高浓度的溶液中大分子的可逆缔合的表征方法

摘要

本发明提供一种表征高浓度的大分子溶液的缔合性质的方法。在浓度范围上分布的样品等分试样被顺序地注入光散射光度计。平衡缔合常数和缔合化学计量由散射信号的角度和浓度依赖性的分析导出。热动力学非理想性，其在高浓度下变得重要，在简化形式的分析中被处理，其可应用于多个缔合的物质。

说明书

背景技术

大分子，例如蛋白质、多糖、合成聚合物等，在溶液中进行不同类型的相互作用。这些相互作用中的非特异性的以及排斥的一些相互作用通常被称为“热动力学非理想性(thermodynamic non-ideality)”。一些相互作用——无论是特异还是非特异的——有吸引力，并引起可逆缔合，其中单体和缔合的复合物的浓度分数比达到平衡状态，这取决于溶液中分子的总浓度、分子的特异性质、以及溶剂。可逆缔合状态进而影响溶液的功能。例如，在制药工业中，可逆抗体低聚物的存在可增加溶液粘稠度，其不利地影响包含这些抗体的药物的生产和输送。低聚物形式的抗体药物可呈现增加的免疫原性风险。这种大分子的缔合状态的确定——以平衡缔合常数和缔合的化学计量的形式——在理解和控制潜在的相互作用中是重要步骤。

表征溶液中的非可逆聚集体或高度结合的复合物的标准方法，诸如分子排阻色谱(SEC)、SEC结合多角度静态光散射(SEC-MALS)、或者沉积速度(SV)，不适用于弱可逆缔合，因为这些表征技术导致复合物的稀释、解离，由此从平衡偏离。

用于表征强相互作用可逆缔合的常用方法包括沉积平衡(SE)、等温滴定测热法(ITC)、以及组成梯度多角度静态光散射(CG-MALS)。在SE中，分子的溶液被放置在分析超离心机中，以及在极高的速度下旋转以形成平衡分布，其被记录和分析。分布的具体形状包含自缔合单体和复合物的量以及缔合化学计量的信息。在ITC中，在自缔合的情况下，溶液被相对于溶剂进行滴定，或者在异缔合的情况下，初始仅仅包含一种大分子的溶液被相对于第二大分子进行滴定，以及溶液释放或吸收的热量被测量。该热量测量和对应的滴定曲线的形状，即，热量相比于滴定体积和浓度，包含关于相互作用强度和缔合化学计量的必要信息，尽管通常仅仅一个化学计量可以被表征。在CG-MALS中，一系列稀释液被准备，以及被输送到MALS检测器。散射光强度对浓度的依赖性可以被分析以测定缔合化学计量和平衡缔合常数。由于不要求非常长的沉积平衡的平衡时间，CG-MALS是特别有用的技术。另外，其在测定导致多个低聚状态以及同时的自缔合和异缔合的缔合中优于ITC。当缔合的相互作用强时，溶液通常在低浓度表征。然而，当缔合的相互作用弱时，如通常对于抗体药物配方设计的情况，溶液必须在高浓度下表征，一般在10-100g/L的范围。

在1g/L以上的分子浓度，非特异的，通常是排斥的相互作用变得显著，并将影响SE、ITC和CG-MALS的可逆缔合测量。因此，弱缔合的表征必须经常在分析时必须考虑非特异相互作用的浓度范围中进行。

描述由溶液中进行非特异相互作用的多个物质的静态光散射的理论被称为“起伏理论”，其由Kirkwood和Goldberg在J.Chem.Phys.18，54-59(1950)中描述。稀释条件下的光散射的起伏理论应用到单个非缔合物质是周知的，仅仅涉及三个参数——摩尔质量、均方半径、以及第二维里系数。随着溶液浓度增加，更高阶的维里系数必须被包括，使得分析持续变得困难。Minton在Biophys.J.93，1321-1328(2007)中描述的简化，被称为“有效硬球近似(effective hard sphere approximation)”或EHSA，假设分子之间的非特异相互作用等价于不可穿过的球体的所述作用，其有效半径可以不同于分子的实际半径。在10-150g/L的高浓度下CG-MALS和其他数据的解析中EHSA框架有用，否则其是难处理的。Fernandez和Minton，Biophysical J.96，1992-1998(2009)已经示出起伏理论结合EHSA可以成功地应用于大至70g/L浓度下蛋白质可逆自缔合为一个或两个低聚状态的CG-MALS分析。

尽管起伏/EHSA理论的组合是精确的，但是如果必须应对包括单体和复合物的两种或三种物质则在数学上变得非常复杂。然而，很多重要的系统呈现多个缔合的化学计量，即，同时地在单体和多个复合物之间获得平衡。一个示例是逐步自缔合，形成二聚物、三聚物、四聚物或更高级的低聚物。另一示例是同时自缔合和异缔合。就下面等式1的复杂等式而言，仅仅写出针对这些情况的完整的起伏理论等式将是非常难的，更不要说分析数据。

因此，使用CG-MALS在高浓度下分析大分子的可逆缔合的方法——其采用热动力学非理想性的更易处理的表示但仍准确地测定缔合常数和化学计量——将是有利的。

发明内容

本发明提供一种以非常易处理的形式表示来自高浓度的可逆缔合溶液的CG-MALS数据的方法，适用于复合物多个化学计量的简化分析。

另外，使用本发明的方法提供了利用上述易处理的表示、经CG-MALS测定平衡缔合参数，即高浓度的大分子溶液的缔合复合物的化学计量、平衡缔合常数、以及存在的不强干(无能力的，incompetent)部分的测量。

附图简述

图1是表示可逆自缔合物质溶液的非理想性的方法的流程图；

图2是表示形成可逆复合物的两种组成物质的溶液的非理想性的方法的流程图；以及

图3是用于测定经历可逆缔合的一种或更多种物质的平衡缔合参数的设备的示意图。

发明详述

理论描述

假设入射光是竖直平面偏振的，以及在水平平面中以相对于入射光的方向成θ角度进行观察，对于多组分静态光散射广义起伏理论的结果是：

$\frac{R(c_X,\theta )}{K}=\underset{m,n}{\Sigma }\left\{\frac{{\Psi }_{m,n}\left(\theta \right)c_n{M}_m{Q}_{1,m,n}\left(\theta \right)}{\left|{\psi }_{m,n}\left(\theta \right)\right|}\left(\frac{\mathrm{dn}}{{\mathrm{dc}}_m}\right)\left(\frac{\mathrm{dn}}{{\mathrm{dc}}_n}\right)\right\}---\left(1\right)$

在此，R(c_X，θ)代表在任何散射角度从组成c_X的大分子溶液检测的过量瑞利比，其中X代表各种单体物质，以及c_X代表每个物质的总重量/容积浓度[c₁，c₂，c₃...]；过量瑞利比是溶液瑞利比和纯溶剂瑞利比之间的差；溶液的瑞利比是I是由于入射强度I从散射点距离r_s处观察的每单位立体角的散射光的强度；v是散射量；n₀是溶液的折射率；N_A是阿伏伽德罗数；λ₀是入射光在真空中的波长；m和n代表存在的不同物质，包括自由单体和复合物；c_n是第n个物质的重量浓度，以每单位体积的质量单位计；Q_1，m，n是散射角θ的一些函数，其总体上取决于m和n分子的大小和质量分布，以及随着θ接近零或总大小比小很多，接近值1；其中如果m＝n，则δ_m，n等于1否则等于零，以及γ_n是成分n的热动力学活性，以及Q_2，m，n是θ的一些函数，其总体上取决于m和n分子大小和质量分布，以及随着θ接近零或大小比小很多，接近值1；|ψ_m，n(θ)|是ψ_m，n(θ)行列式；Ψ_m，n(θ)是ψ_m，n(θ)的m，n余因子或子行列式；以及dn/dc_m是第m个物质的差示折射率增量。如果第m个物质是由类型X的i_X单体、类型Y的i_Y单体等组成的杂合物，则dn/dc_m是组分分子的贡献性折射率增量的加权平均。折射增量的加权平均是其中下标X代表不同的组分单体。如果存在超过两个或三个物质，则等式(1)变得非常复杂，因为行列式和子行列式中并入的很多项。

表达式可以被理解为代表大分子物质m和n之间的实质具体相互作用体积V^相互作用/(M_m+M_n)，其导致热动力学非理想性。对的贡献包括硬核排斥以及各种静电和起伏偶极相互作用。在至少中间离子强度的溶液中，长范围相互作用被良好地屏蔽，非理想性由短范围相互作用支配。在此条件下，特定相互作用容积与分子容积的和除以质量和大致成正比，可以被以有效分子密度写出ρ_m：

如果溶液中的各个物质被形成为仅仅一个类型单体的低聚物自缔合以形成i-mers，则可以有理由地期待全部i-mers的有效密度大致是常数ρ，因此独立于m或n。通常被近似为一系列浓度的幂：其中系数A₂和A₃分别被称为具体溶液中的单体的第二和第三维里系数。应用此近似值，等式(1)可以被缩减为科学文献中之前未知的简化形式，其中全部非理想的自相互作用和交叉相互作用被仅仅捕获在两个参数A₂和A₃中：

$\frac{R(c,\theta )}{K}={\left(\frac{\mathrm{dn}}{\mathrm{dc}}\right)}^2\frac{\underset{i}{\Sigma }i{\mathrm{Mc}}_i{P}_i\left(\theta \right)}{1+2A_{2}M\underset{i}{\Sigma }{c}_i{P}_i\left(\theta \right)+3A_{3}M\underset{i}{\Sigma }{c_i}^2}---\left(1\right)$

在此R(c_X，θ)是在方位角度θ和大分子总浓度c观察的过量瑞利比；M是单体的摩尔质量；dn/dc是溶剂中分子的差示折射率增量；i是自缔合的阶数，c_i是i-mer的平衡的重量浓度；是针对i-mer垂直于竖直偏振的入射光的平面内的散射光的角度相关性；θ是相对于光束的传播方向测量的；以及是i-mer的均方半径，其定义为其中r是从分子的质心到分子质量元素m_i的距离，在分子的全部质量元素上积分。等式(2)的有效性可以用相对简单的示例例示为：

·对于两种物质——单体和一个i-mer，

$\left|{\psi }_{m,n}\left(\theta \right)\right|=(1+c_1\frac{\partial \ln {\gamma }_1}{\partial c_1})(1+c_i\frac{\partial \ln {\gamma }_i}{\partial c_i})-c_1{c}_i\frac{\partial \ln {\gamma }_i}{\partial c_1}\frac{\partial \ln {\gamma }_1}{\partial c_i}$

$=1+c_1\frac{\partial \ln {\gamma }_1}{\partial c_1}+c_i\frac{\partial \ln {\gamma }_i}{\partial c_i}+c_1{c}_i(\frac{\partial \ln {\gamma }_1}{\partial c_1}\frac{\partial \ln {\gamma }_i}{\partial c_i}-\frac{\partial \ln {\gamma }_i}{\partial c_1}\frac{\partial \ln {\gamma }_1}{\partial c_i})$

每个项因此，项不仅仅比其他项更高阶，而且是可比的量度的两个量的差，以及因此相比于甚至一个第二阶项应该是小的。随着一个浓度趋向于零，还应该是小的。分母的最终表达式将是类似地，对于任意数量的物质，更高阶的项可以被忽略以产生

·如上所述，可以依照维里系数表达，利用近似法，对于单体和所有低聚物，与逆密度紧密相关的A₂M和A₃M近似是常数：

$\left|{\psi }_{m,n}\left(\theta \right)\right|\approx 1+(2A_2{\mathrm{MP}}_1\left(\theta \right)+3A_3{\mathrm{Mc}}_1+K)c_1+(2A_2{\mathrm{MP}}_i\left(\theta \right)+3A_3{\mathrm{Mc}}_i+K)c_i+K$

$=1+2A_{2}M\underset{i}{\Sigma }{c}_i{P}_i\left(\theta \right)+3A_{3}M\underset{i}{\Sigma }{c}_i^2+K$

·另外，对于两个物质，单体和一个i-mer，使得等式(1)的分子变为：

$[M{c}_1{P}_1\left(\theta \right)(1+c_i\frac{\partial \ln {\gamma }_i}{\partial c_i})+\mathrm{iM}{c}_i{P}_i\left(\theta \right)(1+c_1\frac{\partial \ln {\gamma }_1}{\partial c_1})-c_1{c}_i(\mathrm{iM}{P}_i\left(\theta \right)\frac{\partial \ln {\gamma }_1}{\partial c_i}+M{P}_1\left(\theta \right)\frac{\partial \ln {\gamma }_i}{\partial c_1})]{\left(\frac{\mathrm{dn}}{{\mathrm{dc}}_1}\right)}^2$

$=[M{c}_1{P}_1\left(\theta \right)+\mathrm{iM}{c}_i{P}_i\left(\theta \right)+c_1{c}_i(M{P}_1\left(\theta \right)\frac{\partial \ln {\gamma }_i}{\partial c_i}+i{M}_i{P}_i\left(\theta \right)\frac{\partial \ln {\gamma }_1}{\partial c_1}-\mathrm{iM}{P}_i\left(\theta \right)\frac{\partial \ln {\gamma }_1}{\partial c_i}-M{P}_1\left(\theta \right)\frac{\partial \ln {\gamma }_i}{\partial c_1})]{\left(\frac{\mathrm{dn}}{{\mathrm{dc}}_1}\right)}^2$

$\approx [{\mathrm{Mc}}_1{P}_1\left(\theta \right)+i{\mathrm{Mc}}_i{P}_i\left(\theta \right)]{\left(\frac{\mathrm{dn}}{{\mathrm{dc}}_1}\right)}^2$

再次，存在包括非常可比量度的高阶项的差的项，因此可以被忽略。类似地，对于任意数量的低聚物物质，最终表达式应为：

组合这些对于等式(1)的分子和分母的近似值产生等式(2)。数值研究显示，被丢弃(drop)的项仅仅占总非理想性校正的小部分，直至数十g/L的浓度，以及因此作为本发明的主题的关系可应用于这种高浓度。

在特定的共同假设下，可以在A₂和A₃之间假设固定关系，使得单个参数捕获全部非理想行为。例如，如果分子被假设类似于硬球体一样活动，则

取决于A₂和A₃的相对量度以及Pi中的sin²(θ/2)项，等式(2)中的一些项可以被忽略，如对于数值分析熟悉的人员而言。例如，对仅仅稍稍高浓度的溶液中的分子，A₃可以被忽略，以及如果复合物全部小于约λ/70，则角度依赖性也可以被忽略，产生很简单的形式：

$\frac{R\left(c\right)}{K}={\left(\frac{\mathrm{dn}}{\mathrm{dc}}\right)}^2\frac{\underset{i}{\Sigma }\mathrm{iM}{c}_i}{1+2A_2{\mathrm{Mc}}^{\mathrm{tot}}}---\left(2\right)$

其中是溶液中的材料的总重量/体积浓度。

如果溶液中的各个物质以两种不同的单体X和Y的复合物形成，则在与以上阐述的类似的假设下，等式(1)可以被缩减为科学文献中之前未知的高度简化的形式，其中全部非理想性自相互作用和交叉相互作用被仅仅在两个参数A₂^X和A₂^Y中捕获：

$\frac{R(c,\theta )}{K}=\frac{\underset{i,j}{\Sigma }\left[{(i{M}_X\frac{\mathrm{dn}}{{\mathrm{dc}}_X}+j{M}_Y\frac{\mathrm{dn}}{{\mathrm{dc}}_Y})}^2\frac{c_{\mathrm{ij}}{P}_{\mathrm{ij}}\left(\theta \right)}{M_{\mathrm{ij}}}\right]}{1+2A_2^X{M}_X\underset{\mathrm{ij}}{\Sigma }\frac{i{M}_X{c}_{\mathrm{ij}}{P}_{\mathrm{ij}}\left(\theta \right)}{M_{\mathrm{ij}}}+2A_2^Y{M}_Y\underset{\mathrm{ij}}{\Sigma }\frac{j{M}_Y{c}_{\mathrm{ij}}{P}_{\mathrm{ij}}\left(\theta \right)}{M_{\mathrm{ij}}}}---\left(3\right)$

其中M_X和M_Y对应于X和Y单体的摩尔质量；dn/dc_X和dn/dc_Y对应于具体溶剂中的X和Y单体的差示折射率增量；i和j是复合物中的X和Y单体的数量，M_ij＝iM_X+jM_Y是摩尔质量，以及c_ij是XiYj复合物的平衡下的重量浓度；A₂^X和A₂^Y指代具体溶剂中的X和Y单体的第二维里系数；以及是ij复合物的均方半径。推导类似于针对相同单体的低聚物所描述的。

如果复合物小于约λ/70，则角度依赖性可以被忽略，以及等式(4)可以被缩减为：

$\frac{R\left(c\right)}{K}=\frac{\underset{i,j}{\Sigma }\left[{(i{M}_X\frac{\mathrm{dn}}{{\mathrm{dc}}_X}+j{M}_Y\frac{\mathrm{dn}}{{\mathrm{dc}}_Y})}^2\frac{c_{\mathrm{ij}}}{M_{\mathrm{ij}}}\right]}{1+2A_2^X{M}_X{c}_X^{\mathrm{tot}}+2A_2^Y{M}_Y{c}_Y^{\mathrm{tot}}}---\left(4\right)$

其中和是溶液中的X和Y的总重量/体积浓度。等式(4)和(5)可以被容易地总体化为两个以上不同的单体物质。

测定A₂。

非理想性参数A₂可以被演绎地估计，或可以是以下描述的数据对非理想性校正的光散射等式和缔合模型等式拟合的参数。

为了从演绎信息估计A₂，已知的分子半径可以被替换为用于计算硬球体的A₂的公式：单体的分子半径可以从结构信息中导出，例如，可以通过x射线晶体照相术确定，或可以从水动力学半径r_h的测量值确定。水动力学半径r_h可以由稀释条件下的动态光散射或差示黏度测量法的测量值计算，如对于熟悉大分子表征的人员而言是已知的。

非理想溶液的简化表示的方法

因此，一种以适用于进一步分析的高度简化的形式表示来自高浓度下可逆自缔合溶液的CG-MALS数据的方法，由图1例示的以下步骤组成：

1.从已知分子结构或从在非缔合条件下取得的流体动力学半径r_h的准弹性光散射或差示黏度测量法测量值，确定有效分子半径r的适当的估计，所述非缔合条件诸如适当低的浓度或合适的缔合限制溶剂；

2.基于已知的单体摩尔质量M和估计的有效分子直径r，估计分子排除容积值在一些情况下，缔合相对弱，以及能够从低浓度下的一系列测量值估计A₂。

3.给定感兴趣的最大浓度c_max，计算最大非理想性贡献的估计量ξ＝2A₂Mc_max；如果ξ大于预定的截断值，例如0.3，则保持等式(2)中的A₃项；否则丢弃A₃项；

4.估计期望形成的最大低聚物的均方直径r_max；如果r_max＞λ/70，则保持等式(2)中的角度项；否则丢弃这些项；

5.使用等式(2)的最终形式以表示CG-MALS数据。如果一些大分子被期待为对于可逆缔合不强干，则在等式中作为不缔合但是具有与强干的(有能力的，competent)大分子相同的维里系数的独特物质进行处理。

一种以适用于进一步分析的高度简化的形式表示来自高浓度下可逆异缔合溶液的CG-MALS数据的方法，由图2例示的以下步骤组成：

1.从已知分子结构或从流体动力学半径r_h，X和r_h，Y的准弹性光散射或差示黏度测量法测量值，确定有效分子半径r_X和r_Y的适当的估计量；

2.基于已知的单体摩尔质量M_X，M_Y和估计的有效分子直径r_X和r_Y，估计分子排除容积值在一些情况下，缔合相对弱，以及能够从低浓度下的一系列测量值估计A₂。

3.估计期待形成的最大复合物的均方半径r_max；如果r_max＞λ/70，则保持等式(4)中的角度项，否则丢弃这些项；

4.使用等式(4)的最终形式以表示CG-MALS数据。如果一些大分子被期待为对于可逆缔合不强干，则在等式中作为不缔合但是具有与强干的大分子相同的维里系数的独特物质进行处理。

这些用于确定以上等式的适当形式的方法的变化对于熟悉数值分析的人员将是明显的。

表征可逆缔合非理想溶液的方法

用根据以上示出一种形式的简化等式中考虑的热动力学非理想性，依照化学计量和平衡缔合常数的相互作用的表征是简单易懂的，并且类似于Attri and Minton在Anal.Biochem.346，132-138(2005)中针对理想溶液以及Fernandez and Minton在Biophys.J.96，1992-1998(2009)针对浓溶液但采用等式(1)而不是此处描述的任意一种简化形式描述的方法。

表征方法包括以下步骤：制备一系列溶液，所述溶液包括一种或更多种大分子物质；允许每个溶液达到自由单体和任意可逆缔合复合物之间的平衡；测量每个溶液的光散射强度；简化光散射数据为一系列过量瑞利比；以及将数据同时拟合为非理想光散射的适当简化的表示和针对以下描述的特异缔合模型的等式。

自缔合的模型等式是：

1.质量作用的等式，将每个平衡低聚物浓度c_i与针对具体化学计量的对应平衡缔合常数K_i和自由单体的浓度c₁相关：

2.质量守恒的等式其中c^tot是对于每个溶液是已知的，如由制备步骤确定或由浓度检测器测量，以及c^inc是不强干缔合以及被认为是独特物质的大分子的浓度。

两个不同单体物质X和Y的异缔合的模型等式是：

1.质量作用的等式，将每个平衡复合物浓度c_ij与针对具体化学计量的对应平衡缔合常数K_ij和自由单体的浓度c_X，c_Y相关：$\frac{c_{\mathrm{ij}}}{i{M}_X+j{M}_Y}=K_{\mathrm{ij}}{\left(\frac{c_X}{M_X}\right)}^i{\left(\frac{c_Y}{M_Y}\right)}^j;$

2.质量守恒的等式

其中c_X^tot和c_Y^tot对于每个溶液是已知的，如由制备步骤确定或用浓度检测器测量；以及c_x^inc和c_Y^inc分别是X和Y大分子的浓度，所述大分子不强干缔合以及被认为是另外的独特物质。

各种拟合算法，诸如Levenberg-Marquardt非线性最小二乘算法和其他算法，根据数值分析理论是周知的。这些算法可以采用于拟合数据为包括非理想光散射等式、质量守恒等式和质量作用等式在内的等式系统，由此获得相互作用参数的拟合值K_i或K_ij，A₂等。

测量设备和步骤——自缔合

参照图3，在浓度c₁，c₂，...c_k下感兴趣的大分子的一组等分试样被引入MALS检测器1，在多个散射角θ_v设置光电检测器。MALS检测器的一个示例是来自Wyatt Technology Corporation，Santa Barbara，CA的

在通常步骤中，浓度系列对应于c_s＝αΔc，其中s＝1，2，...k；Δc是固定浓度阶，以及k是浓度的数量，通常至少是5。k个浓度的每一个的等分试样可以利用各种方法制备和引入到检测器。在一个方法中，这些等分试样利用闪烁管或皿被人工制备以及放置在MALS检测器上。在第二方法中，等分试样被人工制备以及通过泵2注射到光散射检测器流量室(flow cell)。在第三方法中，等分试样通过双泵2在计算机控制下自动制备，其用溶剂7稀释最大浓度c^max的原液6，以及随后顺序地输送所产生的每个等分试样到检测器。能够进行稀释和输送的现存系统的一个示例是来自Wyatt Technology Corporation，Santa Barbara，CA的使用Calypso^TM软件的Calypso^TM SP3附件。

随着在流过系统和与过滤器3表面等相互作用期间样品稀释，流量室中的等分试样的实际浓度可以不同于原始浓度，如制备值c_s。足够注射体积将在每个注入浓度下完全平衡检测器流量室，使得如制备的浓度c_s的知识足以确定MALS流量室中的实际浓度。可作为选择，任选的串联的浓度检测器4可以被使用以测量实际样品浓度。

已知各种方法可用于确定溶液中的样品浓度。在可用于人工制备等分试样的一个方法中，适当质量的浓缩或冻干样品被称重和溶解在已知体积的溶剂中。在第二方法中，通过用分光光度计测量吸收率确定浓度。在第三方法中，通过与MALS检测器串联连接的适当的串联(在线)浓度检测器4确定浓度。串联浓度检测器的一个示例也是来自WyattTechnology Corporation的rEX^TM；其他串联浓度检测器是已知的，包括UV/Vis吸收和荧光检测器。串联浓度检测器可以与MALS检测器串联或并联连接。如果MALS和浓度检测器被串联连接，则充分量的样品必须被输送以在期望浓度下浸透两个流量室。如果MALS和浓度检测器被并联连接，则样品流必须被以受控方式在它们之间分流，以确保在每个样品注射完成时，两个检测器中的浓度相同。样品流分流通常用针阀控制，以及通过适当的流量计监视以保持要求的比例。

当样品流动以及在各注射之间停止时，数据被从检测器中获取，接着被进行先前描述的拟合步骤的计算机5存储和分析。最佳地，用于分析的数据是在流已经停止以及样品平衡之后获取的数据。

每个连续样品通过MALS检测器1，由此在每个检测器角θ_v的过量瑞利比的值R_s(c_s，θ_v)被在连续样品浓度c_s测量。所得光散射和浓度信号接着被计算机装置5存储和处理以计算针对每个注射的等分试样s的值c_s、R_s(c_s，θ_v)。计算机5还通过拟合所计算的结果到等式(2)或其简化形式以及缔合模型等式计算包括M和的分子特征，以及分子相互作用特征A₂和K_i。各种拟合步骤可以被实施以提取分子相互作用特征。在优选实施方式中，拟合步骤由Levenberg-Marquardt算法组成，如应用于两个变量(c和sin²(θ/2))，其中M和A₂固定。

从数值分析理论，测量的数据到光散射等式和缔合模型等式形式的拟合，无论通过Levenberg-Marquardt方法，或其他算法，可以包括统计加权，由此用于进行这些拟合的数据被它们的互反测量标准偏差加权。

测量设备和步骤——异缔合

对于单个物质测量进行测量，除了每个等分试样包含待被确定的各种缔合状态的不同浓度的两种大分子物质X和Y。

在一个步骤中，被称为交叉组成梯度，k个等分试样被制备，其中第s个等分试样的组成是[sΔc_X，(k-s)Δc_Y]，以及Δc_X和Δc_Y是固定的浓度阶大小。

在一个步骤中，被称为恒定组成梯度，k个等分试样被制备，其中第s个等分试样的组成是[sΔc_X，(k-s)Δc_Y]，以及Δc_X和Δc_Y是固定的浓度阶大小。

设备类似于单物质测量的设备，除了计算机控制三泵系统被采用代替双泵系统，每个泵被计算机装置控制以产生、混合和输送以期望的组成包括物质X、物质Y和溶剂的等分试样。这种三泵系统和适当的控制软件是Wyatt Technology Corporation，Santa Barbara，CA的Calypso系统。

组成成分X和Y的总浓度和可以分别由制备方法中设定的预定原液浓度和混合比例确定，或通过测量溶液中的两种物质的浓度的方法确定。

在一个测量溶液中两种不同分子的浓度的方法中，总浓度信号被通过串联浓度检测器4测量，以及由两种组分物质之间的已知比例和每一个对总浓度信号的相对贡献计算组分浓度。此方法已经被Attri和Minton在Anal.Biochem.346(2005)132-138描述。

在测量溶液两种不同分子的浓度的第二方法中，至少两种不同的串联浓度检测装置被使用，以及由浓度信号和每个组分物质对每个浓度检测装置的已知响应确定组分浓度。例如，差示折射计和UV吸收检测器的信号可以被分析以产生存在于相同溶液中的两种物质的每一种的浓度——如果分子对各个浓度检测器的响应至少在一个测量中不同。

如对于光散射、大分子表征、以及数值分析领域的技术人员明显地，对我们发明和描述的方法存在很多明显的变化，其不背离我们列出的用于其实施的基本元素；全部这些变化仅仅是先前描述的本发明的明显的实施，以及通过参照随附的权利要求书被包括在内。