一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法

摘要

本发明的目的在于提供一种建立在肌球蛋白重链不同亚型基因mRNA表达基础上的比组织化学染色法更为准确、可靠的猪肉肌纤维类型组成的定量分子检测方法。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，其步骤包括引物与探针设计、总RNA提取与质量检测和cDNA第一链的合成，其特征在于：所述引物设计的探针是根据猪MyHC基因不同亚型cDNA上游序列差异合成TaqMan探针。通过上述技术方案，可以通过建立在肌球蛋白重链不同亚型基因mRNA表达基础上的猪肉肌纤维类型组成的定量分子检测方法比组织化学评定更为准确、可靠，本方法采用这种分子定量分型的方法，可以对不同品种猪不同部位肌肉中不同类型肌纤维进行定量测定及分析。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，具体为一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法。

背景技术

我国的猪种资源丰富，分为地方品种、培育品种及外来品种三大类，不同的猪种之间具有很大的差异。北京黑猪是我国较为成熟的培育品种之一，具有体型较大、生长速度较快等优点，但其与外来品种在肉品质上的差异研究较为稀少。肉品质是一个综合的、相对模糊的复杂概念，因此在不同国家、不同地区都具有不同的评价体系与标准。国内通常选用的评价指标与测量方法对引进猪品种及中国地方猪品种的常规肉品质性状进行了测定，并进行对测定结果进行了比较分析，为研究影响猪肉品质候选基因提供研究基础。

与此同时，越来越多的研究表明，肌纤维作为肌肉基本组成单位，其自身理化性质在很大程度上可能影响肉品质性状。有关肌纤维性质的研究早在上世纪70年代就已经开始，但目前的研究主要集中于肌纤维性质的生物学特点以及简单的肌纤维类型分布状况的探索。传统的研究肌纤维性质的方法主要为免疫组织化学方法，不同的染色方法得到的结论不尽相同无法准确定义肌纤维类型。传统的研究肌纤维性质的方法多为组织化学染色方法，不同染色方法得出的结论不尽相同，无法准确定义肌纤维类型。近年，随着功能基因组学的发展，对肌球蛋白重链研究的逐渐深入，一种更为准确的分子分型方法被引入到肌纤维类型组成的研究中。在哺乳动物的骨骼肌和心肌上总共发现了8种肌球蛋白异构体，分别由不同基因编码。Schiaffino(Schiaffino and Reggiani，1994，Schiaffino and Reggiani，1996)和Weiss(Weiss and Leinwand，1996)等在对啮齿类和人类的研究中，确认了与肌纤维类型相对应的四种肌球蛋白重链亚型。Chang和Femandes等人研究发现在猪的骨骼肌上表达的MyHC有四种类型，I、II a、II b和II x，分别由不同的基因编码，并依据肌纤维特有的MyHC类型将猪的肌纤维分为四种类型，从基因表达水平对猪骨骼肌中各种类型肌纤维的组成情况进行研究，发现四种MyHC亚型表达比例不同的肌肉表现出不同的收缩能力和ATP酶活性(Chang，et al.，2003，Klont，et al.，1998)。因此，根据不同类型骨骼肌纤维肌球蛋白重链基因上游序列差异，设计特异引物，对肌肉组织中不同类型肌球蛋白重链基因mRNA表达量进行测定，进而分析肌肉中不同类型肌纤维的组成比例。这种建立在肌球蛋白重链基因mRNA表达基础上的分子分型比组织化学评定更为准确、可靠。

发明内容

本发明的目的在于提供一种建立在肌球蛋白重链基因mRNA表达基础上的，比组织化学染色法更为准确、可靠的猪肉肌纤维类型组成的定量分子分型方法。

为了达到上述目的，本实用新型采用以下技术方案：

一种猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法，其步骤包括引物与探针设计、总RNA提取与质量检测和cDNA第一链的合成，其特征在于：所述引物与探针是根据猪MyHC基因不同亚型cDNA上游序列差异设计合成的TaqMan探针。

进一步，猪MyHC I基因引物序列(5’-3’)为“GGGAAAATCTGAACAAGCTGATGACTCTATTACCCCTGGAGACTTTGTCT”，其TaqMan探针为“TTGCGCTCCACACATC”，其参考序列GenBank登录号为“U75316”。

进一步，猪MyHC II a基因引物序列(5’-3’)为“CCAAGAAAGGTGGCAAGAAGAAGGGTCATCAGCTTGTTCAGATTCTCT”，其TaqMan探针为“CCGTGTCTGCCCTTTT”，其参考序列GenBank登录号为“AB025260”。

进一步，猪MyHC II b基因引物序列(5’-3’)为“ACTTTGTGCGCTGCATCATCGGACGAGTTCGTGCTCCAT”，其TaqMan探针为“ATGAGACCAAAACTCC”，其参考序列GenBank登录号为“AB025261”。

进一步，猪MyHC II x基因引物序列(5’-3’)为“CTTCACTGCGCAGCAGGGGACGAGTTCGTGCTCCAT”，其TaqMan探针为“ATGAGACCAAAACTCC”，其参考序列GenBank登录号为“AB025262”。

进一步，检测中所用内参基因，猪GAPDH基因，参考序列GenBank登录号为“AF069649.1”。

进一步，所述的总RNA提取与质量检测分为如下步骤：

1)匀浆处理：每10-20mg肌肉组织加300μl裂解液RL，使用前加入β-巯基乙醇，用研磨杵将组织彻底研磨，可用匀浆器；之后想匀浆液中加入590μl RNase-free ddH2O和10μl蛋白酶K，混匀后56℃处理10-20分钟；

2)12,000rpm离心2-5分钟，取上清进行一下操作；

3)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3，吸附柱放在收集管中，12,000rpm离心30-60秒，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；

4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

5)配制DNase I工作液：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀；

6)向吸附柱CR3中央加入80μl DNase I 工作液，室温放置15分钟；

7)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

8)想吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，使用前加入乙醇，室温静置2分钟，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中；

9)重复步骤8；

10)12,000rpm离心2分钟，倒掉废液；将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-free ddH2O，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，得到RNA溶液；

12)RNA纯度及浓度检测：普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，28S rRNA量为18SrRNA的两倍左右，说明RNA完整性好；Nanodrop2000超微量分光光度计检测OD260、OD280及OD260/OD280比值，判定RNA的浓度与纯度，高质量的RNA OD260/OD280读数在1.8-2.1之间。

进一步，所述的cDNA第一链的合成(RT-PCR)采用High Capacity cDNA RT试剂盒进行cDNA第一链的合成，反应体系及反应程序如下：

10×RT Buffer                            2.0μl

25×dNTP Mix(100mM)                      0.8μl

10×RT Random Primers                    2.0μl

MultiScribeTM Reverse Transcriptase      1.0μl

RNase Inhibitor                          1.0μl

Nuclease-free H2O                        3.2μl

总RNA                            10.0μl

混匀后离心，置于ABI9700型PCR仪上，25℃10分钟，37℃延伸120分钟，85℃5秒钟后取下，保存于-20℃。

进一步，所述猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法还包括定量PCR反应体系和程序和cDNA样品质量和引物扩增效率的检测两步骤。

进一步，所述的定量PCR反应体系和程序如下所示：

所述的定量PCR反应体系采用20μl反应体系，成分如下：

TaqMan Gene Expression Master Mix(2×)    10μl

TayMan探针(20×)                          1μl

cDNA样品及DEPC水                          9μl

所述的定量PCR反应程序如下表所示：

进一步，所述的cDNA样品质量和引物扩增效率的检测步骤为：

在进行定量PCR试验前，应先进行预试验检测cDNA样品的质量，对cDNA样品使用参基因GAPDH进行rt-PCR试验，根据Ct值，评价cDNA样品质量，Ct＜25的可直接进行后期试验；若Ct≥30说明cDNA样品浓度偏低，需重新进行反转录；若无扩增结果，则cDNA质量存在问题，需重新进行反转录；

将cDNA模板从10倍到105倍梯度稀释，并以此为模板，对每对探针进行荧光定量PCR反应，反映结束后，以内参基因GAPDH的五个梯度反应制作标准曲线，将其他各对引物的曲线斜率和R2与内参基因进行比较，保证扩增效率一致。

进一步，所述猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法还包括荧光定量PCR数据标准化统计分析和各型肌纤维比例的换算两步骤，

进一步，所述的荧光定量PCR数据标准化统计分析为以GAPDH基因为内参基因校正不同样品初始模板量以及反转录效率的差异，每次反应，每个样本的目的基因和内参基因各重复三次，获得平均Ct值，利用美国ABI公司SDS RQManager Version 1.2软件计算样品ΔΔCt值，以2-ΔΔCt法计算得到目的基因的相对表达量RQ。

进一步，所述的各型肌纤维比例的换算为以不同类型MyHC相对表达量占全部MyHC相对表达量比例作为相应类型肌纤维在全部肌纤维中的比例，计算公式如下：

MyHC(i)＝[MyHC(i)/(MyHC I+MyHC II a+MyHC II b+MyHC II x)]×100％。

通过上述技术方案，可以通过建立在肌球蛋白重链基因表达基础上的分子分型的猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法比组织化学评定更为准确、可靠，本方法采用这种分子定量分型的方法，可以对不同品种猪不同部位肌肉中不同类型肌纤维进行定量测定及分析。

附图说明

图1猪肉肌纤维类型组成的mRNA定量检测方法流程图；

图2不同类型MyHC融解曲线图

具体实施方式

1、样品采集

屠宰后迅速采集相关部位肌肉组织样存放于RNAfixer样品保存液中，-20℃冷冻保存备用。

2、药品、试剂和酶：

动物组织总RNA提取试剂盒：天根生化技术(北京)有限公司；

High Capacity cDNA RT Kit：美国Applied Biosystems公司；

TaqMan Gene Expression Master Mix：美国Applied Biosystems公司；

TaqMan探针的合成：美国Applied Biosystems公司；

3、主要仪器和设备：

Eppendorf5417R台式高速冷冻离心机：Eppendorf公司；

ABI9700型热循环仪：Applied Biosystems公司；

ABI7500型试试荧光定量定量PCR系统：Applied Biosystems公司；

Nanodrop2000超微量分光光度计：Thermo Scientific公司；

4、检测方法：

a)引物的设计与合成：

根据猪MyHC基因不同类型cDNA上游序列差异，利用Primer Express 3.0软件(Applied Biosystems)设计并交ABI公司合成TaqMan探针。探针序列如表1所示。

表1不同类型MyHC TaqMan探针引物

b)总RNA提取与质量检测：

采用天根生化技术有限公司生产的动物组织总RNA提取试剂盒提取肌肉组织中的总RNA。具体步骤如下：

1)匀浆处理：每10-20mg肌肉组织加300μl裂解液RL(使用前加入β-巯基乙醇)，用研磨杵将组织彻底研磨(如组织较难彻底研磨，可用匀浆器)；之后想匀浆液中加入590μl RNase-free ddH2O和10μl蛋白酶K，混匀后56℃处理10-20分钟。

2)12,000rpm离心2-5分钟，取上清进行一下操作。

3)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3(吸附柱放在收集管中)，12,000rpm离心30-60秒，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

5)配制DNase I工作液：取10μl DNase I储存液放入新的RNase-free离心管中，加入70μl RDD溶液，轻柔混匀。

6)向吸附柱CR3中央加入80μl DNase I工作液，室温放置15分钟。

7)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

8)想吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前加入乙醇)，室温静置2分钟，12,000rpm离心30-60秒，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

9)重复步骤8。

10)12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-free ddH2O，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，得到RNA溶液。

12)RNA纯度及浓度检测：普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，28S rRNA量约为18SrRNA的两倍，说明RNA完整性好；Nanodrop2000超微量分光光度计检测OD260、OD280及OD260/OD280比值，判定RNA的浓度与纯度，高质量的RNA OD260/OD280读数在1.8-2.1之间。

c)cDNA第一链的合成(RT-PCR)

采用Applied Biosystems公司的High Capacity cDNA RT试剂盒进行cDNA第一链的合成，反应体系及反应程序如下：

10×RT Buffer                            2.0μl

25×dNTP Mix(100mM)                      0.8μl

10×RT Random Primers                    2.0μl

MultiScribeTM Reverse Transcriptase      1.0μl

RNase Inhibitor                          1.0μl

Nuclease-free H2O                        3.2μl

总RNA                                    10.0μl

混匀后离心，置于ABI9700型PCR仪上，25℃10分钟，37℃延伸120分钟，85℃5秒钟后取下，保存于-20℃。

d)定量PCR反应体系和程序

采用20μl反应体系，成分如下：

TaqMan Gene Expression Master Mix(2×)    10μl

TayMan探针(20×)                          1μl

cDNA样品及DEPC水                          9μl

定量PCR反应程序如下表所示：

e)cDNA样品质量和引物扩增效率的检测

在进行定量PCR试验前，应先进行预试验检测cDNA样品的质量。对cDNA样品使用参基因GAPDH进行rt-PCR试验，根据Ct值，评价cDNA样品质量。Ct＜25的可直接进行后期试验；若Ct≥30说明cDNA样品浓度偏低，需重新进行反转录；若无扩增结果，则cDNA质量存在问题，需重新进行反转录。

将cDNA模板从10倍到10⁵倍梯度稀释，并以此为模板，对每对探针进行荧光定量PCR反应。反映结束后，以内参基因GAPDH的五个梯度反应制作标准曲线，将其他各对引物的曲线斜率和R²与内参基因进行比较，保证扩增效率一致。

5、荧光定量PCR数据标准化统计分析

本试验以GAPDH基因为内参基因校正不同样品初始模板量以及反转录效率的差异。每次反应，每个样本的目的基因和内参基因各重复三次，获得平均Ct值，利用美国ABI公司SDS RQ Manager Version 1.2软件计算样品ΔΔCt值，以2^-ΔΔCt法计算得到目的基因的相对表达量RQ。

6、各型肌纤维比例的换算

以不同类型MyHC相对表达量占全部MyHC相对表达量比例作为相应类型肌纤维在全部肌纤维中的比例。计算公式如下，

MyHC_(i)＝[MyHC_(i)/(MyHC I+MyHC II a+MyHC II b+MyHC II x)]×100％。

7、统计分析

用SAS Version 8.02软件的GLM过程对不同品种猪不同类型肌纤维比例进行最小二乘分析，并对不同类型肌纤维比例与猪肉品质及胴体性状关系进行相关性分析，构建如下模型。

Y＝μ+B+e

其中，Y：性状值；

μ：群体均值；

B：品种效应；

e：随机残差。

8、实验结果

对不同类型MyHC基因mRNA相对表达量进行检测，融解曲线见图2。将不同类型肌球蛋白重链表达量换算为肌纤维类型比例，并以不同类型MyHC总表达量作为评价肌纤维数量与密度的指标，对不同类型肌纤维及MyHC表达量在品种及不同肌肉组织中的分布情况进行分析，结果表明不同类型肌纤维及MyHC表达量在品种及肌肉部位间存在差异见表1及图2。

表1不同品种和肌肉部位猪肌纤维类型组成及MyHC表达量差异

注：表中数据表示为：最小二乘均值±标准误。

同一行中数据标有不同上标，^ab表示差异显著且水平达到P＜0.05，^AB表示差异显著水平达到P＜0.01；＊P＜0.05；＊＊P＜0.01。

背最长肌及股二头肌中I型肌纤维比例在品种间均存在显著差异(P＜0.05)，北京黑猪背最长肌中I型肌纤维比例最高(0.376±0.028)，且与长大二元猪(0.281±0.022)差异极显著(P＜0.01)，而股二头肌中I型肌纤维比例以长白猪(0.575±0.023)为最高，显著高于长大二元猪(0.497±0.023)及大白猪(0.491±0.023)(P＜0.05)。此外，I型肌纤维比例在不同肌肉部位也存在差异。长白猪与长大二元猪股二头肌中I型肌纤维比例高于背最长肌，且达到极显著水平(P＜0.01)。

II a型肌纤维在不同品种猪股二头肌中的比例存在差异(P＜0.05)，长大二元猪最高(0.385±0.026)，与长白猪(0.238±0.026)差异达到极显著水平(P＜0.05)。长白猪背最长肌及股二头肌中II a型肌纤维比例存在显著差异(P＜0.05)。

IIb型肌纤维在不同品种猪背最长肌中比例存在差异(P＜0.05)，长大二元猪与大白猪(0.330±0.027和0.287±0.030)II b型肌纤维比例高于另外两个品种，北京黑猪中II b型肌纤维比例最低(0.197±0.024)。股二头肌II b型肌纤维比例在不同品种中不存在显著差异。长大二元猪背最长肌中IIb型肌纤维比例(0.330±0.027)高于股二头肌(0.118±0.028)，且达到极显著水平(P＜0.01)。

II x型肌纤维在背最长肌或股二头肌均几乎不表达，仅在长白猪背最长肌及股二头肌中存在少量表达，分别为0.102±0.031和0.060±0.033，高于其他品种猪(P＜0.05)，背最长肌中的差异达到极显著水平(P＜0.01)。长大二元猪背最长肌与股二头肌中II x型肌纤维比例存在显著差异(P＜0.01)。II b型肌纤维仅在个别长白猪肌肉组织中有少量表达，因此在之后的研究中不对候选基因多态或表达水平对其的影响以及其与肉品质性状的关系进行研究。

背最长肌及股二头肌MyHC表达量在不同品种的分布中不存在差异。但三个引进品种股二头肌中MyHC表达量均高于背最长肌，其中长大二元猪的差异达到极显著水平(P＜0.01)。

本研究对肌肉组织切片分别进行不同预孵环境下ATP酶活性染色以及NADH酶活性染色。根据ATP酶活性染色时酸性和碱性预孵育环境对肌纤维分型具有一定的对应“镜相”关系，可判断出不同类型肌纤维。在因在酸性及碱性环境中，II b及II x型肌纤维着色深浅程度变化不显著，故而分型效果不如I型及IIa型肌纤维。结合NADH酶活性染色结果，I型肌纤维呈深黑色，II b型肌纤维无色或淡染，II a与II x型肌纤维为中等染色程度，根据同一肌纤维在不同染色环境下着色深浅的变化，可判断出肌纤维类型。

对背最长肌中基因表达量与MyHC表达量及不同类型肌纤维比例进行相关性分析，结果如表2所示。分析结果显示，EPOR、PPARGC1、NFATc1、Mef2c及IGF1-r基因表达量与MyHC表达量均存在不同程度的正相关，而PPARGC1基因表达量与背最长肌中I型及II a型肌纤维比例存在正相关。NFATc1基因表达量与背最长肌中I型肌纤维比例存在正相关，IGF1-r基因表达量与背最长肌中I型肌纤维比例存在正相关，同时与II b型肌纤维比例存在负相关。

表2背最长肌中基因表达量与肌纤维类型组成的相关性

注：表中数据表示为交叉的两性状间相关系数及P值；＊P＜0.05；＊＊P＜0.01。