产生抗AMP-18单克隆抗体杂交瘤、抗AMP-18单克隆抗体及其在胃癌检测中的应用

摘要

本发明旨在制备一种抗胃窦粘膜分泌蛋白(antrum mucosalprotein-18，AMP-18)的单克隆抗体杂交瘤，及其在制备肿瘤临床检测试剂中的应用。具体而言，本发明通过分子克隆和单克隆抗体技术，筛选了一株可分泌特异识别AMP-18的单克隆抗体的杂交瘤细胞，70110-4。由70110-4所分泌的单克隆抗体可用于人体胃组织中癌病变的临床检测。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫化学、肿瘤生物学和细胞生物学领域。具体而言，本发明的目的在于制备一种与人体胃正常粘膜所分泌的天然胃窦粘膜分泌蛋白-AMP-18(Antrum mucosal protein-18)，相结合的单克隆抗体的杂交瘤；由该杂交瘤产生的抗AMP-18单克隆抗体及其相应产品可应用于人胃癌的诊断试剂或相关领域。

技术背景

胃癌是严重危害人群健康最常见的肿瘤之一。其发病率和致死率仅列于肺癌之后，位居癌症死因的次位。目前，世界上治疗肿瘤的主要方法是手术、放疗、化疗和生物治疗等四种。从医学角度看，至今肿瘤的治疗没有一种完全有效的手段，尤其是已经发生转移的肿瘤患者，传统的治疗方法无法控制肿瘤的全身扩散。研究证实，肿瘤直径与手术后5年生存率密切相关，肿瘤直径＜2cm，5年生存率100％，肿瘤直径每增加1cm，5年生存率下降20％。所以早期诊断，甚至在原位癌阶段诊断对于提高癌症治愈率极具重要意义。

随着分子生物学的发展，肿瘤标志物得到了广泛的重视和应用。它的出现，使人们对肿瘤的早期诊断寄予了极大的希望。肿瘤标志物(tumormarker，TM)是指在肿瘤的发生和发展过程中，由肿瘤细胞本身或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的与正常机体显著不同的一类物质，它们既可能是蛋白质或核酸分子，也可以是糖类或脂类分子。肿瘤患者血液或体液中肿瘤标志物的检测，对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、病情监测以及预后的评价具有较高应用价值。

AMP-18是一个新近发现的由胃腺体上皮细胞合成的自分泌蛋白质，分子量约为18kDa。该蛋白专一地表达于胃粘膜，而在人体其他组织中没有或极低表达。根据本实验室的前期研究和其他文献报道，我们发现AMP-18与胃癌的发生和发展有密切关系，其主要特征为，1)AMP-18的表达程度与胃粘膜上皮细胞分化正相关，即分化较低时，AMP-18的表达量很低，甚至不可检，反之，当细胞分化程度较高时，AMP-18的表达水平接近于正常；2)AMP-18在肿瘤细胞或肿瘤组织中表达下调或缺失，而在正常组织中呈高表达；3)胃幽门螺旋杆菌感染是导致胃癌的重要原因之一，而AMP-18的表达量与患者体内的幽门螺旋杆菌量呈正相关；4)AMP-18的表达与胃癌病人的预后正相关。综上所述，AMP-18可以作为分子标志物应用于胃癌的临床诊断和预后疗效的评估。由于AMP-18的高分泌特征，在正常的胃组织粘膜层可以检测到它的存在；但是，在胃癌发生的区域，AMP-18随着癌症的进程而显著下降，因此，一种高特异性和灵敏度的AMP-18抗体是生产临床诊断试剂所必需的。

本发明通过原核表达该蛋白，免疫Balb/c小鼠并经过融合、克隆筛选、制备腹水、亲和层析技术纯化腹水获得了鼠源单克隆抗体。免疫组化实验检测胃癌配对组织中的表达的实验可见AMP-18在正常组织中高表达，但在胃癌组织中低表达或不表达。免疫印迹实验检测八对胃癌组织中及六种胃癌细胞系中AMP-18的表达情况的实验显示：在所有的八对胃癌和癌旁组织中，AMP-18在正常组织中全部高表达，在肿瘤组织中基本不表达。另外，我们仅能在正常胃黏膜细胞系GES中检测到AMP-18的表达，而在6种胃癌细胞系中MP-18的表达均为阴性。免疫荧光定位外源AMP-18的实验显示：AMP-18是细胞的一个自分泌蛋白质，这就意味着AMP-18可以分泌入血，及可能在胃组织粘膜或血清中检测到AMP-18的存在。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种能专一性针对AMP-18的单克隆抗体杂交瘤及其制备方法，以及这种抗AMP-18单克隆抗体杂交瘤分泌的抗体在肿瘤检测中的用途；提供一种特异性好的单克隆抗体的方法，该抗体的亚类为IgG2a，能特异结合AMP-18重组抗原和天然抗原；提供一种可以用于实验室或临床诊断肿瘤组织AMP-18表达水平的免疫诊断试剂或检测试剂。

为实现以上发明目的所采用的技术手段，本发明人通过原核表达该蛋白，免疫Balb/c小鼠并经过融合、克隆筛选、制备腹水、亲和层析技术纯化腹水获得了鼠源单克隆抗体。免疫组化实验检测胃癌配对组织中的表达的实验可见AMP-18在正常组织中高表达，但在胃癌组织中低表达或不表达。免疫印迹实验检测八对胃癌组织中及六种胃癌细胞系中AMP-18的表达情况的实验显示：在所有的八对胃癌和癌旁组织中，AMP-18在正常组织中全部高表达，在肿瘤组织中基本不表达。且在正常胃黏膜细胞系GES中有AMP-18的阳性表达，而在6种胃癌细胞系中MP-18的表达均为阴性。免疫荧光定位外源AMP-18的实验显示：AMP-18是细胞的一个自分泌蛋白质，这就意味着AMP-18可以分泌入血，及可能在胃组织粘膜或血清中检测到AMP-18的存在。

本发明的主要内容如下：

一)本发明杂交瘤(70110-4，保藏号为CGMCC 2839)分泌产生的单克隆抗体，为小鼠IgG2a亚型单克隆抗体。该抗体不仅与重组的AMP-18抗原具有特异性和敏感性，而且与胃组织和细胞中的AMP-18有极强的特异性和敏感性。

二)本发明中杂交瘤(70110-4，保藏号为CGMCC 2839)产生的单克隆抗体可应用于免疫印迹，免疫荧光和免疫组化等免疫学实验技术中。而且，以本发明中的70110-4单克隆抗体为主体制作的胃癌标志物诊断试剂将对胃癌的早期诊断和治疗监测有较好的应用前景。

三)本发明中杂交瘤(70110-4，保藏号为CGMCC 2839)分泌的单克隆抗体可应用于研究亚细胞定位，蛋白相互作用等信号通路的科学研究中。

附图说明

图1表示采用本发明的单克隆抗体进行免疫组化实验检测胃癌配对组织中的表达的实验结果。具体可见AMP-18在正常组织中高表达，但在胃癌组织中低表达或不表达。

图2表示本发明单克隆抗体进行免疫印迹实验检测八对胃癌组织中及六种胃癌细胞系中AMP-18的表达情况的实验结果。实验结果可见AMP-18在所有的八对胃癌和癌旁组织的正常组织中高表达，在肿瘤组织中基本不表达。在正常胃黏膜细胞系GES中检测到AMP-18的表达，而在6种胃癌细胞系中MP-18的表达均为阴性。

图3表示本发明中单克隆抗体在进行免疫荧光定位外源AMP-18的实验结果。由实验结果可见大肠杆菌BL21(DE3)中表达的去除了信号肽的AMP-18蛋白质-t-AMP-18只是结合于细胞膜上，AMP-18能够与胃粘膜上皮细胞相结合，是该细胞的一个自分泌蛋白质。

具体实施方式

实施例1：AMP-18抗原的制备

AMP-18抗原是以正常胃组织cDNA为模板，根据AMP-18序列(SEQID No.1)设计特异引物，引物两端连入BamHI和SalI酶切位点

上游引物：5′-TGAAGGATCCAACTATAATATCAACGTC-3′(SEQ ID No.2)

下游引物：5′-AAATGTCGACGTTCTCCACCGTGTCTCC-3′(SEQ ID No.3)

PCR扩增出去除AMP-18信号肽序列的基因(PCR参数：95℃5分钟；95℃30s 55℃30s 72℃60s，共40个循环；72℃后延伸10分钟)经BamHI和SalI双酶切后与pQE30a连接，化学转化感受态细胞JM109，挑取单克隆提取质粒进行测序，验证序列无误。选择测序正确的阳性菌，1mmol/L IPTG诱导表达4小时。诱导以后，收集菌体，经超声破碎后离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果显示表达的产物为非可溶性蛋白。

大量培养细菌后进行诱导表达，提取AMP-18蛋白经Ni-NAT亲和层析柱进行纯化，50mM咪唑洗脱AMP-18蛋白，SDS-PAGE电泳，切取条带进行MALDI-TOF/TOF鉴定，证实表达产物为AMP-18。

实施例2：抗AMP-18杂交瘤的制备

1)免疫

将经Ni-NAT亲和层析纯化得到的AMP-18蛋白，腹部皮下免疫(免疫前眼眶取20μL血清做阴性对照)4-6周龄雌性Balb/c小鼠；剂量为每只小鼠60μg蛋白+生理盐水至200μL+CFA200μL。每14天皮下加强免疫一次，剂量为每只小鼠30μg蛋白+生理盐水至200μL+IFA200μL。第3次加强免疫后7天眼眶取血测效价，达要求者冲击免疫，50μg蛋白+生理盐水至100μL；尾静脉注射，待3天后融合。

2)融合

将新鲜切下的小鼠脾脏放到细胞筛上碾碎过滤，与sp2/0细胞按1：5的比例混合，1500转/分钟离心5分钟。将装有离心好的、且混匀的细胞的离心管放入37℃温水浴中，边搅动细胞边缓慢加入1mL PEG1500。在水浴中静置1分钟。缓慢加入10mL的无血清的IMDM(Sigma，H0262-10VL)1000转/分钟离心5分钟。弃上清，加入10mL的血清小心的将细胞吹打起来，并加入胸腺细胞及25mL半固体培养基，充分混匀，均匀倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃，5％CO₂孵箱中培养。

3)挑克隆

融合后7-10天，观察克隆细胞团大小密度适中。在解剖镜下，吸取圆、实、大克隆团于预先准备好培养基(含饲养细胞和1％HT液体)的96孔板中。放入37℃，5％CO₂细胞培养箱。

4)筛选

a.一筛：挑克隆后3天左右，观察细胞量大约占底面积2/3时，取100μL上清ELISA筛选。阳性克隆进行换液，添加200μL完全培养基(含1％HT液体)。

b.二筛：2天后重复步骤a进行二次筛选。阳性株转入预先准备好培养基(含饲养细胞和1％HT液体)的24孔板。

c.三筛：5天后，用含标签His的其它重组蛋白包板，取100μL上清ELISA筛选。符合要求的克隆转入6孔板或细胞培养瓶扩大培养。

5)细胞冻存

对数生长期细胞占满底面积80％左右即可冻存。收集上清且去除死细胞等杂质，上清存于-20℃。直接将冻存细胞放4℃半小时，然后放-20℃两小时，转-80℃冻存过夜，次日放液氮罐。

实施例3：由保藏号为CGMCC 2839的杂交瘤细胞系制备抗AMP-18单克隆抗体

发明人将杂交瘤(70110-4，保藏日2008年12月30日，保藏号为CGMCC 2839，保藏地：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC)用于制备鼠抗AMP-18单克隆抗体，具体操作步骤如下：

1)细胞复苏

从-80℃冰箱或液氮罐中迅速取出冻存管；迅速放入37℃水浴锅中快速搅动，使冻存液在2分钟内全部融化成液体。往15mL离心管中加入3mL血清培养基，将冻存液吸入离心管，1500转/分钟，离心5分钟。弃上清，用完全培养基悬起细胞，培养于6孔板(3mL)或瓶(5mL)中。

2)腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起；计数大约5×10⁵/1mL。悬浮的细胞腹腔注射小鼠。一般7-10天后便可收集腹水。第一次可收集3mL左右，每隔2、3天可重复取，最终可收集8mL/只。每次取出的腹水4000转/分钟，离心10分钟；中间为腹水。小心吸出腹水收集于离心管中，4℃保存。

3)单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF(GE Healthcare，17-5079-01)亲和层析柱纯化单克隆抗体。

将腹水在4℃条件下，10000转/分钟离心10分钟，去除脂类物质。离心后吸取上清，并用偶联缓冲液以1∶3(腹水∶偶联液)稀释，用0.45μm膜过滤。滤液上样到偶联缓冲液平衡过的层析柱。用偶联缓冲液洗过柱子后，用洗脱缓冲液洗脱抗体，收集于事先装有中和液的收集管中。

实施例4：ELISA法鉴定单克隆抗体亚类

1)实验操作

用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG至0.5μg/mL，每孔加100μL，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBST)洗3次，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1小时。倾空液体，用PBST清洗3次。每孔加入0.1mL杂交瘤上清，37℃孵育1小时。倾空液体用PBST清洗3次。用封闭液1∶1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ，λ)抗体或1∶2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体0.1mL每孔，分别加入适当的孔中，37℃用孵育1小时。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μL底物溶液，10-20分钟内测405nm波长下的OD值。

2)实验结果

实验结果显示，本发明单克隆抗体为IgG2a型鼠源单克隆抗体。实施例5：ELISA法测定单克隆抗体亲和常数

1)实验步骤：

包被免疫用重组AMP-18，包被浓度为2μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜，1×PBST洗3次。每孔加200μL封闭液37℃封闭2小时，1×PBST洗3次。抗AMP-18单克隆抗体，从1∶200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1小时，1×PBST洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1∶20000稀释，每孔100μL，37℃孵育1小时，1×PBST洗3次。显色液100μL/孔显色10分钟，50μL/孔终止液终止反应。用酶标仪测定吸光值。

2)数据分析：找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。

(A为B_max/2时的抗体稀释倍数)

150000为单个IgG抗体平均分子量值，抗体原始浓度单位为mg/mL。

3)结果：本发明单克隆抗体的亲和常数为1.08×10⁹。

实施例6：本发明的抗AMP-18单克隆抗体的用途验证-免疫组化(IHC)

1)材料来源：

本发明具体实施方式所用胃癌组织标本来源于北京大学临床肿瘤学院组织标本库，共包括胃癌及对应的癌旁正常组织样本。样本取材是经手术切除的新鲜胃癌组织与其对应的癌旁组织经生理盐水洗涤后，放入液氮保存。标本均经病理证实，并有患者知情同意书。

2)实验步骤：

烤片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。0.3％H₂O₂甲醇室温10分钟，然后PBS洗3次×5分钟；5％脱脂奶粉，37℃封闭2小时；抗AMP-18单克隆抗体(1∶2000稀释)，湿盒孵育4℃过夜；滴加羊抗鼠二抗(中杉金桥，PV-6002)，室温孵育30分钟；DAB-H₂O₂(中杉金桥，ZLI-9031)显色，镜下控制3-5分钟，PBS漂洗，终止显色；苏木素(中杉金桥，ZLI-9040)复染45秒，然后1％盐酸酒精分化；自来水冲洗反蓝；95％和100％乙醇脱水各5分钟，二甲苯透明，中性树胶封片。

3)实验结果(图1)：

对免疫组化实验结果进行统计分析表明，AMP-18在36例正常胃组织中全部强阳性表达(+++)，且仅在9例胃癌组织中弱阳性表达(+)，余下27例组织中全部为阴性结果(-)。p值小于0.01。因此，组织芯片的实验结果也完全支持蛋白质组分析的结论，即AMP-18在正常组织中高表达，但在胃癌组织中低表达或不表达。

实施例7：本发明的抗AMP-18单克隆抗体的用途验证-免疫印迹法(WB)

本发明人进一步应用免疫印迹法WB测定AMP-18在胃癌组织和6种胃癌细胞系中的蛋白表达。

1)实验步骤：

胃癌组织和6种胃癌细胞系中的蛋白30μg样本上样于12％SDSPAGE胶；电泳结束后，将胶在1×转移液中浸泡10分钟；PVDF膜甲醇处理后350mA，转膜70分钟；将膜置于含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中37℃封闭1小时；抗AMP-18单克隆抗体(1∶1000稀释)37℃孵育1小时或者4℃孵育过夜；相应羊抗鼠二抗(中杉金桥，1∶2500稀释)室温孵育1小时；用ImageQuant ECL仪器曝光。

2)实验结果(图2)：

在所有的八对胃癌和癌旁组织中，AMP-18正常组织中全部高表达，在肿瘤组织中基本不表达。当以正常组织中AMP-18的表达作为阳性对照时，6种胃癌细胞系中均无AMP-18的表达。

实施例8：本发明的抗AMP-18单克隆抗体的用途的验证-免疫荧光(IF)

为了模拟AMP-18的分泌后状态，本发明人构建了大肠杆菌表达系统，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了去除信号肽的AMP-18蛋白质--t-AMP-18。本发明人采用免疫荧光技术来检测t-AMP-18的细胞定位。

1)实验步骤：

将t-AMP-18与BGC-823共培养；3.7％甲醛固定15分钟；0.2％TritonX-100打孔5分钟；含1％BSA的PBS溶液封闭1小时；加特异抗AMP-18单克隆抗体(1∶100稀释)暗盒中孵育2小时；FITC标记的羊抗鼠二抗(中杉金桥，1∶200稀释)暗盒中孵育1小时；0.25μg/μLDAPI溶液染细胞4分钟；将盖玻片取出盖在滴有10μL抗荧光衰减封片剂的载玻片上，指甲油封片后，在激光扫描共聚焦显微镜下观察。

2)实验结果(图3)：

t-AMP-18只是结合于细胞膜上。这样运用获得结论，AMP-18能够与胃粘膜上皮细胞相结合，是该细胞的一个自分泌蛋白质。这就意味着AMP-18可以被分泌入血，因此可以在血清中检测到AMP-18的存在，这为AMP-18的检测提供了方便。具体地说，由于AMP-18是一个很好的肿瘤标志物，它具有其他肿瘤标志物没有的优点，临床上可用ELISA的方法检测血清中AMP-18的含量。因此，本发明提供的单克隆抗体用于制备临床上检测血清中AMP-18肿瘤标志物的诊断试剂及试剂盒有极高的应用前景。

序列表

<110>北京华大蛋白质研发中心有限公司

<120>产生抗AMP-18单克隆抗体的杂交瘤、抗AMP-18单克隆抗体及其在肿瘤检测中的应用

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>165

<212>PRT

<213>AMP-18蛋白序列

<400>1

Asn Tyr Asn Ile Asn Val Asn Asp Asp Asn Asn Asn Ala Gly Ser Gly

1                 5                     10                     15

Gln Gln Ser Val Ser Val Asn Asn Glu His Asn Val Ala Asn Val Asp

             20                     25                     30

Asn Asn Asn Gly Trp Asp Ser Trp Asn Ser Ile Trp Asp Tyr Gly Asn

        35                     40                     45

Gly Phe Ala Ala Thr Arg Leu Phe Gln Lys Lys Thr Cys Ile Val His

    50                     55                     60

Lys Met Asn Lys Glu Val Met Pro Ser Ile Gln Ser Leu Asp Ala Leu

65                     70                     75                     80

Val Lys Glu Lys Lys Leu Gln Gly Lys Gly Pro Gly Gly Pro Pro Pro

                  85                     90                     95

Lys Gly Leu Met Tyr Ser Val Asn Pro Asn Lys Val Asp Asp Leu Ser

            100                    105                    110

Lys Phe Gly Lys Asn Ile Ala Asn Met Cys Arg Gly Ile Pro Thr Tyr

         115                    120                    125

Met Ala Glu Glu Met Gln Glu Ala Ser Leu Phe Phe Tyr Ser Gly Thr

    130                    135                    140

Cys Tyr Thr Thr Ser Val Leu Trp Ile Val Asp Ile Ser Phe Cys Gly

145                    150                    155                    160

Asp ThrVal Glu Asn

                165

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>上游引物

<400>2

tgaaggatcc aactataata tcaacgtc    28

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>下游引物

<400>3

aaatgtcgac gttctccacc gtgtctcc                                                 28