一种用于Vero细胞微载体培养的无动物来源成分无血清培养基

摘要

本发明公开了一种用于Vero细胞微载体培养的无动物来源成分无血清培养基。该无血清培养基由DMEM/F12(1∶1)培养基和表皮生长因子、胰岛素、血清胺、金精三羧酸、生物素、维生素C、氨基酸、果糖、海藻糖、微量元素、羟丙基-β-环状糊精等培养基添加成分组成。本发明提供的无血清培养基具有以下优点：①能够支持Vero细胞在组织培养瓶和微载体的表面贴附生长，细胞由含血清培养基转入无血清培养基培养无需经过适应过程。②不含动物来源成分、化学成分基本明确、成本低廉。③细胞生长良好，细胞形态、密度、活力与含血清培养基基本相同。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于Vero细胞微载体培养的无血清培养基，更具体地说是用于Vero细胞微载体固定化培养的无动物来源成分无血清培养基，属于细胞工程技术领域。

背景技术

Vero细胞(African green kidney cell，Vero cell)是世界卫生组织和我国生物制品规程赞同的疫苗生产细胞系，是现阶段病毒疫苗生产的最主要细胞基质。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其它一些传代细胞基质相比，Vero细胞具有以下特点：①来源方便，可连续传代，生长速度快；②对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高；③遗传性状稳定，恶性转化程度低，生物安全性较高；④培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器实施大规模培养。

Vero细胞的贴附依赖生长特性，决定了其需要在适宜的介质表面贴附、铺展为前提的贴壁培养(anchorage-dependent culture)模式。Vero细胞贴壁培养的最经典和简便方法是以组织培养瓶(T-flask)和转瓶(roller bottle)的内表面为介质贴附生长。这些培养体系所能提供的细胞生长面积有限，细胞培养规模的放大只能依赖培养单元的增加，由此给疫苗生产带来诸如污染风险大、生产效率低、产品质量可控性差以及人力资源需求大等弊端。微载体培养(microcarrier culture)是融合悬浮培养优点的一种特化的细胞贴壁培养模式。其基本特征是细胞贴附于微载体表面并随其共同悬浮于培养基中生长。微载体的应用不仅大大增加了单位培养体积中细胞赖以生长的表面积，同时也加大了细胞培养过程监测和控制以及细胞培养规模放大的可实施程度。

疫苗的接种对象主要是针对大范围的健康人群，其质量和安全性一直是备受关注的首要问题。疫苗的质量和安全性在很大程度上取决于疫苗的生产方式和过程。血清是一种组份复杂而尚不完全明确的混合物，其中，至少含有1000种不同蛋白质，总蛋白量高达60-150g/L。它能为细胞的体外培养提供必要的生长因子、激素、细胞贴附因子和营养成分。受Vero细胞自身的贴附依赖生长特性和动物细胞培养技术发展进程的影响，本世纪之前的Vero细胞培养及病毒疫苗生产均存在着对血清的依赖。血清组分的复杂性和不确定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量。从病毒疫苗生产工艺角度的考虑，血清组分的复杂性和批次间的质量差异增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度；从病毒疫苗的安全性考虑，血清中潜在的病原微生物，如引起牛海绵状脑炎(bovine spongiform encephalopathy)的朊病毒，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患。

由血清使用所造成的细胞培养过程和细胞表达产物安全性的不确定因素增加的现实问题，成为动物细胞无血清培养技术研究和应用的发展动因。随着动物细胞无血清培养技术的不断进步，为包括Vero细胞在内的动物细胞大规模无血清培养技术的应用提供了必要的技术支撑，无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。美国、欧盟和日本等发达国家将于2010年全面停止在生物制药中应用血清，FDA将停止含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。

培养基是影响体外培养细胞的形态、生长、代谢、增殖乃至生存的最直接和最重要的环境因素。由于Vero细胞的培养需要在适宜的介质表面贴附、铺展才开始有丝分裂、增殖，病毒的有效感染和增殖也有赖于细胞的贴附生长状态，适用于Vero细胞微载体培养的无血清培养基应能有效地支持细胞在微载体表面的贴附、铺展。由此，不仅提高了Vero细胞无血清培养基配方成分的复杂程度，也加大了Vero细胞无血清培养基的成本控制压力。

文献报道的Vero细胞无血清培养基包含牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、动物明胶(胶原)等动物来源的添加成分。含BSA、动物明胶(胶原)等动物来源添加成分的无血清培养基在很大程度上遗留着动物来源血清在动物细胞培养的应用中可能产生的上述问题。

尽管国外已有多种商品化的Vero细胞无血清培养基上市，如美国Invitrogen公司的VP-SFM和OptiPro SFM、AXCELL Biotechnologies公司的MDSS2、JRH公司的EX-CELL^TMVERO等。但商品化的Vero细胞无血清培养基不同程度存在诸如培养基大多以液体的形式提供、价格昂贵、培养基的成分配方秘而不宣、细胞由含血清培养基转入无血清培养基培养存在适应过程等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于Vero细胞体外培养的无血清培养基，该培养基具有不含动物来源成分、能支持Vero细胞贴附于微载体表面快速生长、Vero细胞由含血清培养基转入无血清培养基培养无需经过适应过程的特点。

本发明采用的构思在于：1)合成培养基中缺少能支持动物细胞贴附培养的成分，补充某些具有促进细胞贴附和伸展的成分方可支持Vero细胞贴附于微载体表面生长；2)某些在常规使用浓度或单独使用时不具有明显促进细胞黏附作用的培养基成分，在较高使用浓度和/或联合使用时可表现为明显的促进细胞黏附和伸展的效应3)在合成培养基中加入某些激素和生长因子能有效地促进Vero细胞的分裂增殖；4)合成培养基的配方均不是针对Vero细胞而设计的，虽然其能基本满足Vero细体外胞培养的营养需求，但其中的碳水化合物、氨基酸和无机盐等成份仍存在较大的调整和优化空间。基于以上考虑，本发明的无血清培养基在DMEM/F12(1∶1)培养基中加入了以下成分；

(1)表皮生长因子：具有促进多种类型细胞有丝分裂的作用。

(2)胰岛素：促进细胞对葡萄糖和氨基酸的摄取、促进细胞生长。

(3)血清胺：广泛存在于哺乳动物组织中的血管收缩剂和平滑肌收缩刺激剂，具有促进体外培养细胞黏附和生长的作用。

(4)金精三羧酸：金属鳌合剂，具有结合、运输和传递Fe²⁺，部分地替代铁转运蛋白的功能，同时也能通过结合和运输Ca²⁺、Me²⁺促进细胞的黏附和伸展。

(5)微量元素：Cu、Fe、Se、Ze和Mg等微量元素，主要作为酶的辅基参与细胞代谢的调节。其中：

Cu：超氧化物岐化酶的辅基、具有抗氧化的作用。

Fe：细胞色素酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等和血红素的辅基，参与线粒体呼吸链的组成。

Se：谷胱甘肽还原酶的组成部分、具有抗氧化的作用。

Zn和Me：作为酶的辅基与200多种酶的活性或结构有关，参与细胞生长、蛋白质合成和核酸代谢的调控。此外Me还通过作用于细胞膜表面的整联蛋白介导细胞的黏附和伸展。

(6)氨基酸：培养基中氨基酸的浓度通常限制着细胞生长所能达到的最大密度及细胞活力状态，不同细胞对氨基酸的需求可能存在明显的差别，这些氨基酸既包括特定细胞类型不能合成的必需氨基酸，也包括细胞能够合成，但消耗速率大于细胞合成能力的非必需氨基酸。此外，某些氨基酸在较高的浓度范围内具有促进细胞黏附的作用。

(7)生物素：参与羧化、糖原异生和蛋白质合成等生化反映，对体外培养细胞的生长和黏附具有一定的促进作用。

(8)单糖和双糖：果糖可部分地替代葡萄糖作为细胞生长代谢的能量来源之一、减少培养基中因葡萄糖无氧酵解产生的乳酸堆积。海藻糖是由两个葡萄糖分子结合而成的非还原性双糖，对激素、生长因子和酶等生物大分子具有非特异的保护作用，也可作为细胞代谢的能源物质。

(9)乙醇胺：磷脂和细胞膜合成的前体物质，对细胞的生长具有一定的促进作用。

(10)维生素C：参与生物氧化和还原及细胞呼吸过程，具有促进酪氨酸和色氨酸代谢以及胶原合成作用。

(11)羟丙基-β-环状糊精：贮存和运送生物大分子，提高生物活性物质的稳定性和生物利用度。

根据以上发明构思，本发明在DMEM/F12(1∶1)培养基的基础上，将上述物质按以下浓度(mg/L)加入到培养基中，组成了一种新的能支持Vero细胞微载体培养的无血清培养基(表1)。

表1支持Vero细胞微载体培养的无动物来源成分无血清培养基

                                                      

组成成分                    含量(mg/L)

                                                      

DMEM/F12(1∶1)培养基        15600

表皮生长因子                0.025～0.05

胰岛素                      2.5～10

金精三羧酸                  0.005～0.02

血清胺                      0.005～0.02

谷氨酰胺                    125～250

胱氨酸                      25～50

精氨酸                      100～200

甲硫氨酸                    50～100

丝氨酸                      25～50

天冬酰胺                    50～100

酪氨酸                      250～500

果糖                        1000～2000

海藻糖                      100～500

维生素C                     25～50

生物素                      0.01～0.02

CuSO₄·5H₂O                 0.001～0.002

FeSO₄·7H₂O                 0.5～1.5

Na₂SeO₃                     0.005～0.01

ZnSO₄·7H₂O             0.1～0.2

MeCl₂                   25～50

乙醇胺                  2.5～5

羟丙基-β-环状糊精      250～500

                                                      

本发明提供的无血清培养基与现有Vero细胞无血清培养基相比具有以下优点：①能够支持Vero细胞在组织培养瓶和微载体的表面贴附生长，细胞由含血清培养基转入无血清培养基培养无需经过适应过程。②不含动物来源成分、化学成分基本明确、成本低廉。③细胞生长良好，细胞密度、形态和活力与含血清合成培养基本相同。

下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1A为倒置显微镜下观察的、在本发明无血清培养基中生长的Vero细胞；

图1B为倒置显微镜下观察到的、在含血清培养基中生长的Vero细胞；

图2A为倒置显微镜下观察的、在本发明无血清培养基中贴附于Cytodex 1表面生长的Vero细胞；

图2B为倒置显微镜下观察到的、在含血清培养基中贴附于Cytodex 1表面生长Vero细胞；

图3为Vero细胞分别在本发明无血清培养基中和含血清培养基中微载体固定化培养的细胞密度变化。无血清培养基中的Vero细胞密度(○)；血清培养基中的Vero细胞密度(▲)。

具体实施方式

原材料来源：

DMEM/F12(1∶1)培养基购自美国HyClone公司。胰岛素、表皮生长因子、金精三羧酸、血清胺、生物素、海藻糖、果糖、维生素C、CuSO₄·5H₂O、FeSO₄·7H₂O、Na₂SeO₃、ZnSO₄·7H₂O、MeCl₂、乙醇胺和羟丙基-β-环状糊精购自美国Sigma公司。谷氨酰胺、胱氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、天冬酰胺和酪氨酸为美国Invitrogen公司产品。

实施例1在100ml组织培养瓶中贴附培养Vero细胞

将表2所列培养基成分定溶于1000ml去离子水中，室温下搅拌30min，使其充分溶解。用0.2μm滤膜过滤除菌后，置4℃冰箱保存。

表2在100ml组织培养瓶中培养Vero细胞的无血清培养基

                                         

组成成分                含量(mg/L)

                                         

DMEM/F12(1∶1)培养基    15600

表皮生长因子            0.025

胰岛素                  2.5

金精三羧酸              0.005

血清胺                  0.005

谷氨酰胺                125

胱氨酸                  25

精氨酸                  100

甲硫氨酸                50

丝氨酸                  25

天冬酰胺                50

酪氨酸                  250

果糖                    1000

海藻糖                  100

维生素C                 25

生物素                  0.01

CuSO₄·5H₂O             0.001

FeSO₄·7H₂O             0.5

Na₂SeO₃                 0.005

ZnSO₄·7H₂O             0.1

MeCl₂                   25

乙醇胺                  2.5

羟丙基-β-环状糊精      250

                                         

将在100ml组织培养瓶中用含5％(v/v)小牛血清的DMEM/F12培养基培养的Vero细胞用0.25％(w/v)的胰蛋白酶室温下消化2min。分别用表2所列的无血清培养基和含5％(v/v)小牛血清的DMEM/F12分散细胞、调整细胞悬液浓度为2×10⁵cells/ml。按10ml/瓶接种100ml组织培养瓶，37℃、5％CO₂静止培养，用倒置显微镜观察细胞形态并拍照纪录。根据培养基的颜色变化，每天按50～100％培养体积分别更换新鲜培养基。培养3d后，Vero细胞在含5％(v/v)小牛血清的DMEM/F12和本发明无血清培养基中汇合成单细胞层、细胞形态呈现多角形上皮样细胞特征，如图1B和图1A所示。

实施例2在250ml搅拌培养瓶中微载体固定化培养Vero细胞

将在100ml组织培养瓶中用含5％(v/v)小牛血清的DMEM/F12培养基培养的Vero细胞用0.25％(w/v)的胰蛋白酶室温下消化2min。分别用表3所列的无血清培养基和含5％(v/v)小牛血清的DMEM/F12分散细胞，随同经预处理的Cytodex 1微载体(使用浓度为2mg/ml)接种250ml搅拌培养瓶，接种密度为3×10⁵cells/ml、培养体积为100ml/瓶。37℃、5％CO₂、30r/min悬浮培养，根据培养基的颜色变化，每天按50～100％培养体积分别更换新鲜培养基，整个培养过程持续7d。每隔24h取样用倒置显微镜观察细胞形态用细胞密度和活力自动分析系统(CedexA20，Innovatis)计数细胞密度。

表3在250ml搅拌培养瓶微载体固定化培养Vero细胞的无血清培养基

                                           

组成成分                含量(mg/L)

                                           

DMEM/F12(1∶1)培养基    15600

表皮生长因子            0.05

胰岛素                  10

金精三羧酸              0.02

血清胺                  0.02

谷氨酰胺                250

胱氨酸                  50

精氨酸                  200

甲硫氨酸                100

丝氨酸                  50

天冬酰胺                100

酪氨酸                  500

果糖                    2000

海藻糖                  500

维生素C                 50

生物素                  0.02

CuSO₄·5H₂O             0.002

FeSO₄·7H₂O             1.5

Na₂SeO₃                 0.01

ZnSO₄·7H₂O         0.2

MeCl₂               50

乙醇胺              5

羟丙基-β-环状糊精  500

                                           

培养5d后，用含5％(v/v)小牛血清的DMEM/F12和本发明无血清培养基培养的Vero细胞均在Cytodex 1微载体表面形成致密单层、细胞形态仍保持多角形上皮样细胞特征，如图2B和图2A所示。培养7d后，Vero的细胞密度由接种时的3×10⁵cells/ml增加到的培养结束时的23.4×10⁵cells/ml，如图3所示。

本发明的特定实施例已经对本发明的内容做了详尽的说明。对本领域的一般技术人员而言，在不背离本发明精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，特别是对若干步骤的等同替换，都构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。