转化奎宁酮为R-3-奎宁醇的酵母菌株及其转化方法

摘要

本发明涉及一种利用奎宁酮生产R-3-奎宁醇的酵母菌株及其生产方法，本发明涉及的酵母菌株为深红酵母Rhodotorula rubra X15，现保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No：3664，本发明涉及的生产方法采用如下步骤：1、种子活化培养，2、发酵扩大培养，3、取发酵培养液，离心收集并洗涤菌体，再加入底物奎宁酮盐酸盐，添加葡萄糖，在摇床上反应72～84小时后，蒸干溶液，用二氯甲烷溶解搅拌，滤除不溶物，减压蒸除溶剂，得到白色固体R-3-奎宁醇。采用本发明可以得到产物产率高、纯度高的R-3-奎宁醇，且其方法对环境无破坏、能耗低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种发酵奎宁酮生产R-3-奎宁醇的酵母菌株及其生产方法。

背景技术

目前，大多数药物以外消旋体药物为主，而以光学纯的对映体作为药物是绝大多数手性药物的发展趋势。

3-奎宁酮盐酸盐(C₇H₁₁NO·HCl，CAS No：1193-65-3)，是一种用于合成阿扎司琼、帕洛诺司琼的一种中间体，结构中含有潜手性酮基。

R-3-奎宁醇，化学名：R-(-)-1-氯杂双环[2.2.2]辛-3-醇，分子式为C₇H₁₃NO，分子量为127.18，CAS登录号：25333-42-0，R-3-奎宁醇纯品为白色晶体，其熔点为217～224℃，沸点为120℃，比旋光度为-44.5°，在水里的溶解度为100g/100mL；R-3-奎宁醇是很多抗胆碱药物的重要中间体，例如索利那辛、瑞伐托酯等都是含有R-3-奎宁醇结构的最新抗胆碱药物，其对于治疗尿失禁和慢性阻塞性肺病有很好的疗效。R-3-奎宁醇盐酸盐(C₇H₁₃NO·HCl CAS No：42437-96-7)，是3-奎宁酮还原得到单一旋光性的手性物质，是一种用于合成各类药物的重要手性醇，如用于治疗老年痴呆症的他沙立定(Talsaclidine)和用于治疗慢性肺栓塞的瑞伐托酯(Revatropate)等。

现有的合成R-3-奎宁醇的方法主要有化学合成和微生物合成两种方法。

化学方法合成：

1、以4-乙烯基吡啶为原料合成3-奎宁醇；

4-乙烯基吡啶在冷的高锰酸钾盐水溶液中被氧化为(4-吡啶)-1，2-乙二醇，(4-吡啶)-1，2-乙二醇在酸性环境中被氢化为相应的哌啶乙二醇盐酸盐，哌啶乙二醇盐酸盐在300℃下在活性氧化铝的催化下生成3-奎宁醇。

2、以3-奎宁酮为原料合成3-奎宁醇

3-奎宁酮在乙醇中经过硼氢化钠还原以后得到3-奎宁醇，此反应在乙醇中进行非常迅速，是制备3-奎宁醇比较实用的方法。

化学合成法多以奎宁酮为反应前体，过渡元素为手性催化剂，通过多步反应得到R-3-奎宁醇，反应步骤多，副反应多，理论产率只有50％，并且奎宁醇的光学活性不高，对环境污染严重。

酶或微生物制备法：

3、2003年M.Ikunaka报道了一种用蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的蛋白酶来拆分3-奎宁醇衍生物的方法，转化率达到了42％，ee值达96％。但是这种外消旋物质酶动力学拆分的理论最大转化率为50％，并有衍生反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够高效地用奎宁酮生产R-3-奎宁醇的酵母菌株及其生产方法。

本发明是采用如下技术方案实现的：一株转化奎宁酮为R-3-奎宁醇的酵母菌株，命名为深红酵母Rhodotorula rubra X15，在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No：3664。

一种利用酵母菌株转化奎宁酮为R-3-奎宁醇的方法，其采用如下步骤：

(1)、种子活化培养；

(2)、发酵扩大培养；

(3)、取发酵扩大培养所得的深红酵母发酵液，离心收集菌体，得湿菌体，在磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中洗涤后重新悬浮于同一缓冲液中，再加入底物奎宁酮盐酸盐，添加葡萄糖，在30℃、摇床上反应，反应72～84小时后，蒸干溶液，用二氯甲烷溶解搅拌，滤除不溶物，减压蒸除溶剂，得到白色固体R-3-奎宁醇。

深红酵母菌落特征：菌落为深红色，圆形，隆起，不透明，表面光滑，湿润，边缘整齐；深红酵母细胞为圆形或椭圆形，通过革兰氏染色为阳性菌，单端出芽生殖，无假菌丝生成，经生理生化和18S rRNA鉴定，鉴定为深红酵母Rhodotorula rubra，命名为Rhodotorula rubra X15。

本发明的有益效果是，本发明利用酮基还原酶或者具有还原酶活性的微生物静息细胞催化底物奎宁酮，底物无需衍生化处理，只需一步还原反应就可得到反应物，理论产率100％，更由于酶的高特异性，R-3-奎宁醇的光学纯度在97％e.e.，采用固定化深红酵母全细胞催化还原奎宁酮盐酸盐，反应转化率达到86％，R-3-奎宁醇的光学纯度达到99.3％，这种方法反应条件温和、反应步骤少、能量消耗少、产率高、产物纯度高，属于环境友好、可持续型生产方式。

具体实施方式

实施例1

一株转化奎宁酮为R-3-奎宁醇的酵母菌株，命名为深红酵母Rhodotorularubra X15，在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No：3664。

一种利用所述的酵母菌株转化奎宁酮为R-3-奎宁醇的方法，采用如下步骤：

(1)种子活化：将深红酵母Rhodotorula rubra X15菌株从保存的甘油菌转接于种子液体培养基中，于30℃、150～250rpm培养24h。取培养好的菌悬液稀释，均匀涂布到种子固体平板培养基中，25℃培养箱培养48h后，用牙签挑单菌落再次接种于种子液体培养基试管中，30℃、150～250rpm培养过夜，取5mL培养好的菌悬液转接到装有150mL种子液体培养基的500mL三角瓶中置摇床30℃振荡培养，转速为150～250rpm。

所述种子固体培养基：蛋白胨5g/L，酵母膏15g/L，氯化钠4g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，pH为5.0，种子液体培养基为缺少琼脂的种子固体培养基。

(2)发酵培养，培养基配方：葡萄糖12g/L，蛋白胨0.5g/L，酵母膏0.5g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸铵0.15g/L，2mol/L盐酸调pH为5.0，在接种量为6％，转速450r/min，通气量为6L/min的条件下，经30℃，3天的发酵培养，得深红酵母发酵液；

(3)取6L深红酵母发酵液，离心收集菌体，得到10g湿菌体，在用20mmol/L、pH为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤2次后重新悬浮于100ml同一缓冲液中，再加入10g/L、pH为7.0的100ml的底物奎宁酮盐酸盐，添加葡萄糖0.2g，在30℃，160r/min的摇床上反应，反应72小时后，在100℃条件下蒸干溶液，用纯度大于99.0％的二氯甲烷溶解搅拌1小时，滤除不溶物，在-0.85Mpa，35～40℃条件下减压蒸除溶剂，得到白色固体R-3-奎宁醇0.866g，利用HPLC检测固体纯度，奎宁醇纯度为99.0％，奎宁酮及其他杂质为1％。

R-3-奎宁醇ee值采用3-奎宁醇衍生成苯甲酸3-奎宁酯，然后用HPLC检测。首先将0.123mL的苯甲酰氯滴入含有少量三乙胺的二氯甲烷中，0.5小时后加入0.1g的本反应完成后的R-3-奎宁醇，常温搅拌4～6小时，将溶剂减压蒸除，直接溶于纯度大于99.0％的乙酸乙酯，并用HPLC测定ee值。色谱条件如下，柱型：Chiralpak AD-H，柱温：25℃，流动相速度：1mL/min，检测波长：254nm，流动相比例：97％正己烷，3％异丙醇。经HPLC测定，本反应完成后的R-3-奎宁醇的ee值为99.3％。

实施例2

一种利用所述的酵母菌株转化奎宁酮为R-3-奎宁醇的方法，采用如下步骤：

(1)种子活化：将深红酵母Rhodotorula rubra X15菌株从保存的甘油菌转接于种子液体培养基中，于30℃、130～270rpm培养24h。取培养好的菌悬液稀释，均匀涂布到种子固体平板培养基中，30℃培养箱培养48h后，用牙签挑单菌落再次接种于种子液体培养基试管中，30℃、150～250rpm培养过夜，取5mL培养好的菌悬液转接到装有150mL种子液体培养基的500mL三角瓶中置摇床30℃振荡培养，转速为150～250rpm。

所述种子固体培养基：蛋白胨5g/L，酵母膏15g/L，氯化钠4g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，pH为5.0，种子液体培养基为缺少琼脂的种子固体培养基。

(2)发酵培养，培养基配方：葡萄糖15g/L，蛋白胨0.5g/L，酵母膏0.5g/L，硫酸镁0.1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸铵0.15g/L，调pH为5.0，在接种量为6％，转速450r/min，通气量为6L/min的条件下，经30℃，3天的发酵培养，得深红酵母发酵液；

(3)取6L深红酵母发酵液，离心收集菌体，得到10g湿菌体，在用20mmol/L、pH为7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤2次后重新悬浮于100ml同一缓冲液中，再加入10g/L、pH为7.0的100ml的底物奎宁酮盐酸盐，添加葡萄糖0.2g，在30℃，160r/min的摇床上反应，反应84小时后，在100℃条件下蒸干溶液，用纯度大于99.0％的二氯甲烷溶解搅拌1.5小时，滤除不溶物，在67Kgf/cm²，35～40℃条件下减压蒸除溶剂，得到白色固体R-3-奎宁醇0.867g，利用HPLC检测固体纯度，奎宁醇纯度为99.1％，奎宁酮及其他杂质为1％。

R-3-奎宁醇ee值的检测方法同实施例1，测得R-3-奎宁醇ee值为99.4％。