一种细菌Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型整合子基因的PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种细菌I型、II型、III型整合子基因的PCR检测方法。由于本发明采用的引物来自细菌整合子基因中高度保守的整合酶区域，采用该引物对能准确、快速、方便的判别细菌是否含有整合子，并能区分是I型、II型、III型整合子，建立了一种多重PCR检测I型、II型、III型整合子的方法。通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测I型、II型、III型整合子的方法。为筛选整合子类型及细菌耐药基因盒的分析，大规模的进行细菌耐药性的分子流行病学调查研究提供一种简便、快捷的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌I型、II型、III型整合子基因的PCR检测方法，属于医学分子生物学领域。

背景技术

近年来由于抗生素的广泛应用，尤其是不合理的使用，细菌的耐药问题越来越严重，加上新抗生素的开发需要一个较长的周期，使得未来细菌感染的治疗陷入了一个两难的境地。整合子这一概念是1989年由Stokes H W等首次提出。整合子是一种基因单位，包括位点特异性重组功能的基因决定簇，在整合酶的作用下能捕获外来耐药基因。在整合子中可形成多种耐药基因的组合、排列。整合于整合子上的基因盒可借助整合子的强启动子而得以表达，是近年来发现的细菌耐药性传播的机制之一。

整合子是一种运动性的DNA分子，它的独特结构可捕获和整合外源性基因，并使之转变为功能性基因的表达单位，是通过转座子或接合性质粒将多种耐药基因在细菌中水平传播的一种遗传单位，定位于染色体和具有广泛宿主的质粒或转座子上。整合子存在于许多细菌中，在抗生素发现和应用前即已存在，是细菌的固有结构，并通过捕获外源性基因来增强细菌生存的适应性。在抗生素广泛应用条件下，整合子可捕获耐药基因，具有使耐药性在细菌之间传播的功能，是细菌竞争生存、适应环境的机制之一。

整合子根据其整合酶基因int序列的不同而分类的。整合酶属于酪氨酸整合酶家族，目前发现的整合酶至少有6类，I类～III类整合子的整合酶被命名为IntI～III，但Int 4后的命名有些混乱。

I类整合子在多药耐药的细菌中是最为常见的，它与Tn21转座子家族相关，其整合酶基因编码含有337个氨基酸的整合酶。其结构类似于缺陷型的转座子或转座子残基，5′CS有编码整合酶的基因intI及启动子Pant，部分还有启动子P2，3′CS包括3个开放阅读框(ORF)，即磺胺耐药基因(sulI)，季铵盐化合物及溴乙锭的耐受基因(qacEΔ1)，功能不明的ORF5。对于大多数I类整合子而言，5′CS均相似，而3′CS存在不同差异。现已在许多革兰氏阴性菌中分离出I类整合子，包括大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、不动杆菌等[Fluit A C，Schmitz F J.Resistance integrons andsuperintegrons[J].Clin Microbiol Infect，2004，10(4)：272-288.]。

II类整合子以Tn7及其家族为代表，其整合酶基因int II被一个终止密码子中断，是缺陷的int基因，它的产物(整合酶)约有318个氨基酸，与int I的产物有46％的同源性，且3′保守末端包括5个tns基因，协助转座子移动。目前仅见几种基因，如核苷转移酶基因aadAla、甲氧苄啶耐药基因dhfr及链丝霉素耐药基因sat整合于该类整合子上。

III类整合子是近来由Arakawa在耐亚胺培南的黏质沙雷菌的耐药质粒上发现的，其整合酶int3有320个氨基酸，与int I有61％同源性。另外，还在肺炎克雷伯菌、假单胞菌、产碱杆菌等革兰阴性菌中分离出III类整合子。

20世纪90年代末，Mazel D等[Mazel D，Dychinco B，Webb V A，et al.A distinctive classof integron in the Vibrio cholerae genome[J].Science，1998，280：605-608.]在霍乱弧菌基因组中首次发现超级整合子(super integron，SI)。超级整合子结构远大于传统的整合子，能携带数百个基因盒，其整合酶亦有位点特异性重组活性。并有类似59be的结构——霍乱弧菌重复结构(vibrio cholera repetitive sequences，VCRs)，与59be不同的是VCRs具有高度序列保守性。I类整合酶能介导超整合子的基因盒在整合子中插入或切除，提示超级整合子可能是多重耐药整合子及其基因盒的祖先，并能长期指导宿主基因的进化，除霍乱弧菌外，在梅氏弧菌、费氏弧菌、拟态弧菌等[Rowe-Magnus D A，Guerout AM，Mazel D.Superintegrons[J].Res Microbiol，1999，150：641-651.]细菌的染色体基因组中也发现了超级整合子。

整合子属于可移动基因元件，位于细菌的质粒或染色体上，能整合不同的耐药基因盒，且1个整合子可捕获多个基因盒，因此可表达出对抗菌药的耐药甚至多重耐药性，临床中出现多重耐药的肠杆菌科细菌、假单胞菌属细菌，与整合子对耐药基因的积累是分不开的。迄今为止已发现的基因盒大多为抗菌药耐药基因，包括最初发现的编码氨基糖苷类及氯霉素钝化酶的基因，编码磺胺类、β-内酰胺类耐药性的基因，以及新近发现的编码超广谱β-内酰胺酶及碳青霉烯水解酶的基因盒。这些整合子多见于革兰氏阴性杆菌，以大肠埃希菌、铜绿假单胞菌为多见。此外，还在金黄色葡萄球菌、肠球菌、谷氨酰棒状杆菌等革兰氏阳性菌上也发现了该系统，主要编码对消毒防腐药的抗性，其表达水平似强于革兰氏阴性杆菌。

在临床抗生素耐药分离株中，整合子的出现率为59～75％。且以I型整合子为主。不少细菌携带多个整合子，与不含整合子的菌株相比，携带整合子的细菌趋向于对多种抗生素耐药。Martinez等分析了163株不同的革兰氏阴性杆菌，发现有43％(70/163)的细菌含有I型整合子，与无整合子细菌相比，这些细菌易表现出对氨基糖苷类、喹诺酮类及第三代头孢菌素类药物的耐药性，也易介导多重耐药性。Tosini等分析37株病原性鼠伤寒沙门菌，发现带有3种不同的I型整合子，其中有2种整合子位于同一结合型质粒IncF1上，这3种整合子分别携带了不同的耐药基因盒，包括aad B、catB3、oxa1、aadAla、aacA4、aac1和aadAla，从而介导了对部分氨基糖苷类、青霉素、氯霉素、四环素及萘啶酸不同水平的多重耐药性，且同一血清型细菌中可同时存在多个整合子。Poly M C等[Poly M C，Denis F，Courvalin P，et al.Molecular Characterization of Integrons inAcinetobacter baumannii：Description of a Hybrid Class 2 Integron[J].Antimicrob Agents Chemother.2000，44(10)：2684-2688.]分析20株鲍氏不动杆菌，16株带I型整合子，这些菌株介导了对氨基糖苷类抗生素、氯霉素、利福平、磺胺类药物及部分β-内酰胺类抗生素(包括头孢他啶)的多重耐药性，其中1株同时带I型和II型整合子，1株带有I型和II型的杂交整合子(整合酶为IntI 2，3′CS同I型整合子)，说明整合子新的进化方向。Segal H等[SegalH，Thomas R，Gay Elisha B.Characteraeterization of class I integron resistance gene cassettes and theidentification of a novel IS-like element in Acinetobacter baumannii[J].Plasmid，2003，49(2)：169-178.]分析了32株多药耐药的鲍氏不动杆菌，其中21株携有I型整合子。这些都说明，基因盒对细菌耐药性的水平传播有重要意义，且在抗菌药选择压力下，整合子不断进化，产生新生的耐药形式。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种细菌I型、II型、III型整合子基因的PCR检测方法，通过该方法可快速准确的检测出细菌中是否包含I型、II型或III型整合子，并且指示出包含I型、II型和III型整合子中的哪一种或哪几种。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种细菌I型、II型、III型整合子基因的PCR检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)PCR模板的制备：

(1a)普通肉汤培养基摇瓶培养增菌；

(2a)取5mL步骤(1a)得到的菌液，经普通肉汤培养基摇瓶培养3～6h后，置于无菌1.5mL离心管中，8000rpm离心3min，弃上清，再加入1mL无菌超纯水洗涤1～2次，重复离心一次，弃上清，加入500μL无菌超纯水重悬，沸水煮5min，5000rpm离心，取上清备用；

(2)PCR扩增：

细菌I型、II型、III型整合子基因的上下游引物序列如下：

整合酶基因(int I)F：CCTCCCGCACGATGATC

                 R：TCCACGCATCGTCAGGC

整合酶基因(intII)F：TCATTAATGCGCAAACCTGCACCA

                 R：ACGCACGGATATGCGACAAAAAGGT

整合酶基因(intIII)F：CGGATGTCTGTGCCTGCTTGC

        R：CCACCGGCAGGCGCTCAAC

25μL体系：2×PCR Master Mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；细菌I型、II型、III型整合子基因的上下游引物各1μL；模板2μL；

PCR反应条件：94℃ 3min；然后94℃ 30s，57℃ 45s，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存；

(3)琼脂糖凝胶电泳：

将0.3g琼脂糖和20mL 50×TAE置于锥形瓶中，完全溶解后加入核酸染料GoldView6.0μL，并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取8μL点于已凝固的琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于TAE中电泳1h；

(4)判断结果：

紫外投射仪中观察结果，280bp、384bp和651bp的条带，分别指示I型、II型、III型整合子基因。

有益效果：由于本发明采用的引物来自细菌整合子基因中高度保守的整合酶区域，采用该引物对能准确、快速、方便的判别细菌是否含有整合子，并能区分是I型、II型、III型整合子，建立了一种多重PCR检测I型、II型、III型整合子的方法。通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测I型、II型、III型整合子的方法。为筛选整合子类型及细菌耐药基因盒的分析，大规模的进行细菌耐药性的分子流行病学调查研究提供一种简便、快捷的方法。

附图说明

图1为细菌整合子基因多重PCR检测技术阳性对照图。其中，1为I型整合子阳性；2为II型整合子阳性；3为III型整合子阳性；4为I、III型整合子阳性；5为II、III型整合子阳性；6为I、II、III型整合子阳性；M为DL2000。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

1、引物的涉及

所述三种细菌整合子基因即I型、II型、III型基因上下游引物序列见表1：

表1

其中intI引物对是参考文章[Shaohua Z，David G，Beilei G，etal.Identification ofintegron-mediated antibiotic resistance among Shige Toxin-producing Escherichia coliisolates.Appl Environ Microbiol.2001，67(4)：1558-1564.]，int II和int III的引物对是自行设计的，是通过分析NCBI中公布的int II和int III基因序列，在保守区内用Primer5.0软件设计合成引物，并要求引物与GeneBank数据库中非目的序列无同源性。

2、试剂的配置。

2.1超纯水(ddH₂O)的制备。

购自Takara公司，1mL/管。

2.22×PCP master Mix的制备。

购自南京博尔迪生物科技有限公司，1mL/管。

2.350×TAE电泳缓冲液的制备。

0.5mol/L乙铵四乙酸二钠((EDTA)溶液(pH8.0)配制：

EDTA                18.61g

灭菌双蒸水          80mL

氢氧化钠            调pH至8.0

灭菌双蒸水          加至100mL。

50×T AE电泳缓冲液配制：

三羟甲基氨基甲烷(Tris)    242g

冰乙酸                    57.1mL

0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)  100mL

灭菌双蒸水                加至1000mL。

使用时灭菌双蒸水稀释50倍。

2.4 Glodview核酸染料的制备。

购自上海赛百盛基因技术有限公司，1mL/管。

2.5上样缓冲液的制备。

购自南京博尔迪生物科技有限公司，1mL/管。

2.6引物的制备。

引物由上海英俊合成，2OD/管。

实施例2：检测方法。

(1)PCR模板的制备：

(1a)普通肉汤培养基摇瓶培养增菌，包括动物粪样、组织液、血液或其它体液；

(1b)取5mL经普通肉汤培养基摇瓶培养3～6h的菌液于无菌1.5mL EP管中，8000rpm离心3min，弃上清，再加入1mL无菌超纯水洗涤1～2次，重复离心一次，弃上清，加入500μL无菌超纯水重悬，沸水煮5min，5000rpm离心，取上清备用。

(2)PCR扩增：

25μL体系：2×PCR Master Mix 12.5μL；ddH₂O 4.5μL；I型、II型、III型基因上下游引物各1μL(6条引物，共6μL)；模板2μL；

PCR反应条件：94℃ 3min；然后94℃ 30s，57℃ 45s，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存；

(3)琼脂糖凝胶电泳：

将0.3g琼脂糖和20mL 50×TAE置于锥形瓶中，完全溶解后加入核酸染料GoldView6.0μL，并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取8μL点于已凝固的琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于TAE中电泳1h；

(4)判断结果：

紫外投射仪中观察结果，大小约280bp、380bp和650bp的条带，分别指示I型、II型、III型整合子基因。

实施例3：生物公司测序

将20μL经过纯化的PCR产物送Invitrogen公司进行DNA测序，序列如下：

I型整合子：

cctcccgcacgatgatcgtgccgtgatcgaaatccagatccttgacccgcagttgcaaacctgatcctcaccgcaagcccgttccatac

agaagctgggcgaacaaacgatgctcgccttccagaagaccgaggatgcgaaccacttcatccggggtcagcaccaccggcaagc

gccgccacggccgaggtcttccgatctcctgaagccagggcagatccgtgcacagcaccttgccgtagaagaccagcaaggccgcc

aatgcctgacgatgcgtcca

II型整合子：

tcattaatgcgcaaacctgcaccatacagcagcgtaaaaataacttggttgcgagtatccataacctgcaaaatgcgttgcacttcatttgcagagataacagagggtagccgtctaggcttgcttgcagggatataatcaatatcgcccaacggctgttgtaaaaacctgttgtacaaaaaagctagggcatttaaagcgattttctgcgtgtttatggctacatgtctgctgtttgctaagctggataaaaacagcctgacctcttcactgcccatggtctgaggatgacgttttttgtgaaacagaataaaacgcttaatccagtgcaggtaagttttttcagttttcagcgcataacctttttgtcgcatatccgtgcgt

III型整合子：

cggatgtctgtgcctgcttgcagcaagtgggtggcgaatgagtggcgcagggtgtggacagatacgtgtttggcaatgccagcctgaactaccgctttttttagttgccggttcagtctttcctcaaacaagtggtggcggcgctcaacgccggtttgtgggtccacagacagcttggccgatggaaacacccagaaccaggcccagctctcgcccgccctggggtacttgcgctccagtgcatgaggcagatacacgcctccgcgccccgtggcacggtcctgcccccacacagcgcggacctgaatcagctgcgcccgcaaccgaggtacgagcgccctgggcagcatcaccacgcggtccttgtcgcccttgccgctgcgcacaatgatcgcgtggcggtcgaaatccacatccttgacccgcaggcccagcgcttcgcgcaggcgcaacccactgccgtaaagcagggcggccaacagcgcttcggtgcccgccatgtgcgaaagcaacgtctgaacctcctgcaccgtcagcaccaccggaatccgcttgcgttctggcggccgaccaatctgctgcatccacggcaattccatgcccagcacctgccgatacaagaacaacagcgcgttgagcgcctgccggtgg

将上述测序结果登陆到NCBI中BLAST，结果显示克隆得到的序列分别和I型整合酶(Int I)型、II型整合酶(Int II)、III型整合酶(Int III)相应基因序列的核苷酸序列同源性均超过98％，表明该方法所克隆得到的基因分别是I型、II型、III型整合子基因片段，因此本发明方法具有很好的特异性。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>金陵科技学院

 

<120>一种细菌I型、II型、III型整合子基因的PCR检测方法

 

<130>JIT100329

 

<160>9

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

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<212>DNA

<213>Artificial

 

<220>

<223>int I F

 

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cctcccgcac gatgatc                             17

 

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<212>DNA

<213>Artificial

 

<220>

<223>int I R

 

<400>2

tccacgcatc gtcaggc                             17

 

<210>3

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<212>DNA

<213>Artificial

 

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<223>intII F

 

<400>3

tcattaatgc gcaaacctgc acca      24

 

<210>4

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<212>DNA

<213>Artificial

 

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<223>intII R

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<212>DNA

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<223>intIII F

 

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<212>DNA

<213>Artificial

 

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<223>I型整合子PCR产物

 

<400>7

cctcccgcac gatgatcgtg ccgtgatcga aatccagatc cttgacccgc agttgcaaac     60

ctgatcctca ccgcaagccc gttccataca gaagctgggc gaacaaacga tgctcgcctt    120

ccagaagacc gaggatgcga accacttcat ccggggtcag caccaccggc aagcgccgcc    180

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agaagaccag caaggccgcc aatgcctgac gatgcgtcca                          280

 

<210>8

<211>384

<212>DNA

<213>Artificial

 

<220>

<223>II型整合子PCR产物

 

<400>8

tcattaatgc gcaaacctgc accatacagc agcgtaaaaa taacttggtt gcgagtatcc   60

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cctttttgtc gcatatccgt gcgt                                         384

<210>9

<211>651

<212>DNA

<213>Artificial

 

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<223>III型整合子PCR产物

 

<400>9

cggatgtctg tgcctgcttg cagcaagtgg gtggcgaatg agtggcgcag ggtgtggaca   60

gatacgtgtt tggcaatgcc agcctgaact accgcttttt ttagttgccg gttcagtctt  120

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