土壤杆菌ZX09,用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β-葡聚糖及其制备方法及在降低血糖上的应用

摘要

本发明公开了一种土壤杆菌ZX09，用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β-葡聚糖及其制备方法及在降低血糖上的应用。其中土壤杆菌ZX09在山东东营的盐土中分离得到菌株，此菌株为土壤杆菌属菌株(Agrobacterium sp.)，菌株已于2010年1月21日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2010020。用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β-葡聚糖，结构通式如下所示：→{3)-beta-D-Glup-(1→3)-[beta-D-Glup-(1→3)-beta-D-Glup-]3-alpha-D-Glup-(1→3)-alpha-D-Glup-(1}n→，上述结构中的n为100～200。本发明菌株新颖，性质独特，可耐盐生长，生长过程中不分泌色素；菌种的培养操作简便，工艺简单，培养基为全合成培养基，成份明确，成本低，适宜于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于微生物及微生物胞外多糖技术领域，特别是一种土壤杆菌Agrobacteriumsp.ZX09，该菌生产的新型水溶性β-葡聚糖分子及其制备方法和在降低血糖上的应用。

背景技术

β-葡聚糖广泛地分布于真菌、细菌和植物体内，目前药用、食用菌β-葡聚糖主要来源于食用、药用担子真菌和子囊酵母菌的细胞壁，谷物中的β-葡聚糖主要存在于燕麦和大麦胚乳的细胞壁中，从这些物质中提取β-葡聚糖的工艺较复杂，且产量较低。

β-葡聚糖不仅在各种生物体内发挥多种生物学活性，而且在各种生物间的相互影响过程中也具有多种功能，是高效的生物反应调节因子(BRM)。据报道，β-葡聚糖具有抗肿瘤、抗氧化等功能，长时间食用含β-葡聚糖的食物能够降低高胆固醇的人血液中的胆固醇，燕麦中提取的β-葡聚糖可降低糖尿病人的餐后血糖(Jenkins，A.L.，D.J.A.Jenkins，U.Zdravkovic，P.Würsch and V.Vuksan.2002.Depression of the glycemic index byhigh levels of β-glucan fiber in two functional foods tested in type 2diabetes.EuropeanJournal of Clinical Nutrition 56，622-628)。然而，β-葡聚糖功效的发挥需要一定溶解度、空间结构和合适的分子量的支撑。很多β-葡聚糖的水溶性较低，例如，可得然胶是由土壤杆菌或产碱杆菌产生的一种水不溶的凝胶多糖型葡聚糖，它由D-葡萄糖残基经β-葡萄糖苷键在C1，C3线性连接而成(Kim，M.K.，K.E.Ryu，W.A.Choi，Y.H.Rhee，andI.Y.Lee.2003.Enhanced production of(1→3)-β-D-glucan by a mutant strain ofAgrobacterium species.Biochem.Eng.J.16：163-168)；香菇多糖对肿瘤有抑制作用，但它在水中的溶解度也不高。而非水溶性的葡聚糖进入人体后很难被直接吸收，使其应用范围收到极大的限制。

为解决这一难题，很多学者研究了β-葡聚糖的衍生化来提高它的水溶性和生物活性，如在对从虎奶菌(Pleurotus tuber-regium)中提取的β-葡聚糖进行硫酸化前后抗肿瘤活性的变化研究中，发现硫酸化后多糖溶解度增大，同时抗肿瘤能力也相应的增加(Lina Zhang，Mei Zhang，Jing Dong，Ji Guo，Yinyin Song，Peter Chi keung Cheung.2001.Chemical structure and chain conformation of the water-insoluble glucan isolated fromPleurotus tuber-regium.Biopolymers 59：457-464.张俐娜，张玫，张志强，黄荣春。虎奶菇葡聚糖硫酸酯在水溶液中的链构象及构效关系。2003年全国高分子学术论文报告会)。另外，在中国专利(CN：1583802A)中对非水溶性酵母β-(1，3)-葡聚糖通过甲酸降解，得到不同分子量的可溶于水的β-(1，3)-葡聚糖。但所有这些解决方法都增加了获得所需β-葡聚糖的难度，使制备成本大大提高，限制了在生产领域中的大规模使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产水溶性β-葡聚糖的土壤杆菌(Agrobacterium sp.ZX09)。

本发明的另一目的是提供一种用土壤杆菌ZX09生产的水溶性高粘度β-葡聚糖及其制备方法。

本发明的目的还在于提供一种用土壤杆菌ZX09生产的水溶性高粘度β-葡聚糖在降低血糖上的应用。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种土壤杆菌ZX09，在山东东营的盐土中分离得到菌株，此菌株为土壤杆菌属菌株(Agrobacterium sp.)，菌株已于2010年1月21日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2010020。

一种用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β-葡聚糖，结构通式如下所示：

→{3)-beta-D-Glup-(1→3)-[beta-D-Glup-(1→3)-beta-D-Glup-]₃-alpha-D-Glup-(1→3)-alpha-D-Glup-(1}_n→

上述结构中的n为100～200。

一种用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β-葡聚糖的制备方法，步骤如下：

(1)配置培养液：将NaH₂PO₄ 0.5‰-2.5‰，KNO₃ 2‰-4‰，CaCl₂ 0.07‰-0.15‰，MgCl₂ 0.2‰-0.5‰，FeSO₄·7H₂O 0.005‰-0.0125‰，MnSO₄ 0.001‰-0.003‰，ZnCl₂0.005‰-0.0075‰，NaCl 0-7％，蔗糖2％-4％溶于H₂O中，pH为5-11，以上盐浓度为质量比；

(2)将培养液加热110-121℃灭菌15-30分钟，然后冷却；

(3)向步骤(2)中冷却至30-37℃的灭菌后的培养液内加入平皿菌落液，在28℃～30℃发酵24-48h形成种子培养液；

(4)向步骤(2)中冷却至30-37℃的灭菌后的培养液内加入步骤(3)中获得的种子培养液，在28℃～30℃发酵48～72h；

(5)向第(4)步得到的发酵液内注入超过发酵液两倍体积的乙醇、丙酮或异戊醇，沉淀得到粗多糖；

(6)对粗多糖去蛋白后得到纯品。

一种用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β-葡聚糖的应用，将利用土壤杆菌ZX09生产的β-葡聚糖应用于降低血糖。

本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)菌株新颖，性质独特，可耐盐生长，生长过程中不分泌色素；(2)菌种的培养操作简便，工艺简单，培养基为全合成培养基，成份明确，成本低，适宜于工业化生产；(3)所得的β-葡聚糖为新结构多糖化合物；(4)β-葡聚糖提取方法简便，所得的β-葡聚糖可直接溶于冷水；(5)对小鼠喂食混有淀粉的多糖，能有效控制餐后血糖的升高。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1是菌株的平板菌落、显微照片和耐盐生长情况。

图2是葡聚糖组分测定的气相色谱图。

图3是葡聚糖的高碘酸氧化结果。

图4是葡聚糖的红外光谱。

图5是葡聚糖的核磁共振谱。

图6是小鼠喂养多糖后的血糖变化图。

土壤杆菌的菌株已于2010年1月21日在中国典型培养物保藏中心保存(CCTCC)，保藏单位的地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010020，其生物材料的分类命名为(Agrobacterium sp.ZX09)。

具体实施方式

本发明土壤杆菌(Agrobacterium sp.ZX09)是在山东东营的盐土中分离得到。该菌株具有以下特点：

a.形态特征：在无机盐琼脂平板培养基上28℃培养本菌株3-5天后观察，菌落呈白色、圆形，表面光滑，边缘整齐，菌株分泌大量的胞外多糖。

b.生理生化特征：能有效还原硝酸盐，不能降解纤维素，不分泌色素。能够在7％的NaCl发酵液中生长，在含2％NaCl的发酵液中生长速度最快。以蔗糖或乳糖为碳源能很好地生长，可疑利用碳源为D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、或D-木糖，不能利用碳源为麦芽糖。发酵48小时后的发酵液最高粘度可达到20000mPa·s(NDJ-1 RotationalViscometer，Rotor为3，RPM为6，上海天平仪器厂)。图1中，A为平板培养基上的菌落，B为细菌的显微镜照片，C为菌株在不同盐浓度的培养液中震荡培养后的相对生长率。

c.土壤杆菌的16S DNA序列见序列表。

d.此菌株为土壤杆菌属菌株。

本发明从土壤杆菌ZX09的菌株中提取出大分子的胞外水溶性β-葡聚糖，结构通式如下所示：

→{3)-beta-D-Glup-(1→3)-[beta-D-Glup-(1→3)-beta-D-Glup-]₃-alpha-D-Glup-(1→3)-alpha-D-Glup-(1}_n→

上述结构中的n为100～200。

上述β-葡聚糖的特性如下

a.多糖组分为单一葡萄糖。图2为气相色谱图。同一组分在同一位置出峰。A图为水解后的ZX09产多糖的出峰情况，单一的峰说明多糖由单一组分组成。B图中水解多糖与甘露糖混合后出现了两个的峰，而C图中水解多糖与葡萄糖混合后只有一个峰，这就说明了组成多糖的单一组分就是葡萄糖。该多糖为葡聚糖。

b.高碘酸不能氧化多糖，见图3。葡聚糖有不同的连接方式。在与高碘酸盐反应时，以1→2或1→4位键合的糖基，平均每个糖基消耗一分子高碘酸；以1→6位键合的糖基或非还原末端基，消耗两分子高碘酸，而1→3位键合的糖基，不消耗高碘酸。可溶性淀粉是以1→4位键合的葡聚糖，以可溶性淀粉作参照，对ZX09生产的葡聚糖进行高碘酸氧化，发现可溶性淀粉消耗了高碘酸盐，而ZX09生产的葡聚糖不消耗高碘酸盐，这说明该葡聚糖的糖基均以1→3位键合。

c.多糖的红外光谱见图4，该高聚物并无衍生基团存在。

d.多糖的核磁共振谱见图5。¹H NMR中，有两个信号，表明葡聚糖中存在alpha构象(δ5.1-5.3ppm)和beta构象(δ4.92-4.96ppm)；¹³C NMR谱中，低场δ106.4，105.75，105.69，105.51，105.37，105.31，105.14，99.59，99.01ppm处的峰，表征了C-1的beta构象，而高场δ98，96ppm处的峰，表征了C-1的alpha构象

本发明利用土壤杆菌ZX09生产水溶性β-葡聚糖，其步骤包括如下：

a.配置培养液：将NaH₂PO₄ 0.5‰-2.5‰，KNO₃ 2‰-4‰，CaCl₂ 0.07‰-0.15‰，MgCl₂0.2‰-0.5‰，FeSO₄·7H₂O 0.005‰-0.0125‰，MnSO₄ 0.001‰-0.003‰，ZnCl₂0.005‰-0.0075‰，NaCl 0-7％，蔗糖2％-4％溶于H₂O中，pH 5-11，以上盐浓度为质量比。

b.将培养液加热110-121℃灭菌15-30分钟，然后冷却；

c.向步骤b中冷却至30-37℃的培养液内加入平皿菌落液；

d.在28℃～30℃发酵步骤c中已接种的培养液24-48h形成种子培养液；

e.向步骤b中冷却至30-37℃的培养液内加入种子培养液；

f.将步骤e中已接种的培养液在28℃～30℃发酵48～72h；

h.向步骤f中获得的发酵液内注入超过发酵液两倍体积的乙醇、丙酮或异戊醇，得到粗多糖；

i.得到的粗多糖去蛋白后得到纯品。

通过上述方法制备的β-葡聚糖的水溶液有很高的粘度，使其具有广泛的应用价值。利用土壤杆菌ZX09生产的β-葡聚糖为活性成分的制剂在食品、饮料以及降低餐后血糖水平上的应用。如该β-葡聚糖或葡聚糖与淀粉混合后，对禁食后的小鼠进行灌喂，检测不同时间的餐后血糖值。图6中只喂食淀粉的小鼠餐后血糖值明显高于喂食含有本发明β-葡聚糖的食物的小鼠。

实施例1

配置培养液，NaH₂PO₄ 0.5g，KNO₃ 2g，CaCl₂ 0.07g，MgCl₂ 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.005g，MnSO₄ 0.001g，ZnCl₂ 0.005g，蔗糖20g，H₂O1000mL，pH 5.0。将培养液加热121℃灭菌15分钟，冷却至30℃接入平皿菌落液200μL，28℃培养24h，为种子液。向灭过菌(121℃灭菌15分钟)并冷却至30℃的培养液中加入2％的种子培养液，28℃发酵48h。在该发酵液中加入两倍体积的乙醇，得到β-葡聚糖粗品。

禁食15小时的小鼠，直接喂食多糖200mg/kg^-1或喂食混有淀粉的多糖200mg/kg^-1，能有效控制餐后血糖的上升。

实施例2

配置培养液，NaH₂PO₄ 0.5g，KNO₃ 2g，CaCl₂ 0.07g，MgCl₂ 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.0075g，MnSO₄ 0.002g，ZnCl₂ 0.005g，NaCl 20g，蔗糖20g，H₂O1000mL，pH 7.2。将培养液加热121℃灭菌15分钟，冷却至30℃接入平皿菌落液100μL，28℃培养24h，为种子液。向灭过菌(121℃灭菌15分钟)并冷却至30℃的培养液中加入10％的种子培养液，28℃发酵72h。向发酵液内加入两倍体积的95％乙醇，得沉淀即为粗多糖，将沉淀取出，重新溶解于水中，利用sevag法去蛋白3次。去蛋白的上清液中再加入2倍体积乙醇，沉淀多糖，并将该沉淀再次溶解于水。得到的多糖水溶液经过DEAE-32纤维素和琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B分离后，乙醇沉淀，干燥，即得纯化的多糖。

实施例3

配置培养液，NaH₂PO₄ 1.0g，KNO₃ 2.5g，CaCl₂ 0.07g，MgCl₂ 0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.0075g，MnSO₄ 0.002g，ZnCl₂ 0.005g，NaCl 20g，蔗糖30g，H₂O1000mL，pH 7.2，将培养液加热121℃灭菌15分钟，冷却至30℃接入平皿菌落液200μL，30℃培养24h，为种子液。向灭过菌(121℃灭菌15分钟)并冷却至30℃的培养液中加入4％的种子培养液，28℃发酵48h。向发酵液内加入两倍体积的95％乙醇，得沉淀即为粗品，将沉淀取出，重新溶解于水中，利用sevag法去蛋白3次。去蛋白的上清液中再加入2倍体积乙醇，沉淀多糖，并将该沉淀再次溶解于水。得到的多糖水溶液经过DEAE-32纤维素和琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B分离后，乙醇沉淀，干燥，即得纯化的多糖。

实施例4

配置培养液，NaH₂PO₄ 1.5g，KNO₃ 3g，CaCl₂ 0.07g，MgCl₂ 0.4g，FeSO₄·7H₂O 0.0075g，MnSO₄ 0.002g，ZnCl₂ 0.005g，NaCl 20g，蔗糖40g，H₂O1000mL，pH11，将培养液加热121℃灭菌15分钟，冷却至30℃接入平皿菌落液100μL，28℃培养24h，为种子液。向灭过菌(121℃灭菌15分钟)并冷却至30℃的培养液中加入10％的种子培养液，30℃发酵48h。向发酵液内加入两倍体积的95％乙醇，得沉淀即为粗品，将沉淀取出，重新溶解于水中，利用利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法去蛋白。去蛋白的上清液中再加入2倍体积乙醇，沉淀多糖，并将该沉淀再次溶解于水。得到的多糖水溶液经过DEAE-32纤维素和琼脂糖凝胶Sepharose CL-4B分离后，乙醇沉淀，干燥，即得纯化的多糖。

实施例5

配置培养液，NaH₂PO₄ 2.5g，KNO₃ 4g，CaCl₂ 0.15g，MgCl₂ 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.0125g，MnSO₄ 0.003g，ZnCl₂ 0.0075g，NaCl 70g，蔗糖40g，H₂O1000mL，pH 7.2，将培养液加热110℃灭菌30分钟，冷却至30℃接入平皿菌落液100μL，28℃培养24h，为种子液。向灭过菌(121℃灭菌15分钟)并冷却至30℃的的培养液中加入5％的种子培养液，30℃发酵72h，向该发酵液内加入两倍体积的95％乙醇，得沉淀即为粗品。

小鼠喂食同实施例1。

序列表

<110>南京理工大学

 

<120>土壤杆菌ZX09，用土壤杆菌ZX09生产的水溶性β-葡聚糖及其制备方法及在降

低血糖上的应用

 

<130>5

 

<160>1

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>1357

<212>DNA

<213>Agrobacterium sp.

 

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1357)

<223>土壤杆菌ZX09 16SrDNA序列

 

<400>1

atgcagtcga ccgccccggg aggggagtgg cagacgggtg agtaacgggt ggcaacctac     60

cctttcctgc ggaatacctc cggaaaactg gaattaacac cgcatccccc ctagggggga    120

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