一种确定牛乳过敏原表位关键氨基酸的方法

摘要

一种确定牛乳过敏原表位关键氨基酸的方法，根据初步确定的模拟表位区氨基酸序列，合成表位肽段，固定和保护，其C端共价结合到活化的纤维膜上，N端被乙酰化；用单个甘氨酸作为阴性对照，将合成的氨基酸序列与多克隆血清反应，确定β-乳球蛋白的主要表位；将主要表位中的每个氨基酸依次被丙氨酸或甘氨酸取代，得到需合成的氨基酸序列；将得到的氨基酸序列，合成表位肽段，固定和保护，其C端共价结合到活化的纤维膜上，N端被乙酰化；用单个甘氨酸作为阴性对照，将合成的氨基酸序列与多克隆血清反应，确定牛乳表位中的关键氨基酸。本发明可为乳过敏的诊断、治疗以及食品中过敏原的检测奠定基础，为开发低过敏性牛乳提供理论依据和技术支持。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及表位的精确定位。

背景技术

牛乳过敏是一种常见的食物过敏反应，1-2％的成人和高达8％的三岁以下儿童会对牛乳产生食物过敏反应。牛乳中含有将近20种蛋白质都具有潜在的致敏性，据报道牛乳过敏人群对牛乳的过敏一般表现为对多个蛋白的共过敏。β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、酪蛋白被认为是主要的过敏原，其他蛋白如牛血清白蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白在过敏反应中也起着非常重要的作用，有大约30％～50％的牛乳过敏者对这些微量蛋白过敏，且其中有些患者只对这些微量蛋白过敏。

β-乳球蛋白占牛奶总蛋白的10％，乳清蛋白的50％。β-乳球蛋白是公认的主要乳过敏原之一，大约82％的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏。母乳中不存在β-乳球蛋白，这也是其成为主要过敏原的原因之一。同时，β-乳球蛋白属lipocalin蛋白家族，lipocalin蛋白具有相同的由重复排列的8或10个反向平行的β-折片组成的β-桶状结构。由于其复杂的结构，lipocalin蛋白家族中许多蛋白质具有强的致敏性，一些动物源性过敏原都属于这类蛋白，如马的主要过敏原Equ c 1、主要的鼠蛋白等。β-乳球蛋白耐酸和耐蛋白酶水解。因此，消化后人体内还存在着完整的β-乳球蛋白及其肽段，可能会引起过敏反应。

β-乳球蛋白的存在形式与pH值有关，在鲜牛乳中(pH6.6～6.8)，它是以二聚体的形式存在，当pH低于3.5时，二聚体离解成单体，pH在3.5～5.2之间时，二聚体四聚化形成八聚体，pH高于7.5时，二聚体解离且构象发生变化形成膨胀的单体。β-乳球蛋白一般是二聚体，其每个单体为18kDa，含有162个氨基酸，5个二硫键，其中4个为链内，1个为链间。

“水牛奶中β-乳球蛋白过敏原表位定位的初步研究”(《食品科学》2007，vo1.28，No.10，P360-363)中公开了水牛奶中β-乳球蛋白过敏原表位定位的初步研究结果，即利用免疫亲和纯化的特异性兔血清对噬菌体随机七肽库进行亲和淘选，并借助网络工具MIMOX分析，确定β-乳球蛋白过敏原的表位区，但不能确定其中的关键氨基酸。

发明内容

本发明的目的是在确定过敏原表位区的基础上，加入对表位的理论预测以及通过噬菌体展示技术和肽扫描相结合的方法对牛奶中β-乳球蛋白进行正确和全面的表位定位并进一步确定其中的关键氨基酸。

本发明是通过以下技术方案实现的。

1、根据初步确定的模拟表位区氨基酸序列，合成表位肽段，并固定和保护，合成肽段的C端共价结合到活化的纤维膜上，N端被乙酰化；

2、用单个甘氨酸作为阴性对照，将合成的氨基酸序列与多克隆血清反应，根据反应的强度，确定β-乳球蛋白的主要表位；

3、将β-乳球蛋白的主要表位中的每个氨基酸依次被丙氨酸或甘氨酸取代，得到需合成的氨基酸序列；

4、由步骤3得到的氨基酸序列，再合成表位肽段，并固定和保护，合成肽段的C端共价结合到活化的纤维膜上，N端被乙酰化；

5、用单个甘氨酸作为阴性对照，将合成的氨基酸序列与多克隆血清反应，根据反应的强度，确定牛乳表位中的关键氨基酸。

本发明以生物信息学预测B细胞表位的结果为基础，采用相应的多克隆抗体为靶分子，通过噬菌体展示技术和肽扫描技术精确定位β-乳球蛋白的线性表位，可为阐明β-乳球蛋白过敏的物质基础，进行乳过敏的诊断、治疗以及食品中过敏原的检测奠定基础，为开发低过敏性牛乳提供理论依据和技术支持，同时该方法也为其它食物过敏原表位的精确定位提供新的途径。

附图说明

图1为DANStar软件多参数预测结果。

图2为亲水性、α-螺旋，β-转角和β-折叠的预测结果。

图3为本发明MIMOX序列比对的界面。

图4为本发明112个模拟表位中氨基酸对应的β-乳球蛋白位点。

图5为肽扫描结果。

图6为1#兔血清识别不同肽段的强度。

图7为3#兔血清识别不同肽段的强度。

图8为4#兔血清识别不同肽段的强度。

图9为氨基酸置换方法确定关键氨基酸。

具体实施方式

本发明将通过以下实施例作进一步说明。

实施例。

本实施例所选材料：纯度达90％以上水牛乳β-乳球蛋白，相应的多克隆抗体，滴度达1∶40万以上。

所用水牛乳β-乳球蛋白的制备为以下步骤：

以DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换(1.2cm×30cm)进行分离，先用pH6.8，0.02mol/L磷酸盐起始缓冲液平衡离子交换柱；取适当稀释超滤后的乳清，上样；pH6.8，0.02mol/L磷酸盐平衡缓冲液洗脱未被吸附的蛋白质，约200mL；含0～0.5mol/L NaCl磷酸盐缓冲液连续洗脱被吸附的蛋白质，洗脱速度为1.5mL/min；收集目标洗脱峰，用截流分子量5kDa Amicon Ultra-15超滤离心管超滤浓缩至1/50体积超滤浓缩后的离子交换目标产物上SephadexG-75凝胶层析柱(1.2cm×75cm)进一步分离：装柱，将柱材用真空泵脱气；0.02mol/L pH6.8的磷酸盐缓冲液平衡凝胶层析柱；平衡后，上样；0.02mol/L pH6.8的磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱速度：8mL/h。收集目标峰，超滤浓缩至1/50体积。得到的纯化的目标蛋白，采用SDS-PAGE、IEF-PAGE和ESI-Q-TOF-MS进行鉴定，其纯度高达90％以上，并适用于实验室小量和中量制备。

以纯化的牛乳β-乳球蛋白为抗原，初次免疫用弗氏完全佐剂；加强免疫用弗氏不完全佐剂；免疫途径以皮下多点注射方式进行每只兔子1mg/mL每两周免疫一次，共免疫4次。采用方阵滴定确定最佳包被浓度，间接ELISA跟踪抗体效价达l∶40万以上；再通过间接ELISA、竞争抑制ELISA以及免疫印迹实验，证明分离纯化的牛乳β-乳球蛋白的抗原性完好，水牛乳β-乳球蛋白与牛乳β-乳球蛋白存在较强的免疫交叉反应，其交叉率达到69.27％。

2、方法

2.1多参数预测水牛乳β-乳球蛋白抗原线性表位结果

利用DNAStar软件对水牛乳β-乳球蛋白氨基酸序列进行表位相关参数的理论预测，如图1所示，可能构成抗原区的位置如表1。

表1DANStar软件预测的表位区

通过网络服务器，我们再次对牛乳β-乳球蛋白的抗原区进行预测，图2和表2显示了水牛乳β-乳球蛋白的亲水性、α-螺旋、β-转角和β-折叠的预测分析结果。

表2亲水性、α-螺旋，β-转角和β-折叠的存在的可能位点

^*通过Kyto&Dolittle分析的结果，^**通过Welling分析的结果。

综合以上的预测分析，我们得到了水牛乳β-乳球蛋白可能的抗原表位区：AA30-45，AA67-78，AA97-115，AA124-141，AA150-156。

2.2噬菌体随机肽库定位

2.2.1噬菌体随机七肽库筛选

将纯化的多克隆抗体IgG用包被缓冲液(0.1mol/LNaHCO₃，pH 8.6)稀释至10μg/mL，每孔100μL包被96孔酶标板，4℃轻微震荡，孵育过夜。弃去包被液，每孔加满封阻液(0.1mol/LNaHCO₃，5mg/mLBSA，0.02％的NaN₃)，4C封阻2h；用TBST(50mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，0.1％Tween-20)快速洗板6次，每孔加入100μL的噬菌体原始肽库(含2×10¹¹个的噬菌体)，室温轻摇震荡60min；弃去未结合噬菌体液，用TBST洗板10次，每孔加入甘氨酸洗脱液(0.2mol/L，pH 2.2Glycine-HCl，1mg/mLBSA)100μL，室温轻摇10min，洗脱特异性结合的噬菌体，收集洗脱液于微量离心管，加入中和缓冲液(Tris-HCl，pH 9.1)；留5μL用于滴度测定，剩余洗脱物进行扩增，用于下一轮筛选。同样的方法进行第2、3、4轮筛选，洗脱液TBST的浓度依次递增为0.25％、0.5％、0.5％。

2.2.2噬菌体滴度的测定

用LB培养基对洗脱液进行倍比稀释，分别取各稀释度的噬菌体加入到制备好的对数生长期的ER2738菌液中，室温温育后加入到上层琼脂中混匀，均匀铺于平皿上，培养过夜。记数平皿上蓝斑个数。噬菌体滴度＝平皿中蓝斑个数×稀释倍数，即每10μL的噬菌体形成单位。

2.2.3挑选随机克隆

在小于100个克隆子的平板上随机从第3和4轮挑取30个单菌落加到ER2738过夜培养物，按1∶100稀释接种于LB培养基，37℃摇床培养4.5-5hrs后，培养物转入微量离心管中，离心30秒。上清转入一新的管中，再离心。用移液器将80％的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，取500μL用NaI提取单DNA，其余用作扩增和ELISA。

2.2.4扩增

用20mL的培养基对每个克隆子进行扩增，步骤如肽库扩增。

2.2.5间接ELISA鉴定阳性克隆

用包被缓冲液稀释抗体(100ug/mL)，每孔100μL包被96孔酶标板，密封湿盒中4℃过夜。弃包被液，每孔加满封阻液，4℃封阻2h。0.5％TBST洗板3次，每孔加入一个克隆子的上清液，37℃2h，洗板三次，加入1∶5000稀释的HRP标记的抗M13抗体100μL/孔，室温孵育1h，洗板后加100μL/孔OPD底物显色液，室温作用10～20min显色，2mol/LH₂SO₄终止反应，490nm处读数。

2.2.6软件MIMOX比对模拟表位

将水牛乳β-乳球蛋白氨基酸序列分为三个区段：B1、B2和B3。通过不同实验兔的血清筛选到的模拟肽分别与水牛乳β-乳球蛋白氨基酸序列B1、B2和B3比对，采用下面的格式，输入到图3的工作区进行比对，以确定模拟肽对应于水牛乳β-乳球蛋白氨基酸序列中的位点，即模拟表位。

>mimoseqB1

IIVTQTMKGLDIQKVAGTWHSLAMAASDISLLDAQSAPLRVYVEELKPTPEGNL

>mimoseqB2

EILLQKWENGECAQKKIIAEKTKIPAVFKIDALNENKVLVLDTDYKKYLLFCME

>mimoseqB3

NSAEPEQSLACQCLVRTPEVDNEALEKFDKALKALPMHIRLAFNPTQLEGQCHV

2.3肽扫描表位定位

2.3.1肽膜的合成

本实验所要分析的肽由Sigma公司合成并固定在纤维膜上。合成肽段的C端共价结合到活化的纤维膜上，N端被乙酰化，既可以防止被降解，也可保持天然的过敏构象，单个甘氨酸为阴性对照。

2.3.2肽膜的检测

1)用少量体积的甲醇漂洗膜5min；

2)用适量的TBS洗脱三次共10min，洗脱的体积取决于膜和管子的大小，膜需要完全被覆盖；

3)用相同体积封阻剂室温下封阻至少2小时；

4)用相同体积的0.1-10μg/mL(封阻液稀释)温育3小时；

5)用T-TBS再洗10min；

6)用合适的HRP标记的二抗温育2小时，用封阻液稀释1∶10000；

7)用相同体积的T-TBS洗膜三次共5min；

8)检测的显色剂至少100μl/cm²加到膜上；

9)用tip头重复地洗膜或者缓慢地摇动容器；

10)将膜倒置显影；

11)暴露60秒，显影，定影；

12)利用软件ImagePro软件定量确定OD值。

2.3.3肽膜的再生过程

1)用水洗膜三次共10min；

2)用再生缓冲液I洗膜至少4次共30min，温度为50度；

3)室温下用10×PBS至少洗3次共20min；

4)室温下用T-TBS洗3次共20min；

5)室温下用TBS至少洗3次共10min；

6)用标记的抗体检测是否再生成功，如果不成功就用再生步骤2。

3结果

3.1噬菌体随机肽库模拟表位的DNA测序结果

以1#，2#，3#和4#兔血清得到的亲和纯化的IgG为靶分子，挑选了300个克隆子，鉴定出112个阳性克隆，测序结果如表3-6所示。

表31#兔阳性克隆的测序结果

表42#兔阳性克隆的测序结果

表53#兔阳性克隆的测序结果

表64#兔阳性克隆的测序结果

3.2模拟表位的定位

采用MIMOX中的第一功能对测序得到的氨基酸序列与水牛乳β-乳球蛋白氨基酸序列进行比对，识别三个以上的模拟肽作为水牛乳β-乳球蛋白的模拟表位。图4统计了模拟肽识别的水牛乳β-乳球蛋白的氨基酸位点。对所得到的肽段的识别的位点和出现的频率进行分析，定位出水牛乳β-乳球蛋白的表位区为：AA14-20，AA26-32，AA36-42，AA70-80，AA82-86以及AA149-156。同时对不同的兔子得到的模拟肽分别进行表位定位，结果如表7。

表7不同免疫兔子识别的模拟表位肽段区

3.3合成肽定位结果

3.3.1肽膜的检测条件

肽膜用3％明胶37℃温育1h后，将膜浸泡在4ug/mL一抗溶液15mL中，室温摇床温和摇动2h；T-TBS洗四次，10min/次，加二抗(1∶10000)室温温育1h，用T-TBS洗四次，15min/次，ECL将膜浸润，反复滴加使膜充分与底物接触，约2min，黑暗曝光10-30秒，然后放置到显影剂中30秒，再用定影剂浸泡20秒。

3.3.2肽扫描定位结果

合成肽膜的原始膜如图5A所示，阴性血清作对照(图5B)。1#-4#兔血清识别肽段的结果图为5C-F。通过ImagePro软件将1#，3#和4#兔血清识别肽段反应的强度值如图6-8。其中兔2的特异性识别非常强，只识别一个肽段，这里未对此点进行量化和作图比较。

根据以上四个特异性血清与合成肽的免疫反应的结果，实验兔血清分别识别的肽段如表8所示，根据识别率为50％以上时，确定为主要表位。结果显示，本实验确定了七个主要识别表位：A6，A7，A8，B5，C，F4，F8，其氨基酸序列如表9所示。其中A7，A8，F4，F8可被三只兔子识别，可认为是最主要的表位。

表8不同免疫兔子识别的肽段

表9不同免疫兔子识别的肽段

3.3.2肽扫描定位关键按计算结果(见附图9)

对表位A6，A7，A8，B5，C，F4，F8进行丙氨酸(甘氨酸)的单个氨基酸替换，确定了表位中的关键氨基酸，见表10。

表10水牛乳β-乳球蛋白表位中关键氨基酸*

*粗体和下划线标注的为关键氨基酸