一种鉴定奶牛乳房炎抗性相关的分子标记检测试剂盒

摘要

本发明属于检测试剂盒领域，具体涉及一种奶牛早期乳房炎抗性筛选的分子鉴定试剂盒。该试剂盒包括特异性引物和PCR-SSCP试剂，所说的特异性引物序列如SEQIDNO.1和2所示。本试剂盒可用于奶牛乳房炎抗性的早期筛选，经600余头奶牛的初步试用，奶牛基因型与SCS水平吻合率高达86%以上，检测快，成本低。

说明书

技术领域

本发明属于检测试剂盒领域，具体涉及一种奶牛早期乳房炎抗性筛选的分子鉴定试剂盒。

背景技术

乳房炎是奶牛最常见的疾病之一, 在世界范围内造成了巨大的经济损失。研究者正试图通过遗传育种和生物技术手段来预防和控制乳房炎。奶牛乳房炎表型性状主要有临床乳房炎（Clinical Mastitis， CM）、体细胞评分(Somatic Cell Score，SCS) 和 奶的导电率(Milk Conductivity，MC) 等。本研究通过聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术，对IL8基因的突变位点产生的不同基因型与奶牛奶牛群改良计划（DHI）数据进行分析，筛选出对奶牛乳房炎有抗性的个体。

发明内容

为解决当前奶牛乳房炎抗性早期筛选的难题，本分子检测试剂盒依据分子遗传学研究结果，针对IL8基因特异性突变位点，设计了特异性引物，采用PCR-SSCP技术对样品进行检测与基因型鉴定。

本发明所说的鉴定奶牛乳房炎抗性相关的分子标记检测试剂盒，包括一对特异性引物和PCR-SSCP试剂，所说的特异性引物是：

F: 5’- ACTTGTGTGGGTCTGGTGTAG -3’（SEQ ID NO.1）, 

R:5’- AAACCAAGGCGCAGTTCAACAGGCACT -3’（ SEQ ID NO.2）。

本分子标记试剂盒包含已设计合成的1对特异性引物，以及与PCR-SSCP技术相关所有试剂。操作时采用PCR-SSCP技术， 根据相应的反应条件对采集样品的DNA进行检测，利用PCR-SSCP的不同带型进行基因型鉴定。根据既定的基因型与SCS的显著相关性来预测样品牛的乳房炎抗性状况。KK基因型作为本研究的乳房炎抗性基因型。如果考虑选育乳房炎抗性牛群，应选留KK基因型。

本试剂盒可用于奶牛乳房炎抗性的早期筛选，经600余头奶牛的初步试用，奶牛基因型与SCS水平吻合率高达86%以上。自血样送检起2日内可获得结果，每10份样品检测成本仅需200元，若大批量检测，成本更低。推广后可以减少因乳房炎引起的经济损失1500元/头以上，有着巨大的市场推广价值。

附图说明

图1 IL8基因的扩增片段的SSCP电泳图谱。

图2  突变位点的测序结果。

具体实施方式

本分子检测试剂盒包含有已设计合成的1对特异性引物（F: 5’- ACTTGTGTGGGTCTGGTGT

AG -3’, R:5’- AAACCAAGGCGCAGTTCAACAGGCACT -3’，以及PCR-SSCP相关所有试剂（缓冲液，dNTP，Taq DNA 聚合酶，DNA样品，纯净水，琼脂糖，去离子甲酰胺、EDTA(pH 8.0)、二甲苯青、溴酚蓝，丙烯酰胺，甲叉）。

实验者可以根据以下调试好的反应条件进行实验，并观察判定结果。PCR扩增体系为：20 μL: 10×buffer 2.0 μL, 25 mmol/L Mg²⁺ 1.5 μL、dNTP (10 mmol/L) 0.5 μL、Taq DNA 聚合酶(5 U/ μL) 0.3 μL,上下游引物各(10 pmol /μL)1.0 μL, 模板DNA(100 ng/μL)1.0 μL、ddH₂O 12.7 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s, 56 ℃复性40 s, 72 ℃延伸10 min，30个循环; 最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶（含0.05%EB）电泳0.5 h后，紫外灯下观察结果，并拍照。取PCR扩增产物2 μL于一灭菌离心管中,加入10 μL变性上样缓冲液(95%去离子甲酰胺、10 mmol/L EDTA(pH 8.0)、0.25%二甲苯青FF、0.25%溴酚蓝)。98 ℃变性10 min 后,立即冰浴10 min以上，直至上样时取出。电泳采用10%的Acr/bis溶液为29∶1的聚丙烯酰胺凝胶，120 V过夜。）电泳结束后凝胶银染，并观察判定结果。共检测到3种基因型，分别命名为KK、KA和AA型（图1），分别选取不同带型个体的PCR产物测序，根据PCR产物的测序结果与GenBank公布的牛的IL8基因（NC_007304 ）序列比对分析（图2）。

实施例一

通过对610余头奶牛的跟踪调查， 对3878条DHI数据进行相关分析（表1）。我们发现，KK基因型比例显著小于KA、AA基因型。奶牛基因型与SCS水平吻合率达90%左右。对于不同基因型奶牛个体DHI数据的SCS进行统计分析，奶牛SCS小于4.228的KK基因型个体总数达到93%，其他两种基因型吻合率分别达到86%和89%。