高选择性多元生物硫醇比色荧光探针及其制备方法

摘要

本发明涉及高选择性多元生物硫醇比色荧光探针及其制备方法，具体涉及一类以硒唑环为识别受体、以蒽醌衍生物为信息报告功能团，且能够高选择性地区分识别半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的比色荧光探针及其制备方法，属于生命科学技术领域。其结构式如下：

说明书

技术领域

本发明涉及高选择性多元生物硫醇比色荧光探针及其制备方法，具体涉及一类以硒唑环为识别受体、以蒽醌衍生物为信息报告功能团，且能够高选择性地区分识别半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的比色荧光探针及其制备方法，属于生命科学技术领域。

背景技术

硫醇是生命体系和化学科学中一类非常重要的物质。小分子硫醇广泛分布在细胞、血浆和组织内，在参与重要生理活动和维持生物体内氧化还原平衡中起着极其重要的作用。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是细胞内存在的最丰富的小分子硫醇类化合物(1～10mM)，能与进入机体的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结合，促其排出体外，因此起到中和解毒作用。另外，谷胱甘肽是保护酶和其他蛋白质的巯基的一种抗氧化剂，是细胞内非蛋白巯基的主要组成部分，参与细胞内的氧化还原反应，还原型(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量的比值在维持体内氧化还原平衡中起着关键作用，这个比值的异常变化将导致心脏病、肿瘤和多种精神紊乱等疾病的发生。半胱氨酸(cysteine，Cys)和高半胱氨酸(也称作同型半胱氨酸，homocysteine，Hcy)也是生物体内存在的两个重要的硫醇类化合物。半胱氨酸含量的降低常会引起发育缓慢、头发退色、水肿、精神委靡、肝脏疾病、皮肤损伤及瘦弱等疾病。高半胱氨酸在血浆中浓度的升高将会伴随着心肌梗塞、抽风、静脉血栓栓塞等疾病。高半胱氨酸的含量高于正常值还可能会引起老年痴呆症(Alzheimer’s disease)，神经中枢缺陷，怀孕并发症，肠炎和骨质疏松等疾病。此外，血样中氧化态Cys和Hcy等浓度的升高，或者还原型GSH浓度的降低都是氧化应激特征性的表征指标。由于含硫醇氨基酸能很好的反映细胞氧化应激的程度，因此血样中硫醇类氨基酸的浓度变化已开始用作于诊断和检测各种代谢紊乱疾病的临床指标。

鉴于此，已发展了多种分析方法用于生物硫醇的检测，尤其是比色和荧光光谱法得到了充分发展并取得了较大的进步，但仅局限在：提高探针的灵敏度和选择性、缩短响应时间以能够实现实时检测以及增宽测量范围以满足实际应用中的要求等。最近，de Silva等人在Nature上详细阐述了多元分析探针的优越性，其中最主要的一点是它能够克服分析多种目标物需要同时注入多种探针带来的不足。多元探针虽有一定的发展，但几乎全部用于分析氢离子和金属阳离子，而能够有效地区分识别这些生物硫醇的探针依然未见报道。因此，设计合成一类能够区分识别多种生物硫醇的多元探针成为本发明要解决的主要目标。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术不能区分识别半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽在活体细胞内含量的问题，提出高选择性多元生物硫醇比色荧光探针及其制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

本发明的高选择性多元生物硫醇比色荧光探针，一类以硒唑环为识别受体、以蒽醌衍生物作为信息报告功能团的多元生物硫醇比色荧光探针，其结构式如下：

式中：R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆为氢原子、烷基、烷氧基、磺酸基或酯基中的一种；R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆可以相同或不同。

本发明的高选择性多元生物硫醇比色荧光探针的制备方法为：与高选择性多元生物硫醇比色荧光探针相应的二氨基化合物与二氧化硒在玛瑙研钵中进行研磨反应制得，研磨温度为10～35℃，研磨时间为15～90min，相应的二氨基化合物与二氧化硒的摩尔比为1∶1～5；其反应结构式为：

上述方法得到的高选择性多元生物硫醇比色荧光探针分别与半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽进行作用可产生不同的吸收光谱同时伴随着不同的颜色变化和荧光发射光谱，从而实现对半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽的选择性识别；且与其他非硫醇氨基酸进行作用均不能导致吸收光谱和荧光发射光谱的明显改变，且这些氨基酸的存在对生物硫醇的定量测定没有干扰；与细胞孵育10～60min后就可导入细胞，从而实现对细胞内生物硫醇含量的测定。

设计思路：蒽醌和它的衍生物常作为发色团和荧光团被广泛应用在阴离子和金属离子探针的设计中，且这些探针在识别目标物的过程中常伴随着溶液颜色和荧光光谱的变化。另外，已报道的结论和我们取得的研究结果表明硒唑环可以作为高选择性识别硫醇的受体。在此基础上，我们设计合成了以二胺基蒽醌衍生物作为信息报告功能团和有机硒唑环作为受体的硫醇探针。我们猜测二胺基蒽醌衍生物中的二胺一旦形成硒唑环形式，吸收光谱会有较大程度地蓝移。当向探针溶液中加入生物硫醇后，硒唑的肢解将导致吸收光谱的红移。重要的是，生物硫醇中的其他官能团(如氨基、羧基等)可能会与蒽醌中的羰基发生不同形式或程度的作用，从而导致不同程度的红移吸收光谱和荧光光谱的出现，进而将它们区分开。

有益效果

本发明能够用眼直接区分识别半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽，并能够在活细胞内对生物硫醇进行成像分析，该制备方法简单，环保，成本低，可工业化生产。

附图说明

图1是不同分析物对目标物(10μM)吸收光谱的影响；

图2是不同分析物对目标物(10μM)荧光光谱的影响；

图3是不同分析物存在下目标物溶液颜色的变化；

图4是不同浓度(0～900μM)的GSH对目标物(10μM)吸收光谱的影响；

图5是不同浓度(0～900μM)的GSH对目标物(10μM)吸收光谱的影响；

图6是不同浓度(20～120μM)的GSH对目标物(10μM)吸收光谱的影响；

图7是不同浓度(0～900μM)的GSH对目标物(10μM)荧光光谱的影响；

图8是不同浓度(0～900μM)的GSH对目标物(10μM)荧光光谱的影响；

图9是不同浓度(0～100μM)的GSH对目标物(10μM)荧光光谱的影响；

图10是不同分析物对目标物(10μM)吸收光谱法定量分析GSH(300μM)结果的影响；

图11是不同分析物对目标物(10μM)荧光光谱法定量分析GSH(300μM)结果的影响；

图12是目标物标记活体HeLa细胞的共聚焦成像图；

图13是目标物标记经NEM处理过的活体HeLa细胞的共聚焦成像图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例

将238.2mg(1mmol)1，2-二胺基蒽醌和221.9mg(2mmol)二氧化硒分别在玛瑙研钵里研细，然后将研细后的两种化合物混合，继续研磨1h，然后将研磨后的混合物溶于三氯甲烷中，过滤，减压下蒸去溶剂，残余物经柱色谱分离，三氯甲烷做淋洗剂，然后将淋洗液除去三氯甲烷淋洗剂，得目标物纯品261.8mg，收率84％，反应式如下：

得到的目标物的核磁氢谱和高分辨质谱表征数据如下：

¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ(*10^-6)：7.95(t，J＝7.0Hz，2H)，8.20(d，J＝7.6Hz，2H)，8.34(d，J＝2.8Hz，2H)；

HRMS(ESI positive)：[M+H]⁺calcd for C₁₄H₇N₂O₂Se 314.96676，found314.96644。

将得到的目标物对被分析物进行识别分析，被分析物为半胱氨酸Cys、高半胱氨酸Hcy、谷胱甘肽GSH、精氨酸Arg、丙氨酸Ala、酪氨酸Tyr、赖氨酸Lys、组氨酸His、天冬氨酸Asp、缬氨酸Val、亮氨酸Leu、色氨酸Try、甲硫氨酸Met、脯氨酸Pro、苯丙氨酸Phep、丝氨酸Ser、苏氨酸Thr、谷氨酸Glu和甘氨酸Gly，被分析物的浓度均为300μM，其具体识别分析步骤为：

在25℃下，将10μM的目标物和被分析物溶于磷酸盐缓冲溶液和乙醇的混合体系中，混合1h后测试紫外光谱和荧光光谱并同时观察其颜色变化；所加入的磷酸盐缓冲溶液为20mM，其pH为7.4，乙醇与水的体积比为1∶1；所用的激发波长是490nm，激发和发射狭缝宽度都是5nm，测试得到的紫外光谱谱图如图1所示，测试得到的荧光光谱谱图如图2所示，其颜色变化如图3所示，其图中1代表目标物和Cys，2代表目标物和Hcy，3代表目标物和GSH，4代表目标物，5代表目标物和其他自然氨基酸的混合物；

将得到的目标物对GSH进行定量分析，其具体步骤为：

在25℃下，将10μM的目标物以及目标物与浓度分别为10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、120μM、140μM、160μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM的GSH溶于磷酸盐缓冲溶液和乙醇的混合体系中，混合1h后测试紫外光谱和荧光光谱；所加入的磷酸盐缓冲溶液为20mM，其pH为7.4，乙醇与水的体积比为1∶1；所用的激发波长是490nm，激发和发射狭缝宽度都是5nm，测试得到的紫外光谱谱图如图4和图5所示，目标物490nm处的吸光度与GSH浓度的线性关系如图6所示；测试得到的荧光光谱谱图如图7和图8所示，目标物594nm处的荧光强度与GSH浓度的线性关系如图9所示；

不同干扰物对目标物定量测试GSH的影响，其具体步骤为：

在25℃下，将10μM目标物、300μMGSH和300μM干扰物溶于磷酸盐缓冲溶液和乙醇的混合体系中，混合1h后测试紫外光谱和荧光光谱；所加入的磷酸盐缓冲溶液为20mM，其pH为7.4，乙醇与水的体积比为1∶1；所用的激发波长是490nm，激发和发射狭缝宽度都是5nm；干扰物分别为Arg、Ala、Tyr、Lys、His、Asp、Val、Leu、Try、Met、Pro、Phe、Ser、Thr、Glu和Gly，测试得到的紫外光谱谱图如图10所示，图中柱状图为在490nm处的吸光度；测试得到的荧光光谱谱图如图11所示，图中柱状图为在594nm处的荧光强度；图10和图11中柱状图分别代表目标物(1)、目标物+GSH+Arg(2)、目标物+GSH+Ala(3)、目标物+GSH+Tyr(4)、目标物+GSH+Lys(5)、目标物+GSH+His(6)、目标物+GSH+Asp(7)、目标物+GSH+Val(8)、目标物+GSH+Leu(9)、目标物+GSH+Try(10)、目标物+GSH+Met(11)、目标物+GSH+Pro(12)、目标物+GSH+Phe(13)、目标物+GSH+Ser(14)、目标物+GSH+Thr(15)、目标物+GSH+Glu(16)、目标物+GSH+Gly(17)和目标物+GSH(18)。

细胞成像实验：

为了考察目标物测定活体细胞内生物硫醇的能力，我们将目标物应用到活体HeLa细胞的成像分析实验；经目标物(10μM)孵育30min后，HeLa细胞的细胞质内呈现强的红色荧光如图12所示，这一结果表明目标物能够穿透细胞膜并能够靶向性地标记细胞质；此外，我们先用50μM NEM对细胞进行预处理以降低细胞内生物硫醇的浓度，然后再用目标物(10μM)孵育30min，结果表明红色荧光明显降低如图13所示；这些结果表明目标物的荧光变化的确是由细胞内生物硫醇含量的改变导致的，具体步骤为：

HeLa细胞(北京协和医科大学细胞中心)用DMEM/F12培养液(含10％胎牛血清，50U/mL青霉素，50μg/mL链霉素)调整细胞密度为10^-6个细胞/mL，置于无菌的培养皿中，37℃5％二氧化碳培养箱中进行培养；先用无血清的DMEM清洗3次，除去未贴壁的细胞，然后再用培养液稀释分别置于两个6孔板中进行培养供实验所用；一部分直接用10μM目标物溶液孵育30min；一部分先用50μMNEM孵育2h以降低细胞内生物硫醇的浓度，然后再用10μM目标物溶液孵育30min。用激光共聚焦显微镜拍摄上述细胞的荧光显微照片，激发光源：绿光；激光共聚焦显微成像前，除去培养液，然后再用PBS缓冲溶液冲洗两次。