可逆地控制细胞在金层表面的自组装单层膜上黏附的方法

摘要

一种可逆地控制细胞在金层表面的自组装单层膜上的黏附的方法，其步骤为：先制备可共价连接于金层表面的由化合物1与化合物2均匀混合形成的自组装单层膜，再将经培养的细胞黏附于所述金层表面的自组装单层膜上。化合物1的分子式为：

说明书

技术领域

本发明属于动态控制细胞黏附于金层表面的自组装单层膜上的生物学技术领域，特别涉及一种可逆地控制细胞在金层表面的自组装单层膜上黏附的方法，该可逆地控制细胞在金层表面的自组装单层膜上黏附的方法是通过紫外光和可见光任意切换来实现的。

背景技术

细胞黏附是很重要的生命现象，很多疾病的发生都与细胞黏附息息相关。在表面上动态地研究细胞的黏附一直是生物学研究中的一个重要方向。目前而言，能动态地控制细胞在表面的黏附的方法很多，比如通过光照、电化学、加热、微电极、微流控和表面形态的变化等，这些方法都很好地实现了动态地控制细胞在表面黏附，但是这些方法都是单向的、不可逆的，在动态控制细胞黏附的时候，一旦用这些方法使表面性质发生了变化，就无法再重复利用，就不能达到任意控制细胞在表面黏附的目的，这个缺点严重地阻碍了细胞黏附这个领域的研究。本发明克服了这个难点，真正实现了可逆地控制细胞在黏附表面上的黏附。

发明内容

本发明目的在于提供一种可逆地控制细胞在金层表面的自组装单层膜上黏附的方法，该可逆地控制细胞在金层表面的自组装单层膜上黏附的方法是通过紫外光和可见光任意切换来实现的，为研究细胞黏附和迁移相关的工作提供一种可靠的工具。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的可逆地控制细胞在金层表面的自组装单层膜上黏附的方法，其为：先制备黏附于金层表面的自组装单层膜上的由化合物1与化合物2均匀混合形成的第二自组装单层膜，再将经培养的细胞黏附于所述金层表面的第二自组装单层膜上；

所述化合物1的分子式(见图2)为：

所述化合物2分子式(见图2)为：

通过紫外光和可见光的可逆切换，实现细胞在所述金层表面的第二自组装单层膜上黏附的可逆控制，其可逆控制如下：

用浓度为1mg/mL GRGDS的水溶液浸泡所述金层30分钟～1小时，黏附于所述金层表面的第二自组装单层膜上的细胞从所述金层表面的第二自组装单层膜上完全脱附；

用340-380nm的紫外光照射该金层5～12小时，金层表面的第二自组装单层膜中的化合物1的偶氮苯的构象由反式变为顺式，所述金层表面的第二自组装单层膜中的化合物1的偶氮苯末端的GRGDS肽埋没在所述第二自组装单层膜的化合物2中，所述金层表面的第二自组装单层膜变为惰性，在该变为惰性的第二自组装单层膜上培养细胞，只有少许细胞在该变为惰性的第二自组装单层膜上黏附；

用浓度为1mg/mL GRGDS的水溶液浸泡所述金层30分钟～1小时，黏附于所述金层表面的第二自组装单层膜上的少许细胞完全脱附；

再用450-490nm的可见光照射所述金层20分钟～1小时，金层表面的第二自组装单层膜中的化合物1的偶氮苯的构象由顺式变为反式，埋没在所述化合物2中的GRGDS又伸展到所述第二自组装单层膜的末端，在该金层表面的第二自组装单层膜上培养细胞，细胞又黏附到该金层表面的第二自组装单层膜上。

所述的化合物2的合成步骤如下(见图3)：

反应起始物11-巯基十一烷酸的巯基与三苯基氯甲烷以摩尔比1∶1.1反应，该反应在甲苯溶剂中进行，反应过程中加入N，N-二异丙基乙胺作为催化剂，生成化合物4；所述N，N-二异丙基乙胺的加入量为所述三苯基氯甲烷的两倍；所生成的化合物4的结构式为：

将化合物4与六聚乙二醇进行酯化进行反应，六聚乙二醇用量为化合物4的16.7倍，化合物4选择性地连接六聚乙二醇的一端，生成化合物10，所生成的化合物10的结构式为：

在含5％(v/v)三氟乙酸的二氯甲烷溶液的脱保护下，以三乙基硅烷作俘获剂，脱去化合物10的三苯甲基，得到化合物2；所述三乙基硅烷与化合物10的摩尔比为5∶1；所述化合物2的分子式(见图2)为：

所述的化合物1的合成步骤如下(见图4，图5)：

合成目标化合物3：

反应起始物11-巯基十一烷酸的巯基与三苯基氯甲烷以摩尔比1∶1.1反应，该反应在甲苯溶剂中进行，反应过程中加入N，N-二异丙基乙胺作为催化剂，生成化合物4；所述N，N-二异丙基乙胺的加入量为所述三苯基氯甲烷的两倍；所生成的化合物4的结构式为：

将化合物4与N-羟基琥珀酰亚胺按1∶1.2的摩尔比反应，生成化合物(活化酯)5，所述化合物5的结构式为：

将化合物5以每10秒滴一滴的速率加到2，2-(1，2-二氧乙基)双二乙胺的二氯甲烷溶液中，化合物5选择性地与2，2-(1，2-二氧乙基)双二乙胺一端的氨基反应，得到化合物6；所述化合物5与2，2-(1，2-二氧乙基)双二乙胺摩尔比为1∶17；所述化合物6的结构式为：

对硝基苯甲酸在5wt％的氢氧化钠溶液中反应，生成化合物7，所述化合物7为4，4’-羧基偶氮苯，其结构式为：

将化合物7与N-羟基琥珀酰亚胺以摩尔比1∶2.4进行反应，化合物7两端的羧基被N-羟基琥珀酰亚胺活化，生成化合物8，所述化合物8结构式为：

将化合物8溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，加热60℃使之完全溶解；将化合物6以每10秒滴一滴的速率滴加到化合物8的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，化合物6选择性地与化合物8一端的活化酯反应，反应6小时生成化合物9；所述化合物6与化合物8的摩尔比为1∶15；所述化合物9的结构式为：

在含5％(v/v)三氟乙酸的二氯甲烷溶液脱保护下，以三乙基硅烷作俘获剂，脱去化合物9的三苯甲基，得到化合物3；所述三乙基硅烷与化合物9的摩尔比为5∶1；所述化合物3的分子式(见附图2)为：

将玻璃片基底清洗干净，吹干；在该玻璃片基底的表面上先蒸镀2～10nm厚的钛黏附层，然后再在钛黏附层上蒸镀20～50nm厚的金层；

将所得化合物3配制成1mM～10mM的乙醇溶液，在氮气保护下，用可见光照射该溶液3～5小时，再在黑暗的环境中室温下放置3～7天，确保化合物3的偶氮苯的构型全部变为反式；

将所得化合物2溶解于的无水乙醇中，使其摩尔浓度为1mM～10mM；

将所述的偶氮苯构型全部变为反式的化合物3的乙醇溶液与所述化合物2的乙醇溶液均匀混合成混合溶液，混合溶液中的偶氮苯构型全部变为反式的化合物3与化合物2的摩尔比为1∶100～1∶10000；所述混合溶液的总摩尔浓度为2mM；

将上述蒸镀有金层的玻璃片基底置入所述混合溶液中浸泡4～12小时，取出玻璃片基底，用无水乙醇洗3遍，再用氮气吹干，得到共价连接于所述玻璃片基底的金层表面的由所述化合物2与所述偶氮苯构型全部变为反式的化合物3均匀混合而形成的第一自组装单层膜；

将GRGDS肽连接到所述第一自组装单层膜中的构型全部变为反式的化合物3的偶氮苯末端：

将GRGDS肽溶解于pH 8.0的磷酸缓冲液中，使其浓度为2mg/mL，将上述共价连接了第一自组装单层膜的玻璃片基底置入该磷酸缓冲液中，反应5～20分钟，GRGDS上甘氨酸的伯胺基与所述第一自组装单层膜上化合物3的偶氮苯末端的活化酯反应，通过化学键共价连接到所述第一自组装单层膜中的构型全部变为反式的化合物3的偶氮苯的末端，得到化合物1。

本发明提供的可逆地控制细胞在金层表面的自组装单层膜上黏附的方法，利用偶氮苯类化合物良好的光学特性，在偶氮苯的头端共价连接含有巯基的烷基链，使之与抗细胞黏附的聚乙二醇以一定比例混合，在金层表面形成自组装单层膜，所述偶氮苯的末端与非特异性黏附细胞的甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(GRGDS)共价结合；通过紫外光照金层表面的自组装单层膜，所述金层表面的自组装单层膜中的偶氮苯的构象由反式变为顺式，所述偶氮苯末端的GRGDS被埋没在抗细胞黏附的聚乙二醇中，被紫外光光照过的金层表面的自组装单层膜表现为抗细胞黏附，当换用可见光照所述金层后，所述金层表面的自组装单层膜中的顺式构象的偶氮苯变为反式构象，被埋没在聚乙二醇中的GRGDS便可伸展至所述自组装单层膜上端，细胞便黏附到金层表面的自组装单层膜上。此过程是可逆的，在时空上可以任意调控(见图1)，这将为研究细胞与细胞外基质相互作用以及研究多细胞之间的相互作用提供一个有效的工具，为研究与细胞黏附和迁移相关的疾病打下可靠基础。

本发明的优点：相比较其他动态控制细胞在表面黏附的方法而言，本发明最大的优点是实现了可逆地控制细胞在其黏附表面的自组装单层膜上的黏附，通过选择可见光或者紫外光，便可实现对细胞黏附的任意调控；而且该方法简单快速，易于操作。

附图说明

图1为发明内容，细胞黏附在金层表面的第二自组装单层膜上(该第二自组装单层膜中的偶氮苯的构象为反式)，经过340nm～380nm的紫外光照射所述第二自组装单层膜，膜中的偶氮苯的构象由反式变为顺式，所述偶氮苯末端的GRGDS被埋没在抗细胞黏附的聚乙二醇中，被紫外光照的第二自组装单层膜表现为抗细胞黏附。当换用450nm～490nm可见光照射偶氮苯处于顺式构象的第二自组装单层膜后，顺式构象的偶氮苯变为反式构象，被埋没的GRGDS便可伸展至第二自组装单层膜上端，细胞便可以黏附到金层表面的第二自组装单层膜上。此过程是可逆的，在时空上可以任意调控；

图2为化合物1、化合物2和化合物3的化学结构式；

图3为合成化合物2的合成路线；

图4为合成化合物3的合成路线；

图5为将GRGDS连接到第一自组装单层膜上的化合物3的偶氮苯末端的示意图；

图6为细胞黏附在不同比例、不同构型的第二自组装单层膜上的示意图；

图7为细胞可逆地黏附在含有不同构型偶氮苯的第二自组装单层膜上的示意图；

图8为图7所描述的细胞黏附的示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

1)目标化合物2的合成

1.1)化合物4的合成：

其步骤如下：

1.将100mL的两口烧瓶(19#)抽真空，充入氮气；

2.氮气保护下向上述已抽真空的两口烧瓶中加入50mL甲苯，将三苯基氯甲烷(4.60g，16.5mmol)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA，4.20g，33.0mmol)溶解于该甲苯里面，磁力搅拌下加入11-巯基十一烷酸(3.00g，13.8mmol)，氮气保护下在室温反应5小时。

3.反应毕，将溶剂甲苯减压蒸出，向残余的产物中加入50mL二氯甲烷，充分溶解后，用饱和食盐水(3×100mL)洗三次，再用无水硫酸钠干燥二氯甲烷溶液，静置过夜；

4.过滤去掉干燥剂无水硫酸钠，将滤液减压蒸馏，浓缩得的到化合物的粗品；

5.用少许二氯甲烷溶解所得化合物4的粗品后，用柱层析的方法进行纯化；洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1(v/v)，最后得到化合物4纯品，该化合物4纯品为无色油状液体，共5.80g(12.6mmol)，产率为92％；

1.2)化合物10的合成：

其步骤如下：

1.向一个25mL的锥形瓶(19#)中加入5mL无水二氯甲烷，将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl，1.15g，6.0mmol)和催化量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)加入该无水二氯甲烷中，磁力搅拌使之尽可能溶解，向该溶液中加入化合物4，该混合溶液在室温搅拌5分钟；

2.搅拌下将六聚乙二醇(EG6，13.4mL，100.0mmol)加入装有50mL无水二氯甲烷的单口烧瓶里面，充分搅拌；

3.将1中所述混合溶液转移到滴液漏斗中，搅拌下缓慢地滴加到含有六聚乙二醇的二氯甲烷溶液中，滴加完毕后，室温反应12小时；

4.反应毕，用0.1M(2×50mL)盐酸洗反应混合溶液两次，再用二氯甲烷洗一遍水相，将有机相混合后，再用饱和食盐水(100mL)洗一次，用无水硫酸钠干燥有机相，静置过夜；

5.过滤去掉干燥剂无水硫酸钠，将滤液减压蒸馏，浓缩得到化合物10粗品；

6.用少许二氯甲烷溶解该粗品后，用柱层析的方法进行纯化；洗脱剂为氯仿∶甲醇＝80∶1(v/v)，最后得到化合物10纯品，其为无色油状液体，共2.87g(4.0mmol)，产率为79％；

1.3)化合物2的合成：

其步骤如下：

1、将50mL的两口烧瓶(19#)抽真空，充入氮气；

2、氮气保护下将1.5mL三氟乙酸(TFA)加入28.5mL无水二氯甲烷里，得到5％(v/v)的三氟乙酸溶液；搅拌下向该溶液中加入化合物10(1.00g，1.4mmol)，得到浅绿色反应液，加入三乙基硅烷(TESi，1.1mL，6.9mmol)后，反应液由绿色变为无色；

3.该反应在氮气保护下反应4小时后，减压蒸馏除去溶剂；

4.将残余物用少许二氯甲烷溶解后上样，进行柱层析分离，洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯∶丙酮∶乙酸＝15∶1∶1∶0.1(v/v)，得到目标物化合物2纯品，其为无色油状液体，共0.4g(0.83mmol)，产率为60％；

2)目标化合物3的合成

2.1)化合物5的合成：

其步骤如下：

1.向一个50mL的单口烧瓶(19#)中加入步骤1.1)合成的化合物4(1.50g，3.3mmol)，EDC-HCl(0.69g，3.6mmol)催化量的DMAP，加入25mL无水二氯甲烷，磁力搅拌使之溶解，最后向该混合液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.45g，3.9mmol)；

2.该混合溶液在5℃搅拌一个小时，随后在室温下反应24小时；

3.反应毕，用25mL二氯甲烷稀释反应液，再用饱和食盐水(3×50mL)洗三次，用无水硫酸钠干燥有机相，浓缩得到化合物5(1.80g，3.23mmol)，该化合物5为所述化合物4的活化酯；产率为99％；

2.2)化合物6的合成：

其步骤如下：

1.将2，2-(1，2-二氧乙基)双二乙胺(8mL，55mmol)溶解到无水二氯甲烷中，形成混合溶液，搅拌下向该混合溶液中缓慢滴加化合物5(1.80g，3.23mmol)的二氯甲烷溶液10mL，滴加完毕后，再在室温下反应过夜；

2.用50mL二氯甲烷稀释反应液，再用饱和食盐水(3×50mL)洗有机相三次，用无水硫酸钠干燥有机相，减压浓缩，得到化合物6粗品；

3.用少许二氯甲烷溶解化合物6粗品后上样，进行柱层析分离，洗脱剂为氯仿∶甲醇∶氨水＝20∶1∶0.05(v/v)，得到化合物6纯品，其为无色油状液体，共1.78g(3.0mmol)，产率为94％；

2.3)化合物7的合成：

其步骤如下：

1.先称取50g氢氧化钠溶解于225mL蒸馏水中，再称取对硝基苯甲酸15g加入该氢氧化钠溶液，加热该溶液使固体溶解；

2.称取100g葡萄糖溶解于150mL水溶液中，加热使之溶解；

3.在50℃下将葡萄糖溶液滴加到上述对硝基苯甲酸溶液中，刚开始反应液中有黄色沉淀析出，继续滴加葡萄糖溶液，沉淀变为褐色，最后直至变为黑色；

4.该黑色反应液在50℃反应过夜，静置，析出亮褐色沉淀；

5.过滤，将沉淀溶解于水中，得酒红色溶液，往溶液中滴加醋酸，直至析出粉红色的沉淀；

6.过滤，用大量水洗沉淀，干燥，得到终产物(化合物7)6.18g(22.9mmol)，产率为51％；

2.4)化合物8的合成：

其步骤如下：

1.将化合物7(3.00g，11.1mmol)溶解于100mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加热60℃使之绝大部分溶解；

2.向该溶液中依次加入NHS(3.07g，26.7mmol)，EDC-HCl(5.12g，26.7mmol)和催化量的DMAP，该混合溶液在室温下反应12小时；

3.反应毕，向反应液中边搅拌边加入大量蒸馏水，直至有红色沉淀析出。

4.过滤，再用大量水洗沉淀多次，烘箱中干燥，得到亮红色的粉末(化合物8)共4.85g(10.4mmol)，产率为94％；

2.5)化合物9的合成：

其步骤如下：

1.称取化合物8(2.00g，4.3mmol)溶解于20mLDMF中，加热60℃使之完全溶解；

2.将化合物6(0.17g，0.29mmol)溶解于5mL无水二氯甲烷中，然后缓慢滴加到化合物8的DMF溶液；该反应在室温下反应过夜；

3.反应完毕，通过减压蒸馏将反应溶剂DMF除去，用30mL二氯甲烷溶解残留物，过滤除去没有溶解的部分，该部分为多余的化合物8；

4.将滤液浓缩，进行柱层析分离，洗脱剂为氯仿∶甲醇＝80∶1(v/v)，得到化合物9纯品，其为暗红色颗粒，共0.21g(0.22mmol)，产率为76％；

2.6)化合物3的合成：

其步骤如下：

1.将25mL的两口烧瓶(19#)抽真空，充入氮气；

2.氮气保护下将0.5mL三氟乙酸(TFA)加入9.5mL无水二氯甲烷里，得到5％(v/v)的三氟乙酸溶液；搅拌下向该溶液中加入化合物9(0.23g，0.25mmol)，随后加入三乙基硅烷(TESi，202μL，1.25mmol)，反应液为红色；

3.该反应在氮气保护下反应4小时后，减压蒸馏除去溶剂，将残余物用少许二氯甲烷溶解后上样，进行柱层析分离，洗脱剂为氯仿∶甲醇＝60∶1(v/v)，得到化合物3纯品，其为红色油状液体，共0.14g(0.20mmol)，产率为81％；。

3)第一自组装单层膜的制备

3.1)将玻璃片清洗干净，吹干；在该玻璃基底的表面上先蒸镀2～10nm厚的钛黏附层，然后再在其上蒸镀20～50nm厚的金层；

3.2)将2.6)中所得化合物3配制成2mM的乙醇溶液，在氮气保护下，用可见光照射该溶液5小时，再在黑暗的环境中室温下放置3天，确保化合物3的偶氮苯的构型全部变为反式；

3.3)将1.3)中所得化合物2溶解于的无水乙醇中，使其摩尔浓度为2mM；

3.4)将3.2)所述的化合物3的乙醇溶液与3.3)所述化合物2的乙醇溶液按摩尔比为1∶1000均匀混合成混合溶液，总的摩尔浓度为2mM；

3.5)将3.1)所述金层置入3.4)所述混合溶液中浸泡4小时，取出金层，用无水乙醇洗3遍，再用氮气吹干，得到共价连接于所述金层上的由所述化合物2与所述化合物3均匀混合而形成的第一自组装单层膜；

4)将GRGDS肽连接到3.5)所述的金层表面的偶氮苯末端(见图5)：

4.1)配制PBS缓冲液(pH 7.4)，配制pH 8.0、pH 8.6的磷酸缓冲液；

4.1)将GRGDS肽溶解于4.1)所述pH 8.0的磷酸缓冲液中，使其浓度为1mg/mL；

4.3)将3.5)所述金层置入4.1)所述的GRGDS溶液中，反应20分钟，GRGDS上的甘氨酸的伯胺基与金层表面的第一自组装单层膜中的偶氮苯末端的活化酯反应，通过化学键共价连接到偶氮苯的末端；

4.4)取出金层，先用PBS缓冲液洗3遍，再用pH 8.6的磷酸缓冲液洗3遍，随后再用PBS缓冲液洗3遍，再用三次水洗和无水乙醇各洗3遍，最后用惰性气体把金层吹干，最终在所述金层上形成由化合物1与化合物2均匀混合形成的第二自组装单层膜。

这些操作都尽量在黑暗的环境中进行，以确保金层上偶氮苯的构象不会发生太大的改变；

5)细胞培养

使用DMEM高糖培养基培养小鼠NIH 3T3成纤维细胞，培养基中含有10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)青霉素或链霉素，细胞密度为10⁵个/mL，在37℃条件下，通入二氧化碳使培养环境中二氧化碳的体积浓度为5％(v/v)，培养30～60分钟；

6)光化学控制细胞在金层表面的自组装单层膜上可逆的黏附

6.1)将步骤5)所述的细胞加入到步骤4.4)所得的金层表面的第二自组装单层膜上，将细胞在该第二自组装单层膜上进行培养，细胞黏附在该第二自组装单层膜上；

6.2)用GRGDS(1mg/mL)的水溶液使6.1)所述第二自组装单层膜上的细胞完全脱附，再用340-380nm的紫外光照射所述第二自组装单层膜10小时，使所述第二自组装单层膜中的化合物1的偶氮苯的构象由反式变为顺式，所述偶氮苯末端的GRGDS肽埋没在化合物2中，该第二自组装单层膜变为惰性，将细胞培养在该惰性的第二自组装单层膜上，只有很少的细胞在该惰性第二自组装单层膜上黏附。

6.3)用GRGDS(1mg/mL)水溶液使6.2)所述惰性的第二自组装单层膜上的少许黏附的细胞完全脱附，再用450-490nm的可见光照射该惰性的第二自组装单层膜1小时，使所述惰性的第二自组装单层膜中的化合物1的偶氮苯的构象由顺式变为反式，埋没在化合物2中的GRGDS又伸展到所述第二自组装单层膜的末端，在该第二自组装单层膜上培养细胞之后，细胞又能黏附到该第二自组装单层膜上。

通过紫外光和可见光的可逆切换，可以得到不同性质的第二自组装单层膜，从而实现任意地控制细胞在金层表面的自组装单层膜上的黏附(见图7和图8)。

实施例2

本实施的步骤1)、2)、3)、4)与实施例1中的步骤1)、2)、3)、4)相同；

步骤5)培养犬肾(MDCK)细胞，培养条件与实施例1中的步骤5)一样；

本实施例的步骤6)与实施例1中的步骤6)相同。

实施例3

本实施的步骤1)、2)、3)、4)与实施例1中的步骤1)、2)、3)、4)相同；

步骤5)培养HeLa细胞(人宫颈癌细胞)，培养条件与实施例1步骤5)相同；本实施例的步骤6)与实施例1中的步骤6)相同。