一种近平滑假丝酵母真菌及其在普洱茶生产中的应用

摘要

本发明涉及一种近平滑假丝酵母真菌及其在普洱茶生产中的应用，属生物技术领域。本发明的近平滑假丝酵母真菌，由生产菌株经酵母合成培养基、PDA培养基分离纯化工序得到；生产菌株为近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)GPT-5-11，保藏日期：2010年5月20日，保藏号CCTCC M 2010122，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉武汉大学。该近平滑假丝酵母真菌应用于普洱茶的生产中。本发明的优点在于：将酵母菌按重量比为5％的比例用于普洱茶的生产过程中，普洱茶中的GABA含量显著提高，GABA含量达到153.32mg/100g，在保持传统普洱茶风味的基础上，香气和汤色方面也具有新的特点，且缩短了加工时间，对普洱茶新产品与特色普洱茶的开发发挥重要作用。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种近平滑假丝酵母真菌及其在普洱茶生产中的应用，属生物技术领域。

背景技术：

酵母菌用于发酵果汁、发酵面包和制造美味、营养的食物而服务于人类已经很多世纪了。随着现代生物技术的发展，人们在广泛多样化的发酵过程中利用它们，酵母菌就显得更重要，用途更广。由于酵母蛋白质含量高可以用来制造食用酵母或饲料酵母，其资源开发潜力很大。同时，酵母菌体含有大量的蛋白质和丰富的维生素，可供食用、药用及加工饲料，有机物经酵母菌发酵后蛋白质、维生素、氨基酸等物质的生物活性大幅度提高。酵母菌在发酵食品中已经获得了广泛使用，具有很高的安全性，也存在较高的GAD活性，能够提高发酵液中γ-氨基丁酸含量，Takahashi等人筛选到了Saccharomycescerevisiae UT-1的GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶缺陷突变型菌株GAB7-1和GAB7-2，其发酵液中GABA浓度分别达到了0.4mM和0.42mM，较野生株分别提高了2.0和2.1倍。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)，是一种非蛋白质组成的新资源食品，具极强的生理活性，广泛存在于自然界的动植物体内。植物如参属、豆科属、中草药、茶树等的根茎叶、种子和组织液中都含有GABA；在动物体内，GABA几乎只存在于神经组织中(脑组织中的含量大约为0.1～0.6mg/g)，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，参与多种代谢活动，具有很高的生理活性，如降压、改善脑机能、增强记忆、抗焦虑、治疗癫痫、控制哮喘、调节激素分泌、防止肥胖、促进生殖、活化肝肾、改善神经细胞性老年呆痴、缓解脑血栓、脑动脉硬化造成的头疼、耳鸣等生理功能。2009年9月27日，卫生部批准γ-氨基丁酸、初乳碱性蛋白、共轭亚油酸、共轭亚油酸甘油酯、植物乳杆菌(菌株号ST-Ⅲ)、杜仲籽油为新资源食品，标志着GABA在国内进入崭新纪元，将引导中国进入新食品消费时代。

普洱茶是云南的特色茶，在其加工过程中，渥堆发酵是关键工序之一，微生物又是渥堆发酵工序的重要影响因子，所以微生物与普洱茶加工和普洱茶品质的形成有密切关系。国外研究表明，在普洱茶渥堆过程中，酵母菌是优势菌种之一，能抑制一些产毒霉菌的生长，而且酵母菌不分泌有毒的抗生物，同时酵母菌还有丰富的营养物如维生素、蛋白质等，对普洱茶品质的形成有重要意义。

如果在普洱茶渥堆过程中数量控制得当，能够增加普洱茶中的有效营养物质及对人体有保健作用的物质，有利于形成普洱茶甜、醇、香等品质风格。为此，我们可利用从自然界中分离纯化得到的产GABA的酵母真菌作用于普洱茶生产过程中，提高普洱茶中GABA含量，研发新的风味普洱茶。

发明内容：

本发明的目的是从微生物的角度对普洱茶进行研究，为生产企业提供GABA普洱茶有益菌株来源。本发明的另一目的是通过控制有益菌种在普洱茶生产中的比例，为促进云南普洱茶健康发展发挥作用。

本发明的近平滑假丝酵母真菌，从天然物质中经酵母合成培养基、PDA培养基分离纯化得到，经薄层层析定性，高效液相和氨基酸分析仪定量该菌株产GABA含量达2.42g/L，为生产GABA功能性食品提供菌株来源。GPT-5-11菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学生命科学院保藏中心，保藏日期：2010年5月20日，保藏号：CCTCC M 2010122。

本发明的近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)GPT-5-11的形态学特征为：

在YM培养基培养72小时，显微形态为细胞椭圆形、长椭圆形，多极芽殖，有假菌丝；菌落形态为奶油色，光滑湿润，有光泽，边缘整齐。

近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)GPT-5-11的Meg 4.0建树结果为：

对所测菌株的26S rDNA D1/D2序列图谱校正，提交GenBank′并在GenBank，EMBL，DDBJ等国际核酸序列数据库中进行同源序列搜索(BLASTsearch)，以比较测试菌株与酵母菌种模式菌株对应序列的相似程度，并结合形态学及生理学特征分析对其做出鉴定。菌株间的序列比较用Clustal.x软件完成。用Neighbor-Joining方法进行分子系统学分析，并进行1000次bootstrap统计学检验，用TreeView软件显示系统树。

本发明经酵母合成培养基、PDA培养基分离纯化等传统工序后得到。

本发明应用于普洱茶加工有提高普洱茶中GABA含量的作用。

本发明的优点在于：将酵母菌按重量比为5％的比例用于普洱茶的生产过程中，普洱茶中的GABA含量显著提高，GABA含量达到153.32mg/100g，在保持传统普洱茶风味的基础上，香气和汤色方面也具有新的特点，且缩短了加工时间，对普洱茶新产品与特色普洱茶的开发发挥重要作用。

具体实施方式：

本发明经传统的酵母合成培养基及PDA培养基分离纯化工序后得到。

实施例1：GPT-5-11菌种的纯化

从天然牛奶、泡菜等中分离纯化，将样品稀释涂布于酵母合成培养基上，28℃培养48h，挑取单菌落划线纯化得到酵母菌纯菌株，共获23株。酵母合成培养基为：葡萄糖20g，酵母提取物5g，蛋白胨10g，琼脂粉20g，水1000mL，pH 6.0；121℃灭菌20min。

纯化方法如下：

(1)将固体培养基(酵母合成培养基)熔化，冷却至45℃，注入无菌培养皿中，每皿约15～20毫升，稍微摇转，静置，使成平板备用。

(2)稀释：按十倍稀释法把菌悬液稀释至10-8，十倍法是指下一管的菌悬液要比上一管的稀十倍。

(4)接种：事先准备好的平板9套，分别标号为10-6、10-7、10-8，每个稀释度写三套平皿，以便比较。在每个已标号的平皿中注入1ml相应的菌悬液，用涂布棒涂均匀，放入25～28℃培养24小时观察。

(5)培养2～5天后，挑取单个菌落，用PDA斜面培养基进行菌株活化传代，菌株每4周接转1次。菌株转接到新的PDA固体平板上26℃活化培养48h，再转接到种子培养基24h用作发酵种子。

(6)最后把选出的菌种接种到液态培养基，即250ml三角瓶中装入50mlCza培养基(葡萄糖30g，NaNO 33g，酵母提取物1g，K2HPO 1g，MgS04·7H2O 0.5g，KCl0.5g，FeSO4 7H2O 0.01g，，水1000mL，pH 6.0；含0.5％谷氨酸)，按2％的接种量接入菌株，28℃摇床培养48h，取发酵液通过薄层层析定性，高效液相、氨基酸分析仪定量分析发酵液中GABA含量，进行产GABA菌株的筛选。

实施例2：酵母菌的生产应用

将毛茶按传统的方法进行湿热，环境湿度70％；潮水量30％，随后在毛茶中接种重量比为5％的GPT-5-11让其发酵，当堆温升高到26±3℃时，GPT-5-11开始进行代谢，并且随着堆温进一步的升高，分泌出大量的酶，尤其是谷氨酸脱羧酶(GAD)，谷氨酸在该酶的作用下可转化为GABA，提高发酵茶样中GABA含量。

经接种近平滑假丝酵母菌后生产的普洱茶，其GABA含量有明显的提高，普洱茶中的GABA含量达到153.32mg/100g，形成的GABA普洱茶，其汤色红浓明亮，滋味醇滑回甘，独特香气。