一种微量动物细胞基因组DNA模板制备液及相应的DNA模板制备方法

摘要

本发明属于分子生物学领域，公开了一种微量动物细胞基因组DNA模板制备液及相应的DNA模板制备方法。微量动物细胞基因组DNA模板制备液由A液和B液以1:3-10的体积比混合制得，A液为Tris、(NH4)2SO4、MgCl2的混合溶液，三种试剂终浓度分别为0.1-2.0M；所述的B液为Triton和β-琉基乙醇的混合溶液，二种试剂终浓度分别为0.1-2.0%。本发明微量动物细胞基因组DNA模板制备液成本较之现有的基因组DNA提取所需试剂的提取成本大幅降低；由于模板制备过程简单，所制备的基因组DNA模板完整，没有耗损，可确保细胞基因组DNA模板制备的一次性成功。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种微量动物细胞基因组DNA模板制备液及相应的DNA模板制备方法。

背景技术

现有的动物细胞基因组DNA提取方法很多，包括酚氯仿抽提法等，提取过程由于DNA纯化需要洗涤等过程而繁琐，而且由于DNA纯化的得率问题，需要细胞初始样本量较多，因此一般需要抽取动物血样或采动物组织样，对动物造成伤害较大。市场上现有的微量动物细胞基因组DNA提取试剂盒由于需要纯化柱子而价格昂贵，且过程也相对繁琐。

发明内容

本发明目的在于提供针对现有动物细胞基因组DNA提取存在的不足，提供一种微量动物细胞基因组DNA模板制备液及相应的DNA模板制备方法。

一种微量动物细胞基因组DNA模板制备液，该制备液由A液和B液以1:3-10的体积比混合制得，其中所述的A液为Tris、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂的混合溶液，三种试剂终浓度均为0.1-2.0M；所述的B液为Triton和β-琉基乙醇的混合溶液，二种试剂终浓度均为0.1-2.0%。。

相应的DNA模板制备方法，依次包括如下步骤：

(1) 取上述微量动物细胞基因组DNA模板制备液，加入装有微量动物细胞的离心管或PCR管中；

(2) 将装有所述DNA模板制备液和动物细胞的离心管或PCR管95℃保温5分钟，16℃保温5分钟；

(3) 加入蛋白酶K溶液，该蛋白酶K终浓度为1.0-3.0mg/ml；

(4) 55℃保温2小时或以上，95℃保温10分钟，16℃保温5分钟；

(5) 离心取上清，此上清液直接用作PCR的DNA模板。

所述的DNA模板制备方法优选依次包括如下步骤：

(1) 取上述微量动物细胞基因组DNA模板制备液8.8μl，加入装有动物细胞的离心管或PCR管中；

(2) 将装有所述DNA模板制备液和动物细胞的离心管或PCR管95℃保温5分钟，16℃保温5分钟；

(3) 加入浓度为10mg/ml蛋白酶K溶液1.2μl，使该蛋白酶K终浓度为1.2mg/ml，得到总反应体积10 μl；

(4) 55℃保温2小时或以上，95℃保温10分钟，16℃保温5分钟；

(5) 离心取上清，此上清液直接用作PCR的DNA模板。

有益效果：

本发明微量动物细胞基因组DNA模板制备液成本较之现有的动物细胞基因组DNA提取所需试剂成本大幅降低。本发明动物细胞基因组DNA模板制备过程简单，利用所配制的DNA模板制备液直接将动物细胞裂解，释放的DNA无需进行纯化可直接用作常规PCR的DNA模板，避免了常规方法提取基因组DNA的繁琐过程。由于模板制备过程简单，本发明从微量动物细胞制备的基因组DNA模板完整，没有耗损。本发明微量动物细胞基因组DNA的模板制备液及相应的DNA模板制备方法因所需初始动物细胞数量较小，可用于动物毛发毛囊、极微量的动物培养细胞等基因组DNA模板的制备，使大规模动物细胞基因组DNA模板制备成为可能。由于动物毛发等取样简单，较之动物血样或组织样等的取样手段，对动物的伤害更小。

附图说明

图1、实施例3利用本发明制备乳鸽微量羽髓细胞基因组DNA模板及乳鸽雌雄鉴别结果图，

M：Marker DL 2000。

图2、实施例4利用本发明制备牛毛囊细胞基因组DNA模板的PCR鉴定结果图，

M：Marker DL 2000。

图3、实施例5利用本发明制备猪单个卵母细胞周边少量卵丘细胞基因组DNA模板的PCR鉴定结果图，

M：Marker DL 2000, 泳道1、2：基因组DNA扩增片段，泳道3、4：阴性对照。

具体实施方式

实施例1  微量动物细胞基因组DNA模板制备液的配制

A液：Tris、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂三种试剂溶于双蒸水，使其终浓度均为0.1M；

B液：Triton和β-巯基乙醇用双蒸水稀释，使其终浓度均为0.1%；

以双蒸水为溶剂，按常规方法分别配制A液和B液，然后以1:3的比例将A、B两种液体混合均匀，即得动物细胞基因组DNA模板制备液。

实施例2  微量动物细胞基因组DNA模板制备液的配制

A液：Tris、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂三种试剂溶于双蒸水，使其终浓度均为2.0M；

B液：Triton和β-巯基乙醇用双蒸水稀释，使其终浓度均为2.0%；

以双蒸水为溶剂，按常规方法分别配制A液和B液，然后以1:10的比例将A、B两种液体混合均匀，即得动物细胞基因组DNA模板制备液。

实施例3 利用乳鸽微量羽髓细胞制备基因组DNA模板及乳鸽雌雄鉴别

1.1乳鸽羽髓细胞基因组DNA模板制备

拨取7天左右乳鸽新生腹侧羽毛（含少量羽髓）1根，并取1mg左右羽髓于PCR管中；

PCR管中加入实施例1微量动物细胞基因组DNA模板制备液8.8μl；

PCR管置PCR仪中95℃ 5分钟，16℃ 5分钟，55℃ 2小时，95℃ 10分钟，16℃ 5分钟。并在第一个16℃ 5分钟过种中暂停PCR仪，加入1.2 μl蛋白酶K（10mg/ml）；

离心取上清作PCR的DNA模板。

1.2 PCR扩增

反应体系：双蒸水6.05μl、25mM Mg²⁺ 1.0μl、10×Buffer 1.0μl、5mM dNTP 0.4μl、5μM上、下游引物各0.5μl、Taq酶0.05μl、DNA模板0.5μl；上游引物为：SEQ ID NO.1，下游引物为：SEQ ID NO.2。

反应条件：94℃ 2分钟；94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 40秒，35个循环。

1.3 PCR产物条带分型

EB染色，1%琼脂糖凝胶5-10V/cm电泳，成像系统条带分型。雌性鸽为三条条带，长度分别是628bp、420bp和358bp；雄性鸽为二条条带，长度分别为628bp和358bp（见图1）。

实施例4 利用牛毛囊细胞制备基因组DNA模板

1.1种公牛毛囊细胞基因组DNA模板制备

拨取种公牛毛发1根，并取毛囊于PCR管中；

PCR管中加入实施例2微量动物细胞基因组DNA模板制备液8.8μl；

PCR管置PCR仪中95℃ 5分钟，16℃ 5分钟，55℃ 2小时，95℃ 10分钟，16℃ 5分钟。并在第一个16℃ 5分钟过种中暂停PCR仪，加入1.2 μl蛋白酶K（10 mg/ml）；

离心取上清作PCR的DNA模板。

1.2 PCR扩增

反应体系：双蒸水6.05μl、25mM Mg²⁺ 1.0μl、10×Buffer 1.0μl、5mM dNTP 0.4μl、5μM所述的上、下游引物各0.5μl、Taq酶0.05μl、DNA模板0.5μl；上游引物为：SEQ ID NO.3，下游引物为：SEQ ID NO.4。

反应条件：94℃ 2分钟；94℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 40秒，35个循环。

1.3 基因组DNA模板的PCR鉴定

EB染色，1%琼脂糖凝胶5-10V/cm电泳，成像系统鉴定PCR扩增产物条带（见图2）。

实施例5 利用猪单个卵母细胞周边少量卵丘细胞制备基因组DNA模板

1.1 单个卵母细胞周边的少量卵丘细胞基因组DNA模板制备

吸取单个卵母细胞（含少量卵丘细胞），并吹入PCR管中（PBS尽量少）；

PCR管中加入实施例2微量动物细胞基因组DNA模板制备液8.8μl；

PCR管置PCR仪中95℃ 5分钟，16℃ 5分钟，55℃ 2小时，95℃ 10分钟，16℃ 5分钟。并在第一个16℃ 5分钟过种中暂停PCR仪，加入1.2 μl蛋白酶K（10mg/ml）；

离心取上清作PCR的DNA模板。

1.2 PCR扩增

反应体系：双蒸水6.05μl、25mM Mg²⁺ 1.0μl、10×Buffer 1.0μl、5mM dNTP 0.4μl、5μM所述的上、下游引物各0.5μl、Taq酶0.05μl、DNA模板0.5μl；上游引物为：SEQ ID NO.5，下游引物为：SEQ ID NO.6。

反应条件：94℃ 2分钟；94℃ 30秒，59℃ 30秒，72℃ 30秒，35个循环。

1.3 基因组DNA模板的PCR鉴定

EB染色，1%琼脂糖凝胶5-10V/cm电泳，成像系统鉴定PCR扩增产物条带（见图3）。