甜菜素代谢植物酪氨酸酶蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种甜菜素代谢植物酪氨酸酶蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下1)-4)中任一所示的蛋白质：1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；3)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；4)将序列4或序列6或序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有酪氨酸酶活性或氧化多巴活性或氧化酪胺活性或氧化酪胺酸活性的由1)或2)或3)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，将甜菜素代谢植物酪氨酸酶基因转入烟草中，得到酪氨酸酶活性提高的转基因烟草，转基因烟草的粗酶液能够氧化酪氨酸、酪胺和L-多巴。

说明书

技术领域

本发明涉及一种甜菜素代谢植物酪氨酸酶蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

甜菜素(betatains)是一种水溶性的含氮色素，最早是从甜菜根中发现，它是吡啶衍生物，包括甜菜红素(betacyanin)和甜菜黄素(betaxanthin)两种形式。甜菜素存在于植物不同器官里面，在根、果实以及花瓣里面均有报道。甜菜素在大型真菌里面也有发现，2004年，and Christinet报道在伞形毒菌(Amanita)和Hygrocybe中发现了甜菜红素。在植物中，甜菜红素广泛分布于石竹目植物中，在玛瑙果科(Achatocarpaceae)、番杏科(Aizoaceae)、苋科(Amaranthaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、龙树科(Alluaudiaprocera)、浮萍科(Lemnaceae)、紫茉莉科(Nyctaginaceae)、商陆科(Phytolaccaceae)、马齿苋科(Portulacaceae)、闭籽花科(Stegnospermataceae)都有甜菜素的报道，而石竹科(Caryophyllaceae)则含有花青素，但主要分布于藜科、苋科、仙人掌科、商陆科等多种植物中，其中藜科最为人们熟悉的是红柄甜菜、紫菜头；苋科苋属的红苋菜。仙人掌科植物中仙人掌果实，火龙果果皮和果肉，商陆科的商陆浆果，马齿苋的花瓣，鸡冠花等等也均含有丰富的甜菜红色素。

Han等将经典的和新发现的甜菜素代谢途径进行了比较，归纳出甜菜素合成起始于酪氨酸的5条途径和起始于酪氨的4条途径：5条起始于酪氨酸的甜菜素合成途：前两条即为Strack等总结的基本途径，即：甜菜醛氨酸分别同环状多巴和氨基酸及其胺缩合成甜菜红素和甜菜黄素，然后糖基化为甜菜素苷。第三条途径为甜菜醛氨酸与来自于环状多巴直接糖基化得到的环状多巴糖苷缩合直接形成甜菜素苷。2005年，Sasaki等发现在鸡冠花中葡糖基转移酶可以直接催化环状多巴的糖基化得到环状多巴糖苷，提出了不同于经典的甜菜素合成的新的途径。第四条途径为，多巴脱羧得到的多巴胺在酪氨酸酶的作用下生成多巴胺醌，然后自发环化为2-脱羧基环状多巴，甜菜醛氨酸与其缩合形成2-脱羧基甜菜素配基，在经过糖基转移酶的作用得到2-脱羧基甜菜素苷。第五条途径为甜菜醛氨酸直接与起始底物酪氨酸缩合形成酪氨酸甜菜黄素，然后在酪氨酸酶的作用下，形成多巴甜菜黄素和多巴甜菜黄素醌，继而自发得到甜菜素。这个途径是由于Gandía-Herrero等发现酪氨酸酶的单酚活性可以酪氨酸-甜菜黄素和多巴胺-甜菜黄素为底物，继而提出了甜菜素尤其是甜菜黄素合成的新途径。

4条起始于酪胺的甜菜素的合成途径：2001年，Kobayashi等由于红紫色的甜菜花青苷、2-脱羧基甜菜花青苷等的存在，提出了起始于酪胺的甜菜素合成途径。同时这些色素也存黄甜菜的根毛培养体系中和鸡冠花的花序中。酪胺取代酪氨酸为底物起始甜菜素的合成：酪胺被羟基化为多巴胺，多巴胺被酪氨酸酶氧化为多巴胺醌。多巴胺醌转化为2-脱羧基环状多巴，然后与甜菜素基本生色团甜菜醛氨酸缩合生成2-脱羧基甜菜素配基。随后发生的糖基化反应同于起始于酪氨酸的合成途径。2-脱羧基环状多巴和甜菜醛氨酸的缩合反应是产生2-脱羧基甜菜素配基的决定性步骤。同时起始于酪胺的另外一个支路也由Gandía-Herrero等提出，基于酶活动力学鉴定实验，酪氨酸酶可以催化酪胺-甜菜黄素、多巴胺甜菜黄素的氧化已经发现于紫茉莉花(Mirabilisjalapa)，甜菜(Beta vulgaris var.crassa)的橙色的愈伤培养体系和红柄甜菜(Betavulgaris subspecies cycla)，通过HPLC和ESI-MS检测，氧化反应导致了中间产物多巴胺-甜菜黄素醌和最后产物2-脱羧基甜菜素配基的形成。根据以上实验结果得出酪胺可以直接与甜菜醛氨酸缩合得到酪胺-甜菜黄素，然后酪氨酸酶将其羟基化得到多巴胺-甜菜黄素，然后氧化为多巴胺-甜菜黄素醌，经由分子内环化反应得到2-脱羧基甜菜素配基。

酪氨酸酶是甜菜素合成途径中的第一个关键酶，是一种铜蛋白，含有两个Cu²⁺结合位点，分子量一般在40-70kDa之间。酪氨酸酶不但具有单酚氧化酶活性，将酪氨酸羟基化为多巴；同时还具有双酚氧化酶的活性，将多巴氧化成多巴醌。酪氨酸酶是一种质体酶，存在于正常细胞的光合组织(如叶绿体类囊体的囊泡)和非光合组织质体(如马铃薯块茎细胞的造粉体)。酪氨酸酶的活性中心是含有两个含铜离子位点，在催化过程中，这两个铜离子结合位点以3种形态存在，分别是氧化态(Eoxy)、还原态(Emet)和脱氧态(Edeoxy)。由X射线吸收光谱分析，研究表明与酪氨酸酶结合的双核铜离子活性中心与在血蓝蛋白中发现的活性中心非常相似。酪氨酸酶和血蓝蛋白含铜活性中心主要的构象变化基本相同，铜离子位点的几何构型是可变的。血蓝蛋白氧化态结晶学和延伸X射线吸收结构光谱的研究结果表明，Cu-Cu键长约为0.35nm，每个二价铜离子构型为正四棱锥状，受到两个强的赤道面配位原子的调控和一个相对较弱的轴向NHis配基的调控，形成5个配位键，与蛋白上的组氨酸残基上的氮原子形成3个配位键，外源氧分子作为过氧化物与铜离子形成两个配位键占据了铜离子的两个赤道面位置，并可作为两个铜离子之间的桥联配体。所以Eoxy活性中心可以写成Cu(I)-O₂-Cu(I)，但通常更适合用过氧化态Cu(II)-O₂-Cu(II)表示。过氧化物的电子结构对于Eoxy的生物功能很重要。由于受强的σ3受体作用，过氧化物带有较少的负电荷，而π电子受体与过氧化物的σ3轨道上的电子作用，大大的削弱了氧氧键，酪氨酸酶活性中心的双核铜中心结构之容易断裂。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种甜菜素代谢植物酪氨酸酶蛋白及其编码基因。

本发明提供的蛋白质，名称为BvcTyrC或BvcTyrG，来源于红柄甜菜(Betavulgaris subspecies cycla)，是如下1)-4)中任一所示的蛋白质：

1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

3)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

4)将序列4或序列6或序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有酪氨酸酶活性或氧化多巴活性或氧化酪胺活性或氧化酪胺酸活性的由1)或2)或3)衍生的蛋白质。

上述序列4由603个氨基酸组成，序列6由601个氨基酸组成，序列2由604个氨基酸组成。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述蛋白质BvcTyrC或BvcTyrG的编码基因BvcTyrC或BvcTyrG也是本发明保护的范围。

所述编码基因为如下1)-5)中任一所示：

1)序列表中序列3所示的DNA分子；

2)序列表中序列5所示的DNA分子；

3)序列表中序列1所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有90％同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在68℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述序列表中序列3由1812个核苷酸组成，其中编码区为序列3自5’末端第1-1812位核苷酸所示的DNA分子；

上述序列表中序列5由1806个核苷酸组成，其中编码区为序列5自5’末端第1-1806位核苷酸所示的DNA分子；

上述序列表中序列1由2086个核苷酸组成，其中编码区为序列1自5’末端第42-1856位核苷酸所示的DNA分子；

含有所述编码基因的重组载体、转基因细胞系、重组菌或表达盒也是本发明保护的范围。

所述重组载体为将所述编码基因插入载体pBI121的Bam HI和Sac I识别位点间得到的重组载体。

所述重组菌为将所述的重组载体导入宿主菌得到的重组菌，所述宿主菌为农杆菌LBA4404。

扩增所述编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围。所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列7所示，另一条引物序列如序列表中序列8所示。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法为将所述的编码基因导入目的植物得到转基因植物，所述转基因植物的酪氨酸酶活性高于所述目的植物。

所述目的植物为单子叶植物或者双子叶植物，所述双子叶植物优选为烟草；所述酪氨酸酶活性为氧化L-多巴活性和/或氧化酪胺活性和/或氧化酪胺酸活性。

本发明的实验证明，根据本发明克隆得到的甜菜素代谢植物酪氨酸酶基因，转入烟草中，得到酪氨酸酶活性提高的转基因烟草，能够在植物与微生物体内大规模生产高活性的植物性酪氨酸酶，为培育具有高营养价值、低褐变和/或高抗病性的植物新品种和品系提供了基础，转基因烟草的粗酶液能够氧化酪氨酸、酪胺和L-多巴。

附图说明

图1为甜菜素代谢植物红柄甜菜叶片提取的RNA

图2为红柄甜菜酪氨酸酶基因cDNA中间核心片段PCR扩增产物电泳图

图3为红柄甜菜酪氨酸酶基因cDNA 3’-端PCR扩增产物电泳图

图4为红柄甜菜酪氨酸酶基因cDNA 5’-端PCR扩增产物电泳图

图5为红柄甜菜酪氨酸酶基因(BvcTyrC)cDNA片段PCR扩增产物电泳图

图6为红柄甜菜酪氨酸酶基因(BvcTyrG)基因组DNA片段PCR扩增产物电泳图

图7为红柄甜菜酪氨酸酶基因cDNA基因(BvcTyrC)和基因组基因(BvcTyrG)表达盒及植物表达载体pBI121-BvcTyrC和pBI121-BvcTyrG的构建与结构图

图8为转BvcTyrC/BvcTyrG烟草植株的PCR鉴定图

图9为转BvcTyrC/BvcTyrG烟草不同单株与未转基因烟草(对照)株叶片的酪氨酸酶活性的比较---颜色反应(底物：L-DOPA)

图10为转BvcTyrC/BvcTyrG基因烟草不同单株与未转基因烟草(对照)株叶片的酪氨酸酶活性的比较---特异性波长吸光值(底物：L-DOPA)

图11为转BvcTyrC/BvcTyrG烟草不同单株与未转基因烟草(对照)株叶片的酪氨酸酶活性的比较---颜色反应(底物：酪胺)

图12为转BvcTyrC/BvcTyrG烟草不同单株与未转基因烟草(对照)株叶片的酪氨酸酶活性的比较---颜色反应(底物：酪氨酸)

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、BvcTyr基因的获得

一、BvcTyr基因cDNA-Race的获得

1、红柄甜菜(Beta vulgaris subspecies cycla)叶片RNA的提取与检测

将红柄甜菜(Beta vulgaris subspecies cycla)(Kluger F，Stintzing FC andCarle R.Identification of betalains from petioles of differently colored Swisschard(Beta vulgaris L.ssp.cicla[L.]Alef.Cv.Bright Lights)byhighperformance liquid chromatography-electrospray ionization massspectrometry.J.Agric.Food Chem.2004，52：2975-2981.中，公众可从中国农业大学获得。)的种子购自中国农科院蔬菜花卉研究所，温室播种，取成熟叶片作为RNA提取的材料。

RNA提取所用的研钵、药勺、试剂瓶、量筒等与实验材料或试剂有接触的器皿均用铝箔纸包裹，250℃烘烤3h以上，或者在提RNA之前用酒精灼烧。各种枪头、离心管均用0.1％DEPC(Diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙脂)溶液37℃摇床上缓慢震荡浸泡24h，高压灭菌，烘干后备用。

RNase-free water的制备：在ddH₂O中加入0.1％体积的DEPC原液，磁力搅拌器搅拌过夜，高压灭菌后备用。由于DEPC有强诱癌作用，操作时必须小心谨慎，加入DEPC的水应放在通风橱中，避免吸入气体。

红柄甜菜叶片总RNA的提取采用异硫氰酸胍法：

(1)研钵事先洗净高压灭菌后，再用酒精灼烧，冷却后，加入液氮预冷；

(2)将DEPC水处理过的Eppendorf管(1.5mL)摆放到冰上，以次加入600μl D液，12μlβ-巯基乙醇，60μl醋酸钠，水饱和酚600μl。充分颠倒混匀，然后开启管口等待加样；

(3)将红柄甜菜叶片迅速置于含有液氮的研钵中，立即研磨。磨好后取一小钥匙粉末加到以上Eppendorf管中，立即颠倒混匀充分，然后放冰上10min，中间颠倒混匀几次；

(4)向以上各管中加入200μl预冷的氯仿/异戊醇(24∶1)，充分颠倒混匀，冰上静置10min，中间颠倒混匀几次；

(5)4℃，13000r/min离心15min，吸取上清约600μl到新管；

(6)再向吸出的上清中加入200μl预冷的氯仿/异戊醇，充分混匀后，冰浴10min，再13000r/min，4℃15min离心；

(7)吸取上清500μl到新管中，加入预冷的600μl异丙醇，充分混匀后，-20℃1h以上；

(8)在4℃，13000r/min离心10min，倒掉上清，吸干残余，加入1mL-20℃预冷的70％乙醇，将沉淀弹起，倒掉上清，加入1mL-20℃预冷的无水乙醇，将沉淀悬浮5-10min；

(9)倒掉上清，吸干残余，超净台中干燥，加入20-40μl DEPC处理的水溶解，贮存于-80℃。

提取的红柄甜菜叶片总RNA的检测用非变性凝胶电泳方法。总RNA用无RNase的DNase I处理，除去污染的基因组DNA，用1.0％琼脂糖非变性凝胶电泳鉴定，结果见图1。图1中，28S RNA和18S RNA条带清晰。提取的RNA的A₂₆₀/A₂₈₀都介于1.9-2.0之间。将经检测合格并定量的总RNA保存在-80℃冰箱中。

2、红柄甜菜酪氨酸酶cDNA基因的克隆

1、红柄甜菜总RNA的逆转录

1)于冰上将3μl上述获得的总RNA，2μl oligo 18T(“上海生工”合成，0.5μg/μl)和7μl ddH₂O按总体积12μl混匀，瞬时离心收集液体；

2)70℃加热变性5min，置于冰浴中迅速冷却，瞬时离心收集液体；

3)在冰上按顺序加入下列组分：

4)轻轻混匀离心；

5)加入M-MuLV逆转录酶(200U/μl，Promega公司)1μl，补水至25μl；

6)42℃温育1h；

7)70℃加热10min以终止反应，冰上冷却，得到的产物即为总cDNA，保存于-20℃备用。

2、红柄甜菜酪氨酸酶cDNA基因核心片段的克隆

设计用于扩增红柄甜菜酪氨酸酶基因的中间保守片段的一对简并引物ACTYRF和ACTYRR，由上海生工合成，序列为：

ACTYRF：

5’-CAACA(A/G)GC(A/C/G/T)(A/G)A(A/C/G/T)GT(A/C/G/T)CATTG(C/T)GC(C/T)TA(C/T)TG-3’

ACTYRR：

5’-C(A/C/G/T)GC(A/C/G/T)GA(A/C/G)TA(A/G)AA(A/G)(A/T/G)T(A/C/T/G)CCCAT(A/G)TC-3’

以上述获得的总cDNA为模板，按顺序加入以下试剂，建立20μl PCR反应体系：

合计                        20

混合均匀后按下列条件在PE-4700  PCR仪上进行PCR反应：

Stage 1：94℃    5min    1个循环

Stage 2：94℃    30s

         53℃    40s

         72℃    1min    35个循环

Stage 3：72℃    7min    1个循环

Stage 4：4℃      ∞

PCR反应结束后，取4.0μl PCR产物在2.0％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳图如图2。从图2上看到在PCR产物泳道(泳道1)，有一条明亮的大小约为550bp的带。用DNA回收试剂盒(北京鼎国公司)回收纯化扩增的片段，连接到pBS-T(北京天根生化公司产品)克隆载体上，转化大肠杆菌菌株DH5α。从转化的平板上挑选白斑，接种含有氨青霉素(Amp)100mg/L的LB液体培养基，挑取平板上生长的白色菌落，接入含Amp 100mg/L的LB液体培养基中于37℃过夜培养。当菌液浓度达到OD₆₀₀为0.6时，离心收集菌体，按小量碱裂解法提取质粒，用特定限制性酶HindIII和Bam HI双酶切后，用0.7-1.2％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为2900bp的载体带、大约400bp和150bp的目的带(目的带中含有1个Hin dIII或Bam HI识别位点)。将得到上述酶切片段的质粒测序，结果为该质粒为将549bp片段插入pBS-T构成，且549bp片段含有1个Hin dIII识别位点，并且在其5’-端和3’-端具有其扩增引物(ACTYRF和ACTYRR)的序列。推导该片段编码183个氨基酸的肽链。

将该549bp片段的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列在GenBank中进行Blast分析，结果显示这一序列与许多植物的酪氨酸酶酶基因具有同源性，其中与白杨的同源性最高，核苷酸序列的同源性为64.38％，说明该549bp片段为红柄甜菜酪氨酸酶基因的cDNA片段的中间核心片段。

3、红柄甜菜酪氨酸酶cDNA基因3’-端的克隆

红柄甜菜酪氨酸酶cDNA基因3’-端的克隆采用通用的3’-RACE方法，按照3’-RACE试剂盒(Invitrogen公司产品)的说明进行。

1)、所用引物如下：

UPM：

长引物(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)，和短引物(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)，按照1∶5(即44μM∶20μM)的比例混合，取20μl混合引物加到80μl ddH₂O中，即得到最终的UPM。

NUP：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′

3′-CDS primer：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)VN-3′

(V＝A，C，G or T；N＝A，G or C)，

红柄甜菜酪氨酸酶基因核心cDNA片段下游5’-端(Forward)引物(由上海生工合成)：

Bvctyr3race：5’-GAATTCTTCCTAGGCGCATCTTACCGAGCT-3’

2)3′-Race mRNA的逆转录

(1)于冰上将3μl红柄甜菜叶片总RNA，2μl 3′-CDS primer和7μl ddH₂O按总体积12μl混匀，瞬时离心收集液体；

(2)70℃加热变性5min，置于冰浴中迅速冷却，瞬时离心收集液体；

(3)在冰上按顺序加入下列组分：

(4)轻轻混匀离心；

(5)加入M-MuLV逆转录酶(200U/μl)1μl，补水至25μl；

(6)42℃温育1h；

(7)70℃加热10min以终止反应，冰上冷却。产物保存于-20℃备用。

3)PCR扩增

以总cDNA为模板，按顺序加入以下试剂，建立20μl PCR反应体系：

合计                        20

混合均匀后按下列条件进行反应：

Stage 1：94℃    5min    1个循环

Stage 2：94℃    20s

         68℃    30s

         72℃    3min    35个循环

Stage 3  72℃    7min    1个循环

Stage 4  4℃     ∞

PCR反应完成后，取4.0μl PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，图上可见在1.2kb左右处有一清晰的亮带(图3)。图3中，泳道“M”为DNA大小标记(λDNA/EcoR I+HindIII)，泳道“1”为PCR产物。

将上述大约1.2kb的带回收后连接到pBS-T载体、转化大肠杆菌菌株DH5a，然后提取质粒，用Hin dIII和BamHI双酶切，均能切出除载体带外的1000bp和200bp左右大小的两条特征带(推测可能1.2kb片段内部有这两个酶中的一个酶切位点)，与PCR产物的分子大小相当。将得到上述酶切条带的质粒测序，结果为该质粒为将1158bp的片段插入到pBS-T得到的，该1158bp的片段可编码300个氨基酸，含有一终止密码子(TGA)和一段poly A尾巴，同时该1158bp的片段序列的5_端有126bp的区段与所克隆的“中间核心片段”的3’-端序列完全相同，表明该序列为红柄甜菜酪氨酸酶基因的3’-端序列。

4、红柄甜菜酪氨酸酶cDNA基因5’-端的克隆

红柄甜菜酪氨酸酶cDNA基因5’-端的克隆采用改良的5’-RACE方法，试剂和方法基本参照5’-RACE试剂盒(Invitrogen公司产品)的说明。

1)、所用的引物：

UPM：

长引物(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)和短引物(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)按照1∶5(即44μM∶20μM)的比例混合，取20μl混合引物加到80μl ddH₂O中，即得到最终的UPM。

5’-CDS primer：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)VN-3′

(V＝A，C，G or T；N＝A，G or C)

巢式引物：

Bvctyrgsp1：5’-CTTATGCTTACGTGAGATAT-3’

Bvctyrgsp2：5’-GTTGACTGGATCACCAGCTCGGTAAGAT-3’

Bvctyrgsp3：5’-TTGTCGTTAAACATGGAAGGCATATACAT-3’

2)、5′-Race mRNA的逆转录：

同上述3′-Race mRNA的逆转录，只是用Bvctyrgsp1替代3′-CDS primer，得到5′-Race cDNA溶液。

3)、互补mRNA的降解：

合计                    75.0

混合均匀后加入1.0μl RNase H，30℃保温1h。然后通过回收试剂盒回收纯化5′-Race cDNA。

4)PCR扩增

(1)第一轮PCR扩增

反应液如下：

200μl PCR管中混合以下组分：

合计                    20

混合均匀后按下列条件进行反应：

Stage 1：94℃    5min    1个循环

Stage 2：94℃    30s

         55℃    40s

         72℃    1min    35个循环

Stage 3  72℃    7min    1个循环

Stage 4  4℃     ∞

第一轮PCR反应完成后，进行第二轮PCR扩增。

(2)第二轮PCR扩增

反应液如下：

200μl PCR管中混合以下组分：

合计                20

混合均匀后按下列条件进行反应：

Stage 1：94℃    5min    1个循环

Stage 2：94℃    30s

         55℃    40s

         72℃    1min    35个循环

Stage 3  72℃    7min    1个循环

Stage 4    4℃    ∞

PCR反应完成后，取4.0μl PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳图如图4。从图上可见在800bp左右处有一清晰的亮带。图4中，泳道“M”为DNA大小标记(λDNA/EcoR I+HindIII)，泳道“1”为PCR产物。

将上述800bp左右的带回收后按照在上述方法连接到pBS-T载体、转化大肠杆菌菌株DH5a，然后提取质粒，用Hin dIII和BamHI双酶切，能切出除载体带外的800bp左右大小的目标带，与PCR产物的分子大小相当。将酶切出上述条带的质粒测序，结果为该质粒为将852bp片段插入pBS-T载体得到的，该852bp片段的DNA序列，含有UPM和Bvctyrgsp3引物共75bp、5’端非翻译区41bp和翻译区735bp，推导编码243个氨基酸。852bp片段的序列的3’-端还有一个232bp的区段的碱基序列与上述克隆的“中间核心片段”的5’-端序列完全相同，表明该序列为红柄甜菜酪氨酸酶基因的5’-端序列。

5、红柄甜菜酪氨酸酶cDNA基因中间核心片段与RACE片段的拼接

利用分子生物学软件DNAMAN将上述克隆的红柄甜菜酪氨酸酶cDNA的中间核心片段(549bp)、3’-Race片段(1158bp)和5’-Race片段(852bp)拼接，除去UPM等外加的引物序列后，得到2086bp的红柄甜菜酪氨酸酶基因全长RACE-cDNA，其核苷酸序列见序列表序列1，序列分析为，序列1具有41bp的5’-非翻译区(序列1的自5’末端第1-41位核苷酸)，1815bp的编码区(即CDS区，序列1的自5’末端第42-1856位核苷酸)和230bp的5’-非翻译区加polyA(序列1的自5’末端第1857-2086位核苷酸)，推导编码604个氨基酸的肽链，该肽链的氨基酸序列见序列表序列2。也可人工合成序列1。

二、红柄甜菜酪氨酸酶基因整条cDNA的克隆

根据上述一获得拼接的红柄甜菜酪氨酸酶cDNA基因的编码区(CDS)两端的序列，设计并合成如下两条引物(BvctyrqcF和BvctyrqcR)以扩增红柄甜菜酪氨酸酶整条cDNA基因。为了方便以后的克隆和构建，在两条引物的5’端分别加入了限制性内切酶BglII和Sac I的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)：

BvctyrqcF：

5’-AGATCTATGGCCTCTTTTTCTCCTCCCACAAC-3’(序列表序列7)

BvctyrqcR：

5’-GAGCTCTCAATCTTGAAACTCAATCCTCACAT-3’(序列表序列8)

以上述一获得的红柄甜菜(Beta vulgaris subspecies cycla)总RNA反转录的得到的总cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增的体系如下：

合计                    20

混合均匀后按下列条件进行反应：

Stage 1：94℃    5min    1个循环

Stage 2：94℃    30s

         55℃    40s

         72℃    1min    35个循环

Stage 3  72℃    7min    1个循环

Stage 4  4℃      ∞

PCR反应完成后，取4.0μl PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳图如图5。从图上可见在1800bp左右处有一清晰的亮带。图5中，泳道“M”为DNA大小标记(λDNA/EcoR I+HindIII)，泳道“1”为PCR产物。

回收PCR产物送去测序，该PCR产物的基因具有序列表序列3所示的核苷酸，该基因命名为BvcTyrC，编码区为序列3自5’末端第1-1812位核苷酸。该基因编码的蛋白命名为BvcTyrC，该蛋白的氨基酸序列为序列表序列4所示，序列4由603个氨基酸组成。将该PCR产物回收后连接到pBS-T载体(北京天根生化公司产品)、转化大肠杆菌菌株DH5a，抗性筛选，取阳性克隆，进行液体培养，然后提取质粒，用BglII和Sac I双酶切，能切出除载体带外的1800bp左右大小的目标带，与PCR产物的分子大小相当。将此质粒测序，结果为该质粒为将序列表序列3插入载体pBS-T得到的，将该质粒命名为pBS-BvcTyrC。

三、来源于基因组的红柄甜菜酪氨酸酶基因的克隆

1、基因组DNA的提取

用CTAB法提取步骤一中温室种植的红柄甜菜(Beta vulgaris subspecies cycla)嫩叶的基因组DNA。取1-5μl基因组DNA样品，用紫外分光光度计测量其浓度和纯度(OD260/280＝1.8-2.0)，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性(单一条带，无弥散)。将提取的基因组DNA于-20℃保存。

2、红柄甜菜酪氨酸酶DNA基因的克隆

以步骤1提取的红柄甜菜基因组DNA为模板，进行PCR反应。反应体系为：

合计                    20

混合均匀后按下列条件进行反应：

Stage 1：94℃    5min    1个循环

Stage 2：94℃    30s

         55℃    40s

         72℃    1min    35个循环

Stage 3  72℃    7min    1个循环

Stage 4  4℃     ∞

PCR反应完成后，取4.0μl PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳图如图6。从图上可见在1800bp左右处有一清晰的亮带。图6中，泳道“M”为DNA大小标记(λDNA/EcoR I+HindIII)，泳道“1”为PCR产物。

回收PCR产物送去测序，该PCR产物的基因具有序列表序列5所示的核苷酸，该基因命名为BvcTyrG，编码区为序列5自5’末端第1-1806位核苷酸。该基因编码的蛋白命名为BvcTyrG，该蛋白的氨基酸序列为序列表序列6所示，序列6由601个氨基酸组成。将该PCR产物回收后连接到pBS-T载体(北京天根生化公司产品)、转化大肠杆菌菌株DH5a，然后提取质粒，用Bgl II和Sac I双酶切，能切出除载体带外的1800bp左右大小的目标带，与PCR产物的分子大小相当。将此质粒测序，结果为该质粒为将序列表序列5插入载体pBS-T得到的，将该质粒命名为pBS-BvcTyrG。

四、BvcTyr基因Race-cDNA、cDNA和基因组DNA的核苷酸与氨基酸序列比较分析

将上述步骤一、二和三分别获得的RACE-cDNA、BvcTyrC和BvcTyrG的核苷酸序列与相应推导编码的氨基酸序列用NCBI Blast作同源性比较，结果显示，它们的总核苷酸的同源性(一致性)为84.13％，编码区同源性为96.59％，推倒编码的氨基酸的同源性(一致性)为95.97％。在编码区近5’端，Race-cDNA比BvcTyrC和BvcTyrG多出1个三联密码，从而多编码1个氨基酸(苏氨酸，T，第8位)，推测是做5’-Race时的“插入”所至。

实施例2、转基因烟草植株的获得和功能研究

一、BvcTyr基因表达盒及其植物表达载体的构建

将由实施例1获得的pBS-BvcTyrC用Bgl II+Sac I消化，回收1812bp的小片段，连接到经过Bam HI+Sac I双酶切的双元植物表达载体pBI121(Clontech产品)上，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，抗性筛选，将阳性克隆在Kan 100mg/L的液体LB培养基中培养，提取质粒，用Xba I和Sac I双酶切鉴定，切出1.8kb左右预期大小片段，将该质粒测序，结果为，该质粒为将序列3插入双元植物表达载体pBI121的Bam HI和Sac I识别位点间得到，将该质粒命名为pBI121-BvcTyrC，该质粒的启动子为组成型启动子CaMV 35S。质粒构建图见图7所示。

将由实施例1获得的pBS-BvcTyrG用Bgl II+Sac I消化，回收1806bp的小片段，连接到经过Bam HI+Sac I双酶切的双元植物表达载体pBI121(Clontech产品)上，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，抗性筛选，将阳性克隆在Kan 100mg/L的液体LB培养基中培养，提取质粒，用Xba I和Sac I双酶切鉴定，切出1.8kb左右预期大小片段，将该质粒测序，结果为，该质粒为将序列5插入双元植物表达载体pBI121的Bam HI和Sac I识别位点间得到，将该质粒命名为pBI121-BvcTyrG，该质粒的启动子为组成型启动子CaMV 35S。质粒构建图见图7所示。

将上述pBI121-BvcTyrC和pBI121-BvcTyrG分别转化农杆菌菌株LBA4404(购自美国Life Technology公司)，在含有100mg/LCar和50mg/LKan的YEB液体培养基中培养后，得到的转化子分别提取质粒用Xba I和Sac I双酶切鉴定，酶切均得到预期的1.8kb左右的片段。再分别以酶切鉴定正确的质粒为模板、以引物对BvctyrqcF/BvctyrqcR进行PCR鉴定，均能扩增出预期1.8kb左右的清晰的亮带。将以上两种鉴定确认的两种质粒测序，结果为这两个质粒分别为pBI121-BvcTyrC和pBI121-BvcTyrG，分别含有这两个质粒的转化子分别命名为重组菌LBA4404/pBI121-BvcTyrC和LBA4404/pBI121-BvcTyrG。

二、转基因烟草植株的获得

1、叶盘法共培养侵染

分别挑取携带植物表达载体的重组菌LBA4404/pBI121-BvcTYrC和LBA4404/pBI121-BvcTYrG单菌落，分别接种于5ml含Str 100mg/l和Kan 50mg/L的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。分别取活化过夜的重组菌，分别按1∶50的比例稀释到含Str 100mg/l和Kan 50mg/L的新鲜YEB液体培养基中，继续培养至OD600值大约为0.6-0.8。5000rpm离心5min，收集菌体，用1/2MSO液体培养基(1/2MS矿质营养成分)洗涤菌体一次，并将其稀释到离心前菌液5倍体积的1/2MSO液体培养基中，准备侵染用。

选取大约30天苗龄的烟草NC89(Nicotiana tabacum，品种“NC89”，种子购自中国农业科学院。烟草NC89记载在陈曦，叶肉细胞原生质体再生植株的遗传稳定性，安徽农业科学，1999年第27卷第4期第635-366页，中，公众可从中国农业大学获得。)无菌苗，在无菌条件下，切下成熟叶片，用直径9mm的打孔器取叶圆盘；将取下的叶盘分别投入上述准备侵染用的菌液中，15分钟后，分别取出叶盘，分别置于再生培养基(MS+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+肌醇0.1g/L+蔗糖3％+琼脂粉7g/L，pH 5.8)上于25℃暗培养2天，分别得到共培养的叶盘。

2、转基因烟草的获得

将上述分别得到的共培养叶盘分别接种到含有500mg/L羧苄青霉素(Carb)和50mg/L卡那霉素(Kan)的再生培养基上。侵染叶盘不断膨大，10天后长出绿色愈伤，继代后，抗性愈伤很快分化出小芽，而对照叶盘(未侵染重组菌的叶盘。)则保持原有大小并黄化死亡。当抗性芽长到1-1.5cm时，将其切下，转到含有200mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素的生根培养基(MS+0.5mg/L生长素(IAA)+0.1g/L肌醇+3％蔗糖+7g/L琼脂粉，pH 5.8)上12天左右开始生根，2-3周后分别得到33株T0代转BvcTYrC烟草和35株T0代转BvcTYrG烟草。

3、转基因烟草的分子检测分析

分别提取30株T0代转BvcTYrC烟草和30株T0代转BvcTYrG烟草叶片的基因组DNA，以BvctyrqcF和BvctyrqcR为引物进行PCR扩增，同时以未转基因的受体烟草品种“NC89”(以下均称为“野生型”)为负对照，以pBI121-BvcTYrC为正对照。

PCR产物的电泳图见图8，图8中，M为λDNA(Hin dIII+Eco RI)双切marker；Lane ck1：为质粒pBI121-BvcTYrC(正对照)；Lane ck2，ck3均为野生型烟草(负对照)；Lane 1-5：转BvcTyrC基因烟草；Lane 6-9：转BvcTyrG基因烟草。从图中看出，转基因烟草可以扩增出与载体质粒扩增产物大小一致的目的条带，而未转基因的野生型烟草则在相应位置则没有扩增出此目标片段带。说明，得到27株阳性T0代转BvcTYrC烟草和28株阳性T0代转BvcTYrG烟草

以同样的方法，将空载体pBI121转入烟草中，获得转pBI121烟草，同样进行上述条件的PCR鉴定，转pBI121烟草中未扩增得到目的条带。

三、BvcTyr基因(红柄甜菜酪氨酸酶基因表达盒)在转基因烟草中的功能分析

1、转基因植株的移栽

将上述分子鉴定的阳性T0代转BvcTYrC烟草和阳性T0代转BvcTYrG烟草植株在三角瓶中开口炼苗一周，移入花盆，在温室中培养，第一周套袋保湿(湿度＞90％)，之后去袋并进行常规管理，得到移栽成功的T0代转BvcTYrC烟草和T0代转BvcTYrG烟草。

2、转基因植株酪氨酸酶活性的检测

1)酪氨酸酶的粗提

分别取上述1中获得的移栽成功的T0代转BvcTYrC烟草和T0代转BvcTYrG烟草叶片用洗洁剂将其表面的灰尘和污渍清洗干净，晾干，用剪刀剪碎后，分别置液氮预冷的碾钵中加液氮磨成细末。取1g细末转到干净4℃预冷的离心管中，按照1∶2(W∶V)的比例加入4℃预冷的20mM的Tris-HCl(pH 7.0)缓冲溶液，再加入0.01mol/L的聚乙烯毗咯烷酮(PVP)，充分混匀，在冰上放置10min，然后在4℃下以8000rpm离心20min，分别取上清液作为转BvcTYrC烟草的酶粗提液和转BvcTYrG烟草的酶粗提液，备用。以野生型烟草和转pBI121烟草为对照得到对照酶粗提液1和对照酶粗提液2。

2)酪氨酸酶的活性测定

A、酪氨酸酶的活性定性和定量测定主要为：

以L-多巴(L-DOPA，3，4-dihydroxy-L-phenylalanine，购自北京化学试剂公司。)为底物：取2.3mL 20mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液于小试管中，45℃预热3min，加入0.5mL 30mM用ddH₂O溶解的L-多巴(L-DOPA)溶液(冰水中预冷过)，再次预热2min后，加入上述1)获得的转BvcTYrC烟草(管号1、3、5、7、9、11、13和15)的酶粗提液200μl，酶粗提液加入后开始计时，反应2-5min后，观察颜色的变化(定性测定)；

同时在分光光度计(U-2001紫外可见分光光度计，日本日立公司)上A₄₇₅nm处测定吸光值(定量测定)。一个酶活力单位定义为：在测定条件下，每分钟引起吸光度增加0.001所需的酶量。以煮沸10min后的酶液所测吸光值作为空白对照。

以步骤1)获得的野生型烟草的对照酶粗提液1和转pBI121烟草的对照酶粗提液2为阴性对照。采用同样的方法将入上述1)获得的转BvcTYrG烟草(管号2、4、6、8、10、12和14)的酶粗提液进行酶活测定。

实验重复三次，结果取平均值。

以L-多巴为底物的定性测定(颜色的变化)的结果见图9所示，图9中，管号1、3、5、7、9、11、13和15为转BvcTyrC基因烟草的不同单株；管号2、4、6、8、10、12和14为转BvcTyrG基因烟草的不同单株；CK为野生型烟草植株。(管号1、3、5、9、11、13)的转BvcTYrC烟草的酶粗提液和(管号4、8、12)的转BvcTYrG烟草的酶粗提液在加入底物L-多巴后颜色由绿黄变成红褐色(L-多巴在酪氨酸酶的催化下发生氧化反应，形成红色的多巴醌)，而对照酶粗提液1(CK)仍然保持绿黄色。对照酶粗提液2与对照酶粗提液1的结果无显著差异。这表明，外源BvcTYrC和BvcTYrG基因的导入，均明显地提高了烟草的酪氨酸酶的含量或者活性，使其对酚类(以L-多巴为代表)的氧化能力明显增强。

定量测定的结果如图10所示，管号1、3和5为转BvcTyrC基因烟草单株；管号2和4转BvcTyrG基因烟草单株，非转基因植株为野生型烟草。结果显示：以煮沸10min后的酶液所测吸光值作为空白对照(100％)，管号1、3和5为转BvcTyrC基因烟草单株酪氨酸酶相对活性分别为194％、182％、162％，管号2和4转BvcTyrG基因烟草单株酪氨酸酶相对活性分别为169％、198％，野生型烟草相对活性为134％。野生型烟草和转pBI121烟草的结果无显著差异。转BvcTyrC基因烟草单株酪氨酸酶粗提液与转BvcTyrG基因烟草单株酪氨酸酶粗提液相比，平均活性略低(前者为179.3％，后者为183.5％)，但差异不显著。

结果表明，转基因烟草各个单株的酪氨酸酶相对活性在162-198％，都显著地高于野生型烟草(134％)。

B、以酪胺为底物

酪胺(Tyramine，4-Hydroxyphenethylamine，CAS号：51-67-2；购自北京化学试剂公司)为底物：取5mL 20mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液于小试管中，加入1滴(大约为5μl)酪胺，加入200μl上述1)获得的转BvcTYrC烟草(管号d、e、f、g、h、i、j、k、l)的酶粗提液，酶液加入后开始计时，连续24h观察颜色反应。

以步骤1)获得的野生型烟草(管号为a、b、c)的对照酶粗提液1和转pBI121烟草的对照酶粗提液2为阴性对照。

采用同样的方法将入上述1)获得的转BvcTYrG烟草(管号m、n、o、p)的酶粗提液进行酶活测定。

实验重复三次，结果取平均值。

以酪胺为底物的定性测定(颜色的变化)的结果如图11所示，在图11中，a-c是野生型烟草；d、e、f、g、h、i、j、k、l为：转BvcTYrC烟草单株，m、n、o、p转BvcTYrG烟草单株。结果显示：(管号g j k l)的转BvcTYrC烟草粗酶液和(管号m)的转BvcTYrG烟草粗酶液在加入底物后颜色变成稍带红的黑色。野生型烟草(a、b、c)颜色无变化，这表明，外源BvcTYrC和BvcTYrG基因的导入，提高了烟草的酪氨酸酶的含量或者活性，使其对酪胺的氧化能力明显增强。对照酶粗提液2与对照酶粗提液1的结果无显著差异。

C：酪氨酸水溶液为底物：

与B的方法基本相同，唯一不同的是将酪胺替换成酪氨酸水溶液。

实验重复三次，结果取平均值。

以酪氨酸水溶液(L-Tyros ine，4-hydroxyphenylalanine，CAS号：60-18-4，购自北京化学试剂公司产品。)为底物的定性测定(颜色的变化)的结果如图12所示，在图12中，a-c是野生型烟草；d、e、f、g、h、i、j、k、l为：转BvcTYrC烟草单株，m、n、o、p转BvcTYrG烟草单株。结果显示(管号g j k l)的转BvcTYrC烟草粗酶液和(管号m)的转BvcTYrG烟草粗酶液在加入底物后颜色变成稍带红的黑色。野生型烟草(a、b、c)颜色无变化，这表明，外源BvcTYrC和BvcTYrG基因的导入，提高了烟草的酪氨酸酶的含量或者活性，使其对酪氨酸的氧化能力明显增强。对照酶粗提液2与对照酶粗提液1的结果无显著差异。