温郁金1号的组织培养法

摘要

本发明公开了一种温郁金1号的组织培养法，依次包括以下步骤：1)将无病斑、无虫瘿且健壮饱满的温郁金1号块根放入生化培养箱进行催芽；2)割取小芽进行流水冲洗；3)将小芽经常规消毒后，剥取3～5毫米大小的茎尖进行培养；4)割取茎尖作为小苗Ⅰ接种到不定芽诱导培养基上进行培养；5)割取小苗Ⅰ上诱导出的不定芽Ⅰ作为小苗Ⅱ进行增殖培养；6)割取小苗Ⅱ上长出的不定芽Ⅱ作为小苗Ⅲ进行生根培养；7)待上述小苗Ⅲ长到高4～8cm且具有至少3条长于2cm的根时，得可出瓶种植的种苗。采用该方法能快速获得大量的温郁金1号组培种苗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种温郁金1号的组织培养法。

背景技术

温郁金具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗艾滋病等多种药理活性，临床上用于治疗肺癌、肝癌、乳腺癌、胸腹水等。其在浙南有一千多年的栽培历史，主产地浙江瑞安，且多栽培，少野生。但因多年种植、管理混乱，并随着环境污染及土壤营养贫瘠等日趋严重，导致温郁金药材种质退化、品质下降，这严重影响了温郁金药材产业的发展。

温郁金1号作为温郁金的品种之一，可由乐清市源生中药材种植有限公司提供。目前现有的温郁金1号的培育法为种茎繁殖，该方法具有如下缺陷：年繁殖率仅为25倍左右。

温郁金脱毒组织培养技术研究(汪洪，2009，药物生物技术)公开了一种温郁金的培养方法，该方法具有如下不足之处：不定芽的繁殖系数低，仅为2～4倍；增殖周期长，约为4周；而且在不定芽增殖过程中，根原基被诱导，发育成大量根系，不定芽和不定根的同时生长不仅严重影响了增殖效率，而且使不定芽的继代分割不易操作，最终导致种苗质量下降，移栽成活率低，仅达85％。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种温郁金1号的组织培养法，采用该方法能快速获得大量的温郁金1号组培种苗。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种温郁金1号的组织培养法，依次包括以下步骤：

1)、将无病斑、无虫瘿且健壮饱满的温郁金1号块根放入生化培养箱进行催芽，直至长成0.5～2.0cm高的小芽；培养条件为：26～28℃暗培养；

2)、割取上述小芽进行流水冲洗；

3)、将上述流水冲洗后的小芽经常规消毒后，剥取3～5毫米大小的茎尖作为外植体接种到无菌苗培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m^-2.s^-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；

4)、待上述茎尖长至1.0～2.0cm高时进行割取作为小苗Ⅰ；将上述小苗Ⅰ接种到不定芽诱导培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m^-2.s^-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；

5)、待从小苗Ⅰ上诱导出的不定芽Ⅰ长到1.0～3.0cm高时，割取不定芽Ⅰ作为小苗Ⅱ；将上述小苗Ⅱ接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；

6)、待上述小苗Ⅱ上长出的不定芽Ⅱ长到3.0～6.0cm高时，割取不定芽Ⅱ作为小苗Ⅲ；将此小苗Ⅲ接种到生根培养基中；培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；

7)待上述小苗Ⅲ长到高4～8cm且具有至少3条长于2cm的根时，得可出瓶种植的种苗。

作为本发明的温郁金1号的组织培养法的改进：将温郁金1号的小芽放入纱袋中，无菌水冲洗1～2小时。

作为本发明的温郁金1号的组织培养法的进一步改进：

步骤3)中的无菌苗培养基为：1/2MS基本培养基+白砂糖20～30g/l+琼脂4～9g/l，pH为5.5～6.0；

步骤4)中的不定芽诱导培养基为：MS基本培养基+TDZ 0.05～0.5mg/l+白砂糖20～30g/l+琼脂4～9g/l，pH为5.5～6.0。

步骤5)中的增殖培养基为：MS基本培养基+TDZ 0.05～0.5mg/l+白砂糖20～30g/l+琼脂4～9g/l，pH为5.5～6.0。

步骤6)中的生根培养基为：1/2MS基本培养基+白砂糖15～20g/l+琼脂4～10g/l，pH为5.5～6.0。

在本发明中：

无菌苗培养基的制作方法具体如下：以1/2MS基本培养基(即溶液中所有物质的含量为MS基本培养基的一半)为基础，分别加入白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L的1/2MS基本培养基中加20～30g白砂糖、4～9g琼脂。

不定芽诱导培养基的制作方法具体如下：以MS基本培养基为基础，分别加入N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5脲(TDZ)、白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L的MS基本培养基加入0.05～0.5mg的TDZ、20～30g白砂糖、4～9g琼脂。

增殖培养基的制作方法具体如下：以MS基本培养基为基础，分别加入N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5脲(TDZ)、白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L的MS基本培养基加入0.05～0.5mg的TDZ、20～30g白砂糖、4～9g琼脂。

生根培养基的制作方法具体如下：以1/2MS基本培养基(即溶液中所有物质的含量为MS基本培养基的一半)为基础，分别加入白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.5～6.0；每1L 1/2MS基本培养基中加15～20g白砂糖、4～10g琼脂。

本发明的温郁金1号组织培养法，属于一种离体快速繁殖的组织培养方法。依照植物组织培养中细胞全能性的原理，可以在短时间内生产大量遗传背景相同、长势一致的优质种苗(种子)，而且依靠实验室可以实现周年的长期提供优质种苗。在本发明的方法中，将健康饱满的温郁金1号块根进行催芽，并割取小芽进行消毒；再通过合适的诱导培养基进行诱导不定芽以及增殖不定芽，可以获得大量的无菌苗。采用本发明的方法，一般仅需45～60天即可得到可出瓶种植的种苗；因此温郁金1号组培苗一周年内的繁殖系数理论上为6¹⁰倍以上。所以，本发明的温郁金的组织培养法，是一种不受季节等因素影响，高效、快速提供优质温郁金种苗的方法，可以加速良种推广速度，提高田间品种种植产量。

综上所述，本发明建立的温郁金1号组织培养体系将为良种(温郁金1号)工厂化育苗提供理论依据和技术支撑。

本发明所得的种苗可采用以下常规方法进行种植：待种苗高4～8cm且具有至少3条长于2cm的根时，进行炼苗驯化，在室温下(25℃左右)放置2～3d后开瓶，然后在自然光下放置2～3d后取出小苗，用温水(30℃左右)洗净根部琼脂，并晾干至根系发白，移栽入营养土中，(泥炭∶珍珠岩∶蛭石＝4∶3∶3的重量比)，于人工气候箱室培养，培养条件：温度20～25℃，湿度85％～90％，光照强度15～25μmol m^-2.s^-1；3～5周后光照强度30～40μmol m^-2.s^-1；2个月后，存活率达到95％以上。

具体实施方式

实施例1：一种温郁金1号的组织培养法，依次进行以下步骤：

1)、将无病斑、无虫瘿且健壮饱满的温郁金1号块根放入生化培养箱进行催芽，直至长成0.5～2.0cm高的小芽；培养条件为：26～28℃暗培养。

2)、割取上述小芽转入纱袋，无菌水流水冲洗1～2小时。

3)、将上述流水冲洗后的小芽经常规消毒后(即0.1％w/v HgCl₂处理6～10分钟后，无菌水冲洗5～8遍，然后用无菌滤纸吸干)，剥取3-5毫米大小的茎尖作为外植体接种到无菌苗培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m^-2.s^-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；

无菌苗培养基为：1/2MS基本培养基+白砂糖25g/l+琼脂7g/l，pH为5.5～6.0。

4)、待上述茎尖长至1.0～2.0cm高时，割取成单株的小苗Ⅰ；将上述小苗Ⅰ接种到不定芽诱导培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m^-2.s^-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；

不定芽诱导培养基为：MS基本培养基+TDZ 0.2mg/l+白砂糖25g/l+琼脂7g/l，pH为5.5～6.0。

5)、待从小苗Ⅰ上诱导出的不定芽Ⅰ长到1.0～3.0cm高时，割取成2～5株丛生的小苗Ⅱ；将上述小苗Ⅱ接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；

增殖培养基为：MS基本培养基+TDZ 0.25mg/l+白砂糖25g/l+琼脂6g/l，pH为5.5～6.0。

6)、待上述小苗Ⅱ长出的不定芽Ⅱ长到3.0～6.0cm时，割取得小苗Ⅲ；将此小苗Ⅲ接种到生根培养基中；培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmol m^-2.s^-1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；

生根培养基为：1/2MS基本培养基+白砂糖17g/l+琼脂7g/l，pH为5.5～6.0。

7)待上述小苗Ⅲ长到高4～8cm且具有至少3条长于2cm的根时，得可出瓶种植的种苗。

依照上述方法，只需45～50天即可获得试管苗；因此采用本发明的方法可以长期得到大量的试管苗。

实施例2、一种温郁金1号的组织培养法，仅对培养基的配方进行如下更改，其余同实施例1：

无菌苗培养基为：1/2MS基本培养基+白砂糖20g/l+琼脂9g/l，pH为5.5～6.0。

不定芽诱导培养基为：MS基本培养基+TDZ 0.05mg/l+白砂糖30g/l+琼脂4g/l，pH为5.5～6.0。

增殖培养基为：MS基本培养基+TDZ 0.45mg/l+白砂糖30g/l+琼脂4g/l，pH为5.5～6.0。

生根培养基为：1/2MS基本培养基+白砂糖15g/l+琼脂10g/l，pH为5.5～6.0。

依照上述方法，只需45～50天即可获得试管苗；因此采用本发明的方法可以长期得到大量的试管苗。

实施例3、一种温郁金1号的组织培养法，仅对培养基的配方进行如下更改，其余同实施例1：

无菌苗培养基为：1/2MS基本培养基+白砂糖30g/l+琼脂4g/l，pH为5.5～6.0。

不定芽诱导培养基为：MS基本培养基+TDZ 0.5mg/l+白砂糖20g/l+琼脂9g/l，pH为5.5～6.0。

增殖培养基为：MS基本培养基+TDZ 0.06mg/l+白砂糖20g/l+琼脂9g/l，pH为5.5～6.0。

生根培养基为：1/2MS基本培养基+白砂糖20g/l+琼脂4g/l，pH为5.5～6.0。

依照上述方法，只需45～50天即可获得试管苗；因此采用本发明的方法可以长期得到大量的试管苗。

综上所述，本发明的温郁金1号的组织培养法具有如下特点：1、繁殖系数高(5-8倍)，增值周期短(14-20天)；2、增值阶段不诱导根原基发育，不定芽的增殖一致性好。3、激素TDZ的成本降低50倍左右，且种苗质量好，移栽成活率高达95％以上。

对比例：将温郁金1号块根改成按照现有的温郁金脱毒组织培养技术研究(汪洪，2009，药物生物技术)进行培养，然后进行相同的移栽种植，结果为：不定芽的繁殖系数低，仅为2-4倍，增值周期长，约为4周；而且在不定芽增殖过程中，根原基被诱导，发育成大量根系，不定芽和不定根的同时生长不仅严重影响了增殖效率，而且使不定芽的继代分割不易操作，最终导致种苗质量下降，移栽成活率低，仅达85％。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。