胶原-壳聚糖-激光微孔真皮基质复合膜的研制

摘要

胶原-壳聚糖-激光微孔真皮基质复合膜的制备。本发明公开了胶原-壳聚糖的新用途，即体外构建胶原-壳聚糖-激光微孔真皮基质复合膜。本发明还公开了胶原-壳聚糖-激光微孔真皮基质复合膜的研制方法，即将胶原、壳聚糖溶液按一定比例的混匀，注入模具中，将干燥的激光微孔真皮放入混合液中，经冷冻干燥、真空干热交联，形成胶原-壳聚糖-激光微孔真皮基质复合膜，再经60Co照射消毒备用。本发明为皮肤组织工程提供了新型生物支架材料，其具有一定的机械强度，生物相容性好，无免疫原性，来源广泛，易得，制备容易。

说明书

技术领域

本发明涉及胶原-壳聚糖-激光微孔真皮基质复合膜的新用途，尤其涉及作为皮肤组织工程支架材料的研究。本发明还涉及胶原-壳聚糖-激光微孔真皮基质复合膜的制备方法。

背景技术

在生物支架材料方面，目前开展的组织工程皮肤研究，其真皮基质多选用4-硫酸软骨素、氨基葡聚糖、聚羟基乙酸等高分子蛋白或聚合物材料，应用到创面后很快被降解吸收，所以该组织工程皮肤也仅仅是一种暂时性的生物敷料。以脱细胞真皮基质为支架，进行表皮细胞培养构建皮肤替代物，已有实验证实激光微孔真皮基质是较好的三维细胞培养支架，有助于细胞种植生长及血管化。但由于真皮基质在脱细胞处理过程中，表面的细胞锚点被破坏，影响了细胞与真皮基质的粘附。而胶原、壳聚糖已证实具有较好的生物相容性及细胞粘附性，单纯的胶原或壳聚糖载体从强度和降解速度上都难以满足组织工程细胞培养的需要，而将胶原和壳聚糖复合后，增加了载体机械强度。壳聚糖为直链氨基多糖，溶于弱酸，极易成膜，机械强度高。当与胶原分散液混合成膜时，在胶原纤维之间形成极薄的膜，增强了纤维间的拉力。当浸湿后，仍能保持挺括，易于操作。另外，壳聚糖延迟了复合载体降解开始的时间。胶原纤维在体内迅速降解，加入壳聚糖可延迟开始降解的时间，将有利于细胞和自体组织的长入，这也正是理想的组织工程支架材料所具有的特点。单纯的胶原-壳聚糖膜在体内仍能降解，且机械强度达不到要求，而激光微孔脱细胞真皮基质在体内短时间内不易降解，可满足皮肤要求的机械强度，故胶原-壳聚糖-微孔真皮基质复合膜在理论上推测可成为理想的皮肤组织工程支架材料。

专利号为ZL 03139063.3的国家发明专利介绍的胶原复合支架材料包括胶原和水溶性多糖，该支架虽具有良好的渗透性、透水汽性和吸收性。但该材料在体内易降解，且机械强度不够，达不到临床应用要求。专利号为US 5282,859的美国专利介绍的双层人工皮肤，表皮层为高纯度的微孔胶原凝胶膜，真皮层为培养有成纤维细胞的多孔胶原海绵，戊二醛交联提高它的抗张强度，但其抗张强度达不到临床应用的要求，而且降解速率太快、且戊二醛对细胞有毒性。专利号为CN1387,923的中国专利公开了一种异种无细胞真皮支架及其制备方法，该支架系用胰蛋白酶和戊二醛处理乳猪皮而得，其抗张强度高、降解速率可控，组织相容性好，但渗透性差，创面易产生积液、积气，血管化慢。本发明将胶原-壳聚糖与微孔脱细胞真皮基质复合，采用干热物理交联，既克服了细胞吸附、生物相容性及渗透性差等缺点，又克服了复合膜机械强度不够的缺点。

发明内容

本发明的任务之一是胶原-壳聚糖-激光微孔真皮基质复合膜的研制，即作为皮肤组织工程生物支架材料。

本发明的另一任务是提供胶原-壳聚糖-激光微孔真皮基质复合膜的研制方法。

本发明胶原-壳聚糖-激光微孔真皮基质复合膜的研制方法，将胶原、壳聚糖溶液按一定比例的混匀，注入模具中，将干燥的激光微孔真皮放入混合液中，经冷冻干燥、真空干热交联，形成胶原-壳聚糖-激光微孔真皮基质复合膜，再经⁶⁰Co照射消毒备用。

本发明胶原-壳聚糖-激光微孔真皮基质复合膜的研制方法，其中所说的胶原与壳聚糖的比例是将0.5％壳聚糖(1％乙酸溶解)，3g/L胶原溶液(0.1％乙酸溶解)按3∶7的比例在冰浴条件下混合并注入模具中，将干燥后的微孔异体脱细胞真皮小心放入混合液中并铺平，-80℃冰箱预冷8小时；将模具转移至预冷的冷冻干燥机中，冷冻干燥24小时；取出模具，1mol/LNaOH处理1小时后，用蒸馏水冲洗至中性，再次预冷后冷冻干燥，并置于100℃，10^-2mmHg真空干燥箱中24h干热交联，封装后⁶⁰Co照射消毒备用。

为了更好的理解本发明胶原-壳聚糖-激光微孔真皮基质复合膜的研制效果，下面通过实验研究结果加以证明。

扫描电镜结果显示复合膜支架有良好的微孔结构，很多小孔均匀分布，小孔之间互相连接无封闭空间(图1)。成纤维样细胞接种在复合膜支架上培养3天后可见细胞粘附到支架表面，并且渗透到微孔内部，多数为圆形。随时间推移，细胞外基质分泌逐渐增多，培养5天的细胞其细胞外基质的分泌明显多于3天的细胞。培养7天后，细胞数目明显增多，在支架表面融合形成一细胞单层，支架被细胞覆盖，细胞成多角形改变(图2)。

附图说明

图1胶原-壳聚糖-激光微孔真皮复合膜的超微结构

图2胶原-壳聚糖-激光微孔真皮复合膜大体观察及细胞粘附生长情况

具体实施方式

胶原-壳聚糖-微孔真皮基质复合膜的制备和消毒处理将0.5％壳聚糖(1％乙酸溶解)，3g/L胶原溶液(0.1％乙酸溶解)按3∶7的比例在冰浴条件下混合并注入模具中，将干燥后的微孔异体脱细胞真皮小心放入混合液中并铺平，-80℃冰箱预冷8小时；将模具转移至预冷的冷冻干燥机中，冷冻干燥24小时；取出模具，1mol/LNa0H处理1小时后，用蒸馏水冲洗至中性，再次预冷后冷冻干燥，并置于100℃，10^-2mmHg真空干燥箱中24h干热交联，封装后⁶⁰Co照射消毒备用。

将脐带间充质干细胞用0.25％胰蛋白酶消化清洗后，用DMEM/F12混合培养基重新悬浮制成细胞悬液，取出胶原-壳聚糖-微孔真皮基质复合膜，用无菌剪刀剪成需要面积大小的膜片放入培养皿中，将细胞悬液滴加至材料上，孵育2小时后，加入需要量的培养基进行培养，每2天换液一次，观察并记录，以检测复合膜的超微形态结构及生物相容性。