性是一种可行办法。植物基础抗性主要通过位于细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）来识别病原菌分泌的病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMPs），从而启动一系列的免疫反应来抵抗病原物的侵染。目前，多项研究发现异源表达模式识别受体可以使植物获得广谱抗病性。鉴定新型模式识别受体可使植物获得广谱抗病性，是国际植物病理学研究的热点，也具有潜在的作物改良价值。XEG1是一类在植物疫霉菌中广泛存在且保守的属于糖基水解酶家族中的PAMP，能诱发茄科植物产生免疫反应。然而，植物是如何识别XEG1并防御病原菌的目前尚未得知，探究其触发的植物免疫机制将有助于新抗病品种的开发。LRRs(leucine-rich repeats)家族含有保守的亮氨酸重复序列，是植物PRR中数量最多的一类。根据胞内区域的不同可将它分为受体激酶（Receptor-Like Kinases，RLKs）和类受体蛋白（Receptor-Like Proteins，RLPs）两大类。本课题组发现本氏烟的细胞膜受体中有400多个属于LRR家族。在本研究中，计划通过病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技术在本氏烟中对部分LRR受体基因沉默，通过观察XEG1诱导过敏性坏死反应的变化来筛选它的模式识别受体。本研究参与了烟草LRR类受体沉默载体库的构建，成功构建了105个LRR类受体沉默载体。筛选发现XEG1及其同源基因在TRV∶R3处理后的本氏烟中诱导的过敏性坏死消失。载体R3同时沉默了两个同源性很高的LRR受体，分别命名为RXEG1A和RXEG1B，暗示这两个受体可能参与了植物对XEG1的识别过程。随后通过Co-IP的方式验证了XEG1仅能特异性地与类受体蛋白RXEG1A互作。通过Pulldown的方法进一步证明了两者的互作关系，并且将能与XEG1互作鉴定到RXEG1A的LRR区域。在烟草中过表达RXEG1A后接种致病疫霉游动孢子发现能抑制致病疫霉的侵染。本研究通过筛选类得到了XEG1的类受体蛋白RXEG1A，类受体蛋白RXEG1A的发现为马铃薯抗晚疫病育种和改良提供了新材料。

目录

声明

摘要

上篇文献综述

第一章马铃薯晚疫病的研究进展及病原菌检测

1 马铃薯晚疫病的研究进展

2环介导等温扩增技术在病原微生物检测中的应用

3 PAMPs的研究进展

下篇研究内容

第一章基于环介导等温扩增技术检测致病疫霉

1材料和方法

2结果

3 讨论

参考文献

第二章XEG1模式识别受体的筛选与功能分析

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

附录

致谢