一种猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明提供一种猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗，包含有抗原猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV-67N)和佐剂。本发明以PK-15细胞增殖HEV-67N，优化病毒的增殖条件，提高疫苗的质量和使用效果，制备的猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗，用于预防仔猪血凝性脑脊髓炎病毒感染，为猪血凝性脑脊髓炎的防治提供技术保障，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗及其制备方法，专用于加强猪对血凝性脑脊髓炎病毒免疫保护，属于一种兽医生物疫苗制备技术领域。

背景技术：

猪血凝性脑脊髓炎是由血凝性脑脊髓炎病毒(hemagglutinatingencephalomyelitis virus，简称：HEV)引起仔猪的一种急性、高度接触性传染病。HEV主要侵害1-3周龄的仔猪，临床上以仔猪呕吐、衰竭和明显的神经症状为主要特征，死亡率高达20-100％。

目前，国内外还未见有关猪血凝性脑脊髓炎疫苗的报道。就该病防治工作而言，国内还处于空白期，仅在国外的部分国家应用“亚感染”进行预防，即在母猪临产前一个月与病猪接触或喷雾或肌肉注射培养的弱毒，使母猪免疫，通过初乳中的抗体保护所产的仔猪。但此种免疫方法存在着散毒的危险，且HEV在猪体内可发生基因重组，存在毒力增强的可能性。

发明内容：

本发明的猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗，其特征在于：它包含有猪血凝性脑脊髓炎标准毒株(HEV-67N)和佐剂。

本发明提供一种猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗，该疫苗纯度高，免疫效果好，保存期长，使用安全。

本发明进一步提供上述灭活疫苗的制备方法，为猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗的规模化大批量生产奠定基础。

本发明的猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗，其特征在于：

它包含有抗原--猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV-67N)和佐剂。

所述猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗的佐剂为氢氧化铝胶。

本发明猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)细胞库的建立：采用的细胞为猪肾细胞系PK-15，原始带次为85；以传统方法传代培养，第87～90代细胞作为原始细胞库，第91～100代细胞作为基础细胞库，第101～110代细胞作为工作细胞库；

(2)毒种的制备：采用的抗原为猪血凝性脑脊髓炎病毒HEV-67N，将该种毒在PK-15细胞中和昆明小鼠脑内交替传代4次，作为疫苗的基础毒种；将基础毒种按3％比例接种PK-15细胞的1～5代病毒作为病毒原始种子库；将原始种子库的病毒接种PK-15细胞的1～10代病毒作为基础种子库；将基础种子库的病毒接种PK-15细胞的1～10代病毒作为工作种子库；将HEV-67N标准毒株在实验室内通过昆明小鼠肌肉接种传代8次，采集死亡小鼠脑组织作为攻毒用强毒株；

(3)病毒培养：将病毒工作种子库细胞培养的病毒以3％的量接种长满单层的PK-15细胞上，37℃CO2培养箱中吸附1h，加入含4‰BSA的MEM营养液，在37℃CO2培养箱中培养；待细胞病变达80％时收获病毒，反复冻融三次后经差速离心，收集病毒液；

(4)病毒的灭活：采用4‰甲醛灭活病毒液，37℃24h后即为疫苗原液；

(5)成品配制：将氢氧化铝胶佐剂和灭活病毒按1∶9比例(氢氧化铝佐剂终浓度为0.4～0.7mg/ml)加入疫苗中，混匀，每100毫升灭活疫苗按0.1g/L的终浓度加入1％的硫柳汞1毫升，混匀后无菌分装。

(6)疫苗成品检验：将实验室制备的猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗分别进行无菌检验、安全性试验、免疫效力试验、免疫期试验、攻毒保护率试验和保存期试验。

本发明的积极效果在于：以PK-15细胞增殖HEV-67N，优化病毒的增殖条件，提高疫苗的质量和使用效果，制备的猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗，用于预防仔猪血凝性脑脊髓炎病毒感染，为猪血凝性脑脊髓炎的防治提供技术保障，具有广阔的应用前景。

附图说明：

图1、病毒灭活不同时间HA试验检测结果；

图2、小鼠接种疫苗后病理组织学观察结果；

图3、仔猪接种疫苗后病理组织学观察结果；

图4、疫苗免疫期试验结果。

具体实施方式：

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明。下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1：

1、细胞库的建立：

本疫苗采用的细胞为猪肾细胞系PK-15，原始带次为85。

细胞采用含8％新生牛血清的MEM培养基作为生长液，含2％新生牛血清的MEM作为维持液。生长液和维持液内加入1U/ml青霉素、1U/ml链霉素、1％谷氨酰胺溶液(3％)，并用10％碳酸氢钠调节PH值至7.2～7.4。细胞消化分散采用胰酶溶液(500ml溶液中含0.25g胰酶、4gNaCl、0.2gKCl、0.5g葡萄糖、0.29gNaHCO₃、0.1gNa₂-EDTA、1％酚红0.1ml)。本细胞库共保存有PK-15的原始细胞库、基础细胞库和工作细胞库，每代细胞经细菌和霉菌检验、支原体检验、外源病毒检验合格后储存在冻存液(含40％新生牛血清、10％二甲基亚砜的细胞生长液)中，液氮灌内(-196℃)保存。

(1)原始细胞库的建立：将购买的细胞用细胞生长液进行传代增殖，1∶3传代，培养48小时，连续传代4次，第87代至第90代，每代取20支，胰酶消化，分散，混匀，离心，加入细胞冻存液，分装至细胞冻存管，共计80管，按传代顺序分别标记为YPK-1(87代)，YPK-2(88代)，YPK-3(89代)，YPK-4(90代)，无菌封口后，-20℃冷冻过夜再储存在液氮中。

(2)基础细胞库的建立：取原始细胞库冻存的细胞YPK-4(90代)6支，采用上述同样的细胞传代方法，连续传代细胞10代。每代保存10支，共计100支，液氮中保存，分别标记为JPK-1(91代)，JPK-2(92代)…，JPK-10(100代)。

(3)工作细胞库的建立：取基础细胞库中冻存的细胞6支，采用上述同样的细胞传代方法，连续传代细胞10代。每代培养48小时长成单层时，消化收集细胞，混匀离心，加入冻存液，液氮保存10支，共计100支，分别标记为GPK-1(101代)，GPK-2(102代)，…，GPK-10(110代)。每代细胞保存数少于6支时，从前3代细胞复苏1～2支，采用同样的方法增殖和处理后用于补充。

2、毒种的制备：

本疫苗采用的病毒为猪血凝性脑脊髓炎病毒HEV-67N标准毒株(ATCC-VR741)。病毒经基因组核酸电泳实验、基因核苷酸序列测定、血凝实验、病毒滴定、病毒外源因子检查等均符合相应要求。本疫苗毒株毒力已基本固定，对动物具有致病性，肌肉和脑内接种小鼠，均可使接种鼠在3～7日内感染死亡，无限连续在细胞内传代其毒力可能降低，在细胞和脑内交叉传代可以维持其毒力稳定。

将该种毒在PK-15细胞中和昆明小鼠脑内交替传代4次，每代数量为：细胞培养液400ml，小鼠60只，鼠脑匀浆悬液300ml，-80℃保存，作为疫苗的基础毒种。将基础毒种按3％比例接种PK-15细胞的1～5代病毒作为病毒原始种子库；将原始种子库的病毒接种PK-15细胞的1～10代病毒作为基础种子库；将基础种子库的病毒接种PK-15细胞的1～10代病毒作为工作种子库。将HEV-67N标准毒株在实验室内通过昆明小鼠肌肉接种传代，传代次数在8次以内，每代50只小鼠，采集死亡小鼠脑组织收毒，-80℃保存。

3、猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗生产工艺：

(1)病毒的培养

长满单层的PK-15细胞按3％剂量接种病毒，分别加入无血清MEM及含2％新生牛血清、0.02％牛血清白蛋白(BSA)、0.04％BSA、0.1％BSA的MEM营养液，置37℃培养72h收毒，反复冻融3次后，5000r/min离心30min，取上清，用血凝试验(hemagglutination test，HA)测定效价，确定病毒增殖最佳培养液；按1％、2％、3％、4％、5％和10％的种毒剂量分别接种长满单层的PK-15细胞，营养液MEM中添加0.04％BSA，72h后收获病毒，按上述方法处理后用HA试验测定效价，确定最佳接毒剂量；用3％剂量接种长满单层的PK-15细胞，营养液MEM中添加0.04％BSA，分别培养至24h、48h、72h、96h、120h、144h收获病毒培养物，测定毒价，确定最佳收毒时间。结果如表1所示，在MEM培养基中添加0.04％的BSA，以3％～5％种毒剂量接种病毒，培养至96h时，病毒HA效价最高。

表1病毒培养条件优化结果

3、病毒收集及检验：将上述收获的病毒反复冻融三次，于3000rpm，4℃离心30min，取上清5000rpm，4℃离心30min，去除细胞碎片，收集上清，HA检测为2⁷，TCID₅₀为10^3.58/0.1ml，MLD₅₀为10^3.5/0.1ml，经细菌和支原体检验及外源病毒检验合格后，-80℃保存备用。

4、病毒的灭活：将收集的病毒液分别加入1‰、2‰、3‰、4‰甲醛溶液37℃进行灭活处理，其间震荡数次，分别于4h、8h、12h、16h、24h、36h、48h取样，加入终浓度为0.05％亚硫酸钠终止灭活。所有样品用HA试验测其HA效价并接种小鼠。以HA效价＜2²，小鼠无神经症状且不死亡为标准确定病毒的最佳灭活时间及甲醛浓度。结果如图1所示，病毒经4‰甲醛灭活24h时已无血凝性，将其接种小鼠，小鼠无不良反应，从而确定病毒灭活时间为24h。

5、疫苗混合工艺的研究：灭活好的病毒，按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》规定，将氢氧化铝和灭活病毒按1∶9比例(氢氧化铝佐剂终浓度为0.4～0.7mg/ml)加入疫苗中，混匀，参照《中国兽医生物制品规程》，每100毫升灭活疫苗按0.1g/L的终浓度加入1％的硫柳汞1毫升，混匀后无菌分装至6ml青瓶中，每瓶4ml(1头份)。

6、疫苗成品检验

(1)无菌检验：实验室按上述生产和研究工艺制备了3批疫苗，每批100头份。每批疫苗随机抽取10瓶按照《中国兽药典》进行无菌检验。用硫乙醇酸盐培养基(T.G)50ml，接种待检样品1ml，置37℃培养，3日后自小瓶中吸取培养物分别接种T.G小管和酪胨琼脂(G.A)斜面各2支，每支0.2ml，1支置37℃，1支置25℃，另取0.2ml，接种1支葡萄糖蛋白胨汤(G.P)小管置25℃，培养5日后判定。结果3批灭活疫苗均未检出细菌和霉菌污染。

(2)甲醛残留量检验：对每批抽检的待检样品按照《中国兽药典》进行甲醛残留量测定，结果甲醛含量均符合兽用生物制品通则的规定。

实验例1

本发明疫苗的安全性试验、免疫效力试验、免疫期试验、攻毒保护率试验和保存期试验：

1、疫苗的安全性试验

对实验室制备的灭活疫苗随机抽样，每批次抽样20个头份，3批共计60头份。在吉林大学养猪场和实验动物中心分别购买30头1周龄哺乳仔猪和30只昆明鼠。随机各均分为3组，每组动物10只；同时设5头仔猪和5只小鼠不处理作对照组。本疫苗采用肌肉注射接种。

(1)一次单剂量接种：以4ml/头和0.2ml/只分别免疫仔猪和小鼠，每天测量仔猪体温，观察动物的临床表现，在免疫后1周、2周、4周、8周分别采动物血液，分离血清，用血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)试验测定抗体效价；同时取一头仔猪和一只小鼠，处死后取主要脏器作组织包埋切片，观察组织学或病理学变化。

(2)单剂量重复接种：以4ml/头和0.2ml/只分别免疫仔猪和小鼠，2周后以同样的方法加强免疫一次，每天测量仔猪体温，观察动物的临床表现，在第二次加强免疫后第1周、2周、4周、8周分别采动物血液，分离血清，用血凝抑制(hemagglutinationinhibition，HI)试验测定抗体效价；同时取一头仔猪和一只小鼠，处死后取主要脏器作组织包埋切片，观察组织学或病理学变化。

(3)一次超剂量接种：以8ml/头和0.8ml/只分别免疫仔猪和小鼠，每天测量仔猪体温，观察动物的临床表现，在免疫后第1周、2周、4周、8周分别采动物血液，分离血清，用血凝抑制(hemagglutination inhibition，HI)试验测定抗体效价；同时取一头仔猪和一只小鼠，处死后取主要脏器作组织包埋切片，观察组织学或病理学变化。

(4)怀孕母猪的安全性试验：取产前30-40日龄的怀孕母猪12头，分为4组，每组3头，第1-3组颈部肌肉注射疫苗，接种剂量8ml/头；第4组作为对照，各组母猪在相同条件下分开饲养，观察至母猪分娩，观察有无早产、死胎、木乃伊胎及弱仔等繁殖障碍出现。

结果，本疫苗在注射小鼠和仔猪后，除了可以诱导良好的特异性免疫应答以外，不产生任何临床副作用，病理组织切片如图2、图3所示；3批疫苗以2倍免疫剂量接种的怀孕母猪均无临床异常反应，食欲正常，并按期分娩，产仔正常，未出现早产、木乃伊胎等繁殖障碍现象。健康仔猪数、死胎和弱仔数与对照组相似。说明本疫苗对猪和小鼠是安全的。

2、疫苗的免疫效力试验

从吉林大学养猪场和实验动物中心购买1周龄哺乳仔猪40头和昆明小鼠40只，平均分4组，每批疫苗注射一组；同时设10头猪和10只鼠作为阴性对照组接种PK-15细胞培养液。免疫前均通过HI检测，抗体均为阴性。将本实验室研究的3批HEV灭活疫苗以肌肉注射的方式4ml/只接种仔猪，以0.2ml/只接种小鼠，在免疫后2周采血分离血清，用HI试验检测抗体效价。结果3批疫苗接种仔猪和小鼠后，平均的HI效价分别为2⁴和2³，均能产生针对HEV的中和抗体。

3、疫苗攻毒效力和抗体水平的平行关系研究

采用含有不同病毒滴度即不同剂量的疫苗分别免疫仔猪和小鼠，测定不同个体的抗体水平，获得产生不同抗体水平的个体并分组，采用10⁶MLD₅₀的HEV强毒株进行攻毒试验，攻毒方法采用脑内注射，攻毒后观察21天记录结果。结果如表2和表3所示，当接种动物HI抗体效价达2⁵时，攻毒后免疫保护率可达80％以上。本试验应用的HI检测方法，与免疫攻毒试验间存在良好的平行关系，可代替常规的攻毒试验。抗体效价达2⁵可作为免疫保护的临界值。

表2：不同抗体效价的免疫鼠攻毒试验结果

表3：不同抗体效价的免疫仔猪攻毒试验结果

4、疫苗的免疫期试验

(1)疫苗免疫期试验：以最高代次毒种制备的3批疫苗，每批随机抽取疫苗10支，共计30支，用于小鼠免疫，0.2ml/只。从吉林大学实验动物中心购买昆明小鼠40只，随机分为4组，每组10只。第1组以灭活疫苗免疫一次加细胞营养液免疫2次；第2组以灭活疫苗免疫2次加细胞营养液免疫1次，间隔两周；第3组以灭活疫苗免疫3次，间隔两周；第4组作为对照以细胞营养液免疫3次。在免疫后每周采血分离血清测定抗体效价。结果如图4所示，小鼠经疫苗免疫后，抗体效价逐渐升高，在4～6周达到高峰之后逐渐下降，以抗体效价在2⁵以上的时间作为免疫期，其中免疫一次免疫期达4周，免疫两次可达9周，免疫三次达12周。

(2)怀孕母猪免疫剂量比较试验：由于HEV一般感染1～3周龄的哺乳仔猪，仔猪大都通过初乳产生抗体效价，本试验在了解疫苗的免疫期后，确定疫苗经两次免疫和三次免疫效果较好，因此，选用实验室制备的3批疫苗，每批随机抽取疫苗10支，共计30支，免疫怀孕母猪。选用产前30～40日龄的怀孕母猪12头，随机分为4组，每组3头。第1组4ml/头接种2次，间隔2周；第2组8ml/头疫苗接种1次，两周后以同样的剂量加强免疫一次；第3组8ml/头接种1次，两周后4ml/头再次接种；第4组接种细胞营养液4ml/头接种2次，间隔两周，作阴性对照。于母猪产仔时采母猪耳血、胎盘血、脐带血并与两周后取仔猪前腔静脉血，分别用HI试验测其抗体效价。结果如表4所示，怀孕母猪经8ml/头接种两次和8ml与4ml联合免疫，均可获得较高的抗体效价，仔猪两周后抗体效价最高可达2⁸，对母猪胎盘及脐带血检测，HI抗体效价均为2⁰，提示该疫苗不能通过胎盘屏障免疫仔猪。考虑到实际生产应用情况，大的免疫剂量对机体造成的应激较大，所以我们将免疫剂量定为8ml/头接种1次，两周后4ml/头加强免疫一次。

表4：不同剂量接种怀孕母猪HI检测结果

(5)疫苗的保存期试验

从本实验室制备的3批疫苗每批随机抽取40支，共计120支，随机平分两组。根据一般疫苗的保存条件，分别储存在2～8℃冰箱和室温，在储存至每个整月时，每种保存温度分别随机抽取3支。观察物理性状，取随机一支疫苗中的液体10ul涂布营养琼脂板。剩余的疫苗免疫10支小鼠，免疫4周后采集血液分离血清，用HI检测抗体效价。结果2～8℃冰箱和室温保存的疫苗保存至13个月时，每批次疫苗和每次涂布琼脂板的疫苗均未出现细菌生长。免疫效力检测结果如表5所示，疫苗在2～8℃冰箱保存13个月，其物理性状保持正常，免疫效力未见明显降低；室温保存的疫苗于第5个月出现氢氧化铝胶形成的沉积物不易摇散现象，免疫效力于第6个月开始逐渐降低。

根据实验结果，猪血凝性脑脊髓炎细胞培养灭活疫苗的保存条件为2～8℃，保存期为12个月。