一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒

摘要

本发明公开了一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒，涉及一种人兽共患传染病病原体的基因检测技术，适用于布鲁菌定性检测。本发明由标准阳性模板、PCR反应液、布鲁菌BCSP31基因特异性引物、阴性质控标准品组成。本发明检测速度快，特异性好，灵敏度高，使用步骤简单，可重复性高，可以替代传统的病原学检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及布鲁菌的检测分析技术，尤其公开了公开一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒，属于生物检测技术领域。

背景技术

布鲁菌病是由布鲁菌(Brucella)引起的一种全世界范围的人兽共患传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病。主要引起许多家畜和野生动物流产，人类通过食用未巴氏消毒的牛奶及奶制品或直接与感染动物或尸体接触而感染，临床上表现为发热(波浪热)、寒战、头痛、全身疼痛、疲劳、脑神经功能障碍、关节炎等非特异性症状。布鲁氏菌是一种革兰氏阴性胞内寄生菌，传统上可分为6个种，即羊种布鲁菌(B.melitensis)，牛种布鲁菌(B.abortus)，猪种布鲁菌(B.suis)，绵羊附睾种布鲁菌(B.ovis)，沙林鼠种布鲁菌(B.neotomae)和犬种布鲁菌(B.canis)。其中，羊种布鲁菌、牛种布鲁菌和猪种布鲁菌是直接危害人类健康，严重困扰畜牧业发展的主要病原菌，给奶牛业造成巨大的经济损失。

目前，布鲁菌病的诊断手段主要包括病原分离鉴定、虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、PCR等，用常规方法分离鉴定病原条件要求苛刻，且费力、费时、危险性高、成功率低。RBT和SAT特异性不高、敏感性低；CFT操作繁琐，实验条件和技术水平要求高，实践应用极为不便。PCR方法是这些方法中特异性最强、敏感性最高。在欧美的一些发达国家已经把PCR作为布鲁菌病病原诊断的一种工具。国内对于布鲁菌病的检疫诊断还相对比较落后，国内很多实验室建设仍然还是空白，对该病的检测仍然采用RBT、SAT和CFT，远不能满足实际需要。因此，开发简便易行、快速、灵敏、特异的分子生物学技术已成为主要的发展趋势。

发明内容

本发明公开了一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒，适用于牛粪便样品中布鲁菌定性检测。

本发明提供的快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒包括：

由DNA提取液、PCR反应液、标准阳性模板、布鲁菌BCSP31基因特异性引物对和阴性质控标准品组成；其中，

正向引物F_BCSP31：5′-GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3′；

反向引物R_BCSP31：5′-GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3′；

标准阳性模板含有布鲁菌高度保守基因的301个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。

PCR反应液：由正反向引物FB_CSP31和R_BCSP31，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，dNTPs及无菌双蒸水组成。

布鲁菌标准阳性模板所包含的BCSP31基因的核苷酸序列为：

5′-ggacctagcattcttcacatccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatccagaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagaggactggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggagcgagctttgc-3′

本发明所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)DNA提取液：包括如下组分：PBS(137mM Nacl，2.7mM Kcl，10mM Na₂HPO₄，2mMKH₂PO₄，PH7.4)，10×TE(0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，pH 8.0)；

2)PCR反应液：由正反向引物F_BCSP31和R_BCSP31，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，dNTPs及无菌双蒸水组成；

3)标准阳性模板：含有布鲁菌高度保守基因BCSP31基因301个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒；

4)布鲁菌BCSP31基因特异性引物序列：

正向引物F_BCSP31：5′-GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3′

反向引物R_BCSP31：5′-GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3′

5)阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水。

本发明定性检测布鲁菌的方法，包括以下步骤：

1)样本的预处理，提取DNA；

2)将DNA和阳性标准品分别加入到反应液的PCR反应体系中，进行PCR检测；取PCR产物，以琼脂糖凝胶进行电泳检查，在凝胶图像分析仪上观察301bp的扩增条带。

以下实验表明试剂盒可以快速检测布鲁菌：

1)取0.5g牛粪便样品于2mL离心管中，加1mL PBS缓冲液(137mM Nacl，2.7mMKcl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，PH7.4)，充分振荡摇匀5min，500r/m离心5min，收集上清液于另一2mL离心管中，此步骤重复2次。上清液13,000r/m离心2min，弃上清，收集沉淀，用100μL 10×TE(0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA PH8.0)悬浮沉淀，先冰浴5min，然后100℃煮沸10min，13，000r/m离心2min，取上清1μL，用于PCR扩增。

2)分别取PCR反应液各49μL，取第(1)步所得布鲁菌DNA和布鲁菌阳性标准模板各1μL，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在PCR仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变性5min，94℃变性30sec、65℃退火30sec、72℃延伸30sec，扩增31个循环。最后72℃延伸5min。

3)取5μL PCR产物，以1％琼脂糖凝胶进行电泳检查，在凝胶图像分析仪上观察301bp的扩增条带。

重复试验3次，所得检测结果都相同，说明不同批次之间的检测结果具有可比性和良好的重复性。见图1。

从上述实例可以说明，PCR方法重复性好，而且PCR检测试剂盒对样品(DNA)的检测仅需3～5个小时就能完成。

本发明与现有技术相比其积极效果在于：

该PCR检测试剂盒实用性强，可直接检测牛粪便样品中的布鲁菌，3～5小时内快速出结果、灵敏度高达10pg基因组，装配成试剂盒使用安全，特异性好，使用步骤简单，可重复性好，可以对牛粪便样品中的布鲁菌进行定性检测，可以替代传统的病原学和血清学方法。

附图说明

图1为布鲁菌标准阳性模板PCR扩增图；

图中，1是DL2000DNA marker，2～5分别为牛种布鲁菌544A、牛种布鲁菌104M、羊种布鲁菌16M、猪种布鲁菌S2pMD-18重组质粒的PCR扩增结果。

图2为PCR试剂盒的特异性鉴定图；

图中，1是DL2000DNA Marker；2是牛种布鲁菌544A；3是牛种布鲁菌104M；4是羊种布鲁菌16M；5是猪种布鲁菌S2；6是鼠伤寒沙门氏菌；7是金黄色葡萄球菌；8是铜绿假单胞菌；9是猪链球菌；10是大肠杆菌；11是肺炎克雷伯氏菌；12是变形杆菌；13是多杀性巴氏杆菌；14是小肠结肠炎耶尔森菌；15是蜡样芽胞杆菌；16是猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型；17是猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型；18是猪胸膜肺炎放线杆菌血清3型；19是猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型；20是大肠杆菌O157：H7；21是纯水对照。

图3为PCR试剂盒的敏感性鉴定图；

图中，1是DL2000DNA Marker；2～5是倍比稀释牛种布鲁菌544A基因组DNAPCR扩增图，2的浓度为1×10⁴pg；3是1×10³pg；4是1×10²pg；5是1×10¹pg。

图4为临床牛粪便样品的PCR检测结果；1是DL2000 DNA Marker；2是阳性对照；3～17是临床牛粪便样品，18是纯水对照。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实验材料：牛种布鲁菌544A(B.abortus 544A)、牛种布鲁菌104M(B.abortus104M)、羊种布鲁菌16M(B.melitensis 16M)、猪种布鲁菌S2(B.suis S2)灭活菌液由中国地方病第一研究所提供，限制性内切酶、pMD18T克隆载体购自Takara公司，鼠伤寒沙门氏菌(CVCC541)、猪链球菌(CVCC606)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型(CVCC259)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型(CVCC260)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清3型(CVCC261)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型(CVCC263)均购自中国兽药监察所，金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、大肠杆菌(ATCC35218)、蜡样芽胞杆菌(CMCC(B)63301)、变形杆菌(CMCC(B)45103)均购自由中国药品生物制品检定所，小肠结肠炎耶尔森菌(ATCC9610)、大肠杆菌O157：H7(912981)、肺炎克雷伯氏菌(临床分离株，猪)、多杀性巴氏杆菌(临床分离株，猪)由本室保存。

实施例1：

试剂盒组成与配制

1)DNA提取液：配制缓冲液，包括如下组分：PBS(137mM Nacl，2.7mM Kcl，10mMNa₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，PH7.4)10×TE(0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA PH8.0)。

2)PCR反应液：配制反应液10×PCR Buffer(含Mg²⁺)10μL、dNTPs(2.5mmol/L)5μL、正向引物和反向引物各2μL(10μmol/L)、Taq酶(5U/μL)0.5μL、无菌双蒸水29.5μL；

3)标准阳性模板：标准阳性模板为含有布鲁菌高度保守基因BCSP31基因301个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒。

布鲁菌标准阳性模板所包含的BCSP31基因的核苷酸序列为：

5′-ggacctagcattcttcacatccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatccagaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagaggactggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggagcgagctttgc-3′

4)布鲁菌BCSP31基因特异性引物序列：

正向引物F_BCSP31：5′-GGACCTAGCATTCTTCACATCCAG-3′；

反向引物R_BCSP31：5′-GCAAAGCTCGCTCCCAACGCAAT-3′

5)阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水。

实施例2：

试剂盒的特异性试验

用经过DNA有效性验证鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、猪链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽胞杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清3型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型、大肠杆菌O157：H7等15种对照，阳性样品各1μL为模板进行PCR反应，同时设阴性对照。

PCR扩增条件为循环条件为：95℃预变性5min，94℃变性30sec、65℃退火30sec、72℃延伸30sec，扩增31个循环，最后72℃延伸5min。

结果只有牛种布鲁菌544A、牛种布鲁菌104M、羊种布鲁菌16M、猪种布鲁菌S2扩增出301bp特异性目的片段，而鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、猪链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽胞杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清3型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型、大肠杆菌O157：H7和阴性对照无条带(见图2)。上述结果说明试剂盒具有较好的特异性。

实施例3

试剂盒的敏感性试验

将牛种布鲁菌基因组DNA的浓度调整为10ng/μL，然后进行10倍系列稀释，每个稀释度取1μL作为模板，分别用所建立的PCR方法进行扩增。以出现阳性条带所用模板的最高稀释度为该方法的最低检出限。

PCR扩增条件为循环条件为：95℃预变性5min，94℃变性30sec、65℃退火30sec、72℃延伸30sec，扩增31个循环，最后72℃延伸5min。

通过试验结果确定试剂盒的敏感性为10pg基因组(见图3)。

实施例4

试剂盒对临床牛粪便样品的检测

用试剂盒检测106份牛粪便样品，并于虎红平板凝集试验结果进行比较。结果试剂盒能从106份牛粪便样品中检出9份布鲁菌感染阳性样品，与虎红平板凝集试验的阳性符合率为100％。部分临床牛粪便样品的PCR检测结果见图4。

序列表

<110>吉林大学

<120>一种快速检测牛粪便样品中布鲁菌的PCR试剂盒

<210>1

<211>301

<212>DNA

<213>布鲁菌(Brucella)

<220>

<221>启动子(promoter)

<222>(1)..(301)

<223>

<400>1

ggacctagca ttcttcacat ccaggaaacc cgactatgcc attcgccgcc tgatgcaggg 60

ttttgggctg cgtttttaat cgtttcagtc ggctctggcg gcgcttgtcg gcaagcgatt 120

gtattctttg ggaaaatcca gaataatgga atgcggtggt tgacaatcgg cctcaagctt 180

cctatggttt tcggcataat ctatgcggga agaggactgg tattatgaaa ttcggaagca 240

aaatccgtcg cttggctgtt gcggcggtgg cgggcgcgat tgcgttggga gcgagctttg 300

c                                                                 301

 

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(24)

<223>

<400>2

 

ggacctagca ttcttcacat ccag                                24

 

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222>(1)..(23)

<223>

<400>3

 

gcaaagctcg ctcccaacgc aat                                 23