控制水稻谷物产量,开花期及植株高度的多效性基因Ghd8的克隆及应用

摘要

本发明涉及植物基因工程领域。克隆得到一个影响水稻谷物产量，开花期及植株高度多效性基因Ghd8。通过构建目的基因的近等基因系，初步定位，比较测序和遗传转化互补等实验分离克隆到Ghd8基因(序列如SEQ ID NO：2)。显性等位基因型单株比隐性等位基因型单株产量增加58％，株高增加25.6％，而抽穗期仅增加9天。利用Ghd8主要变异位点与性状关联分析及不同品种蛋白质序列单倍性聚类分析的结果，构建不同等位基因型的近等基因系，获得4种有利的Ghd8等位基因型。其中Ghd8-9311及Ghd8-ruf等位基因型，增产但不延迟开花，该基因适应于光温条件良好地区育种；Ghd8-MH63及Ghd8-Nip等位基因型不感光，适用于短日照条件地区增产育种。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个影响水稻谷物产量，开花期及植株高度多效性基因Ghd8的克隆及应用。本发明对该具有巨大效益的数量性状位点基因进行了精细定位，利用农杆菌介导的遗传转化，对该基因的功能进行了验证；同时构建了该基因不同等位基因型的近等基因系，对该基因不同等位基因型的功能进行了验证。

背景技术

目前，世界人口迫近70亿，其中一半人口以水稻作为主粮。要满足日益增长的人口对粮食的需求，尤其在当今经济发展可耕地面积不断减少的情况下提高水稻的单位面积产量具有重大意义。

水稻产量是由多种因素共同影响的复杂农艺性状，其构成因子主要包括株高，穗粒数，抽穗期，结实率，分蘖数，千粒重等。每穗实粒数是每穗颖花数和结实率决定的，而每穗颖花数指每个稻穗上颖花的数目，直接决定水稻谷物产量。水稻的植株高度是重要的株型指标，决定着水稻的抗倒伏性与生物学产量，并作用于水稻谷物产量，植株高度的改良亦是理想株型育种的重要方面。在当前分子育种及转基因育种已经成为突破水稻产量瓶颈的必然之选的情况下寻找控制每穗实粒数，抽穗期和株高的关键位点及至克隆相应基因并阐明其遗传基础和分子机理，具有重大理论及实践意义。

水稻的穗粒数，抽穗期及株高是一类受多基因控制的复杂性状，在分离后代中呈现连续正态分布规律的表型变异。这些多基因被称作数量性状基因位点(quantitative trait loci，QTL)。产量等典型数量性状本身受多基因控制，很难在F2即出现单基因分离，一般还需要构建遗传背景一致的近等基因系使目标性状呈现单基因控制的孟德尔分离。近等基因系的构建分为高世代回交法(Ashikari et al.2005；Fan et al.2006)和基于性状表现直接构建(Zhang et al.，2006)两种方法。本发明中近等基因系即是基于重组自交系F₇代中一个性状发生分离家系而构建。

针对遗传基础复杂的数量性状基因的克隆，图位克隆依然是行之有效的方法。图位克隆(map-basedcloning)1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出(Coulson et al.，1986)，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。

Yano等采用图位克隆法克隆了水稻抽穗期相关基因Hd1以来，尤其是水稻全基因组序列释放后水稻抽穗期QTL克隆工作也取得了巨大的成绩。先后克隆抽穗期基因Hd1、Hd6、Hd3a及Ehd1等(Yano et al.，2000；Takahashi et al.，2001；Kojima et al.，2002；Kazuyuki Doi et al.，2004)。2005年第一个控制水稻穗粒数基因Gn1a被克隆(AshikariM et al.，2005)，利用包含约13,000个F₂单株的分离群体将Gn1a限定到6.3kb的区域并最终将此基因克隆。基因编码细胞分裂素氧化脱氢酶的基因(cytokinin oxidase/dehydrogenase，OsCKX2)，该基因和绿色革命基因sd1的聚合育种显示了巨大的增产潜力。薛为亚等(Xue et al.，2008)利用明恢63和珍汕97衍生的近等基因系克隆了位于水稻第七染色体的抽穗期相关多效性基因Ghd7，研究证明其编码一个CO-LIKE基因。该基因使得其近等基因系两种等位基因型在长日照条件下株高相差30cm，单株产量增幅达50％(Xue et al.，2008)，同时却也使得抽穗期延迟了20天，降低了其生产应用价值。

本发明利用基于性状差异的方法从HR5/ZS97衍生的重组自交系F₇代的分离家系RIL39中选取表型差异单株进行背景选择后杂交构建近等基因系。以此近等基因系为基础，利用图位克隆方法，最终克隆了这个同时控制水稻开花期，株高穗粒数的多效性QTL，Ghd8。该位点使得近等基因系两等位基因型之间单株产量由15.1克增加至23.8克，株高由78厘米增加至98厘米，而抽穗期仅由77天增加至86天，生产应用潜力巨大。

发明内容

本发明目的在于克隆一个控制水稻谷粒产量、抽穗期和株高的多效性基因Ghd8。利用这个基因调控水稻的谷粒产量、抽穗期和株高性状，具有较好的应用前景。申请人将克隆的这个基因命名为Ghd8。基因全长891bp(即SEQ ID NO：2)，编码一个含CCAAT结合结构域的蛋白，全长296个氨基酸，其蛋白质的序列如SEQ ID NO：3所述。

本发明是这样实现的：

利用水稻品种珍汕97(ZS97)和HR5构建的重组自交系(以下简称RIL)F7代群体分离家系(方法见Zhang et al.，2006)，从中挑选得到2种极端表型单株：N15(表现为小穗，矮株，早花；N15材料见Zhanget al.，2006)，N16(大穗，高株，晚花；N16材料见Zhang et al.，2006，)进行杂交，构建近等基因系(以下简称NIL)。从NIL-F2分离群体中极端早花单株，利用分子标记将基因精细定位于一个70Kb的片段中。对该70Kb区段内的候选基因(LOC_08g07740)进行测序，发现编码区存在差异，从9311BAC文库(购于Arizona Genomics Institute，研究中心网站http://www.genome.arizona.edu/orders/direct.html？library＝OSI9Ba)中分离到一个包含该候选基因的长10.26kb的序列(即SEQ ID NO：1)，连接至双元载体质粒pCAMBIA1301(来自澳大利亚一个公开报道和使用的质粒)，采用农杆菌介导转化方法，互补转化NIL-ZS97基因型植株(即N15单株)。转基因单株表现与Ghd8NIL-HR5基因型(即N16单株)表现型极为相似。Ghd8被成功克隆。

利用198份微核心种质品种进行Ghd8主要变异位点(S1-S5)同水稻谷物产量，开花期以及植株高度的关联分析。同时结合94份品种蛋白质序列单倍性聚类分析，构建不同等位基因型的近等基因系对蛋白质功能进行了验证，找到了利于增产但不延迟开花的等位基因型Ghd8-9311等位基因型(编码区序列如SEQID NO：2)及Ghd8-ruf等位基因型(编码区序列如SEQ ID NO：8)；能增产且仅略微延迟生育期的Ghd8-nip等位基因型(编码区序列如SEQ ID NO：4)；增产的同时几乎不影响生育期的Ghd8-MH63等位基因型(编码区序列如SEQ ID NO：6)，为育种改良提供了新的途径。

本发明的优点在于：

(1)本发明利用一种基于性状表现的新方法构建了近等基因系，该方法简单，高效，避免了多世代回交方法耗时的缺点。

(2)本发明克隆了一个影响水稻谷粒产量，抽穗期和株高的一因多效基因Ghd8。该基因同时控制水稻开花期，株高及穗粒数，为同时改良水稻株型，产量及地区适应性提供了新的思路及可能性。

(3)利用关联分析方法对性状进行了剖分并以近等基因系材料进行验证，找到了利用Ghd8进行产量及地区适应性改良育种的途径(增产但不延迟开花)。针对不同地区或季节，合理选用Ghd8不同等位基因型，培育高产品种。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是包含候选基因的序列，用于转化N15单株。

序列表SEQ ID NO：2是Ghd8-9311等位基因(来源于水稻品种93-11)编码序列。

序列表SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13是Ghd8-9311等位基因编码氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO：4是Ghd8-Nip(来源于水稻品种日本晴)、Ghd8-HR5(来源于水稻品种HR5)等位基因编码序列。

序列表SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：10是Ghd8-Nip、Ghd8-HR5等位基因编码氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO：6是Ghd8-MH63等位基因(来源于水稻品种明恢63)编码序列。

序列表SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11是Ghd8-MH63等位基因编码氨基酸序列。

序列表SEQ IDNO：8是Ghd8-ruf等位基因(来源于水稻品种O.rufipogon)编码序列。

序列表SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12是Ghd8-ruf等位基因编码氨基酸序列。

图1：是本发明分离克隆Ghd8基因的总体技术路线图。

图2：是本发明中近等基因系的性状表现

图3：是本发明利用极端隐性单株精细定位Ghd8图谱及基于双元载体pCAMBIA1301的转化载体的构建图示，染色体以加粗黑线标示，黑线上方标示标记名称，对应的数字表示重组时间，而黑色虚线方框表示已被纯合为HR5背景的染色体区段。

图4：是本发明中近等基因系两种亲本(珍汕97、HR5)中候选基因氨基酸序列的比对。

图5：是本发明的近等基因系和转基因单株表现。NIL(zs97)、NILzs97-分别为近等基因系隐性亲本和转基因阴性单株，NIL(Hr97)、NILzs97+则是近等基因系显性亲本及转基因阳性单株。

图6：是本发明中用于检测基因型及基因测序的引物。

具体实施方式

以下实施例进一步定义本发明，并描述了Ghd8基因的分离克隆及功能验证。

实施例1：Ghd8基因的精细定位

1、近等基因系构建及评价

据图1的技术路线种植ZS97和HR5的重组自交系F7群体，发现RIL39号家系内部出现抽穗期，株高，穗粒数等表型的分离(表1)。挑选其中矮株，早穗，小穗的N15单株与高株，晚穗，大穗的N16号单株，参照Temnykh等已发表的水稻遗传连锁图谱(Temnykh et al.，2000；Temnykh et al.，2001)，选取了在N15，N16之间具有多态性的126个SSR标记对进行背景筛选，同时对N15与N16单株衍生的F₂群体进行QTL扫描(表2)，F₂表型呈现3∶1分离，株高，穗大小，开花期共分离且低值性状为隐性(见附图2)。该QTL位于第八染色体着丝粒区域，分子标记RM5432与RM547之间。该位点的近等基因系(称Ghd8NIL)构建完成。

表1 N15，N16及其原始亲本HR5，ZS97的性状表现

表2近等基因系群体各种性状QTL效应

2.Ghd8基因的精细定位

2006年的生长季节(5月至10月)在武汉种植包含2260个单株的Ghd8NIL-F₂的分离群体，选取其中极端早花的340个单株进行重组单株的筛选，分别以SSR标记RM547，RM310，RM5556，RM4085，RM5432(序列见图6)及自创多态性标记SNP3，SEQ3-1，SEQ5-1(序列见图6)筛选重组单株并最终将基因定位于一个70Kb的片段中(见图3)，与标记selfpro(序列见图6)共分离。

3.候选基因的确定

70Kb候选区段包含一个编码CCAAT-BOX Binding factor(CBF)蛋白的基因(LOC_Os08g07740)。据Orna Ben-Naim等的报道，CBF类基因参与了拟南芥开花调控，对候选基因的进一步的比较测序发现，HR5与日本晴该区段基因具有相同的核苷酸序列，而Ghd8NIL两种等位基因型：Ghd8-ZS97、Ghd8-HR5等位基因除了在启动子区域存在多处差异外，在编码区离ATG第322碱基处存在一个移码突变使得Ghd8-ZS97等位基因编码氨基酸提前终止(图4)，LOC_Os08g07740被认为是Ghd8的候选基因。

实施例2：Ghd8基因的分离与克隆

根据预测的候选基因序列，扩增PCR片段筛选9311BAC文库，挑选出含有候选基因LOC_Os08g07740的克隆50N15，利用限制性核酸内切酶SacI酶切阳性克隆，进行亚克隆，获得一个10.26K b的片断，该片段包含转录起始点上游3.5kb和终止位点下游5.7Kb的序列，该片段内仅含有候选基因一个完整基因。

将这个片段连接到双元载体pCAMBIA1301上(图3)，测序确定转化载体正确后，采用农杆菌介导的遗传转化方法，得到转基因的水稻。本发明的转基因具体步骤如下：

正确克隆的质粒通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到隐性基因型(Ghd8-ZS97)植株愈伤中，经过愈伤诱导，继代，预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人报道的方法(Hiei Y etal.，1996)基础上进行优化。

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymaticHydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

硝酸钾(KNO₃)                    28.3克

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)              4.0克

硫酸铵((NH₄)₂SO₄)               4.63克

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)             1.85克

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)             1.66克

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制

碘化钾(KI)                      0.08克

硼酸(H₃BO₃)                     0.16克

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)             0.44克

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)             0.15克

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)

烟酸(Nicotinic acid)            0.1克

维生素B1(Thiamine HCl)          0.1克

维生素B6(Pyridoxine HCl)        0.1克

甘氨酸(Glycine)                 0.2克

肌醇(Inositol)                  10克

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(MSmax母液)(按照10X浓缩液配制)

硝酸铵(NH₄NO₃)                  16.5克

硝酸钾                          19.0克

磷酸二氢钾                      1.7克

硫酸镁                          3.7克

氯化钙                          4.4克

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6)MS培养基微量元素母液(MSmin母液)(按照100X浓缩液配制)

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)             2.23克

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)             0.86克

硼酸(H₃BO₃)                        0.62克

碘化钾(KI)                         0.083克

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)              0.025克

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)                0.0025克

氯化钴(CoCl₂·6H₂O)                0.0025克

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

7)2，4-D贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取2，4-D 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取6-BA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

称取NAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取IAA 100毫克，用1毫升1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

秤取AS 0.392克，加入DMSO 10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(取已经制备好的10X浓缩液，下同)        100毫升

N6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)       10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)  10毫升

维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)    10毫升

2，4-D贮存液(取上述制备好的)                    2.5毫升

脯氨酸(Proline)                                 0.3克

CH                                              0.6克

蔗糖                                            30克

Phytagel                                        3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

N6max母液(10X)                    100毫升

N6mix母液(100X)                   10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)              10毫升

维生素贮存液(100X)                10毫升

2，4-D贮存液                      2.0毫升

脯氨酸                            0.5克

CH                                0.6克

蔗糖                              30克

Phytagel                          3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

N6max母液(10X)                    12.5毫升

N6mix母液(100X)                   1.25毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)              2.5毫升

维生素贮存液(100X)                2.5毫升

2，4-D贮存液                      0.75毫升

CH                                0.15克

蔗糖                              5克

琼脂粉                            1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X)                    12.5毫升

N6mix母液(100X)                   1.25毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)              2.5毫升

维生素贮存液(100X)                2.5毫升

2，4-D贮存液                      0.75毫升

CH                                0.2克

蔗糖                              5克

琼脂粉                            1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X)                  5毫升

N6mix母液(100X)                 0.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)            0.5毫升

维生素贮存液(100X)              1毫升

2，4-D贮存液                    0.2毫升

CH                              0.08克

蔗糖                            2克

加蒸馏水至100毫升，调节pH值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X)                  25毫升

N6mix母液(100X)                 2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)            2.5毫升

维生素贮存液(100X)              2.5毫升

2，4-D贮存液                    0.625毫升

CH                              0.15克

蔗糖                            7.5克

琼脂粉                          1.75克

加蒸馏水至250毫升，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN(50毫克/毫升)和400微升CN(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，潮霉素浓度为50毫克/升)第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升，潮霉素浓度为50毫克/升)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X)                  25毫升

N6mix母液(100X)                 2.5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)            2.5毫升

维生素贮存液(100X)              2.5毫升

6-BA贮存液                      0.5毫升

KT贮存液                        0.5毫升

NAA贮存液                       50微升

IAA贮存液                       50微升

CH                              0.15克

蔗糖                            7.5克

琼脂粉                          1.75克

加蒸馏水至250毫升，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN(50毫克/毫升)250微升CN(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X)              100毫升

N6mix母液(100X)             10毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)        10毫升

维生素贮存液(100X)          10毫升

6-BA贮存液                  2毫升

KT贮存液                    2毫升

NAA贮存液                   0.2毫升

IAA贮存液                   0.2毫升

CH                          1克

蔗糖                        30克

Phytagel                    3克

加蒸馏水至900毫升，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X)              50毫升

MSmix母液(100X)             5毫升

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)        5毫升

维生素贮存液(100X)          5毫升

蔗糖                        20克

Phytagel                    3克

加蒸馏水至900毫升，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

3.1愈伤诱导

1)成熟的合江19，牡丹江8号，水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

2)用灭菌水洗种子4-5次；

3)将种子放在诱导培养基上；

4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

3.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.4农杆菌培养

1)在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基配制方法参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养携带SEQ ID NO：1序列片段的农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；

2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

3.5农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

2)调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀ 0.8-1.0；

3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

3.6愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

2)浸泡在含400毫克/升羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

4)转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

3.7分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

3.8生根

1)剪掉分化时产生的根；

2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

3.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入大田隔离环境，田间管理同普通大田。

经过互补转化至Ghd8-ZS97基因型材料后，转基因阳性单株出现开花期延迟，株高增加及穗粒数增大的表现型(图5)。四个独立转化家系的结果皆证实转基因单株表型与基因型共分离。种植T1代，显示其中一个家系表现型出现1∶3分离(26∶76)，以基因内标记Z9M-1(序列见图6)及gus染色均证实表型与基因型共分离，考种结果显示Ghd8-9311等位基因转入Ghd8-ZS97基因型(隐性等位基因)植株后，表型得到了回复(表3)。由此，Ghd8被成功克隆，本发明同时证实，通过转基因手段可以利用Ghd8服务于产量育种。

表3 Ghd8近等基因系及互补转化转基因单株考种表

表3注：NIL(zs97)、NIL(Hr5)分别代表Ghd8NIL中Ghd8-ZS97、Ghd8-HR5等位基因型植株，NILzs97-、NILzs97+分别代表转基因阴性、阳性植株

实施例3：寻找区分产生的不同效应的Ghd8等位基因型

以PCR产物直接测序方法：以引物Ghd8-S1，Ghd8-S2 Ghd8-S3，Ghd8-S4，Ghd8-S5 Ghd8-S16Ghd8-S7，Ghd8-S8共8对引物(引物序列参见图6)扩增Ghd8基因各区段，PCR产物经SAP及EXOI于37℃消化1小时候后(消化反应体系8微升)，80℃变性，取2.5微升消化产物以ABI公司测序试剂盒进行测序扩增反应(第一步96℃2分钟变性，第二步96℃10秒变性，50℃复性，60℃延伸4分钟，此步重复33个循环，第三步4℃10分钟)，扩增产物以95％乙醇∶3M醋酸钠(pH4.8)＝25∶1进行沉淀，26微升每孔反应，沉淀15分钟后以3000g转数离心收集沉淀，取上清后加入75微升70％乙醇洗涤，3000g离心10分钟后去上清，晾干，加入7微升甲酰胺，96度3分钟变性后以ABI3730测序仪进行序列测定。序列经过sequencher4.1.2进行序列的拼接。结合所有材料的表现型数据及序列以TASSEL软件(Bradbury et al，.2007)中的MLM进行关联分析，结果表明主要有5个位点(S1、S2、S3、S4、S5)与抽穗期、产量相关性状紧密相关，其中S2和S5在2005、2006和2007三年实验中对抽穗期都有显著的相关，位于Ghd8-MH63(编码氨基酸序列如SEQ ID NO：7)、Ghd8-9311(编码氨基酸序列如SEQ ID NO：3)、Ghd8-ruf(编码氨基酸序列如SEQ ID NO：9)编码第86位氨基酸由Ghd8-nip等位基因(编码氨基酸序列SEQ ID NO：5)的丝氨酸(Ser)替换为丙氨酸(Ala)的变异，及174位甘氨酸重复次数的变异同时对抽穗期和产量在三年实验中都存在显著相关(表4)。

实施例4：Ghd8不同等位基因的效应评价

通过以水稻品种93-11、明恢63、日本晴和O.rufipogon为供体亲本，ZS97为轮回亲本，回交3-6次，同时利用基因标记Ghd8-S4确定目的基因Ghd8的存在，再经过1-2次自交，最终获得遗传背景基本一致(为ZS97)，Ghd8纯合导入的一系列近等基因系(ZS97⁹³¹¹，ZS97^mh，ZS97^nip，ZS97^ruf)。进行长短日处理比较发现：Ghd8-9311等位基因型(编码区序列如SEQ ID NO：2)及Ghd8-ruf等位基因型(SEQ ID NO：8)为强功能位点，延迟抽穗期并同时大幅度提高穗粒数；而以Ghd8-nip等位基因型(编码区序列如SEQ IDNO：4)为代表为中等功能位点，能提高产量同时在长日照条件下仅延迟生育期1.5天，短日照条件下提前3.4天；而以Ghd8-MH63等位基因型(编码区序列如SEQ ID NO：6)为代表的一类等位基因型为弱功能位点，其在增产的同时对生育期影响极小，(表5)，该结果说明Ghd8-nip、Ghd8-MH63等位基因型中在进化过程中演化出对育种改良有应用价值的有利等位变异。

表4核苷酸位点差异与性状关联性分析

表5 Ghd8不同等位基因型近等基因系在不同日照条件下表型

(注：ZS97^nip、ZS97^mh、ZS97^ruf、ZS97⁹³¹¹分别为ZS97背景下导入Ghd8-nip、Ghd8-MH63、Ghd8-9311、Ghd8-ruf等位基因构建的近等基因系。“^*”代表差异显著，“^**”代表差异极显著。)

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