可用于高通量全自动化提取的磁珠法病毒核酸提取方法

摘要

一种可用于高通量全自动化提取的磁珠法病毒核酸提取方法，其特征在于：先用磁珠I分离病毒：从生物样品中将病毒吸附到磁珠I上，得到吸附有病毒的磁珠I，简称病毒-磁珠I复合物，外加磁场将病毒-磁珠I复合物与样品分开，将病毒-磁珠I复合物悬浮于裂解液I中，在裂解液I中病毒从磁珠I上解离，外加磁场除去磁珠I，加热使病毒裂解；再用磁珠II分离病毒核酸：用磁珠II吸附病毒裂解物中的病毒核酸，外加磁场将吸附有病毒核酸的磁珠II与病毒裂解物分开，用洗涤液洗涤吸附有病毒核酸的磁珠II后，用溶解液将病毒核酸从磁珠II上洗脱下来得到纯化的病毒核酸。本发明使用磁珠使得裂解细胞和分离病毒在一管中一步完成；使用两种磁珠实现病毒和病毒核酸的提取，使提取过程操作简便快速；无需复杂设备，易实现高通量自动化操作。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种可用于高通量全自动化提取的磁珠法病毒核酸提取方法。

背景技术

随着分子生物学的飞速发展，PCR和RT-PCR已经成为DNA病毒和RNA病毒高灵敏度检测的强有力工具。PCR和RT-PCR方法与当前的其他检测技术相比，不管是检测灵敏度，特异性还是花费时间方面都有了长足的进步，而且，由于Genbank数据库中收录了大量的病毒核酸序列，这对病毒特异的PCR引物设计提供了得天独厚的优势。随着PCR和RT-PCR在病毒检测中的应用越来越广泛，病毒核酸提取的工作量飞速增加，传统的手工操作已经不能满足疾控、血液供给筛查等领域高通量筛查的要求，采用自动化提取设备进行病毒核酸高通量自动化提取已经成为大势所趋。

传统的病毒核酸提取技术是：首先制备大量的病毒(如感染病毒的细胞)，然后破坏或者裂解病毒，释放病毒核酸进入溶液环境，然后将核酸与(病毒外壳)蛋白分离，利用有机溶剂如苯酚或氯仿抽提等方法去除蛋白质，纯化其中的核酸。此过程为手工操作，步骤繁琐、低效而且有毒不环保。

近年来，市场上也涌现了各种各样比传统技术简单方便的病毒核酸提取技术。主流技术主要有两类：基于离心柱法的病毒核酸提取技术和基于磁珠法的病毒核酸提取技术。基于离心柱法的提取技术由于与离心柱配套使用的高通量自动化离心设备成本过高，因此虽然可以实现自动化操作，但是难以普及推广，仍以手工操作为主。基于磁珠法的病毒核酸提取技术采用具有超顺磁性的磁性材料(简称磁珠)，利用基于简单的磁分离装置的自动化提取设备即可实现病毒核酸提取的高通量自动化操作，已经成为当前病毒核酸高通量自动化提取的主流技术。但目前用于提取病毒核酸的磁珠法病毒核酸提取技术都只适用于从宿主体系已经分离出来的病毒。现有的磁珠法病毒核酸提取技术中均只用到一种可用于核酸分离的磁珠，在进行病毒核酸提取前，需要对生物样品进行前处理，把病毒分离出来，然后再用可分离核酸的磁珠对分离得到的病毒进行核酸提取。常用的分离病毒的方法是先裂解细胞，然后用中性盐或聚乙二醇等试剂将病毒沉淀，再离心得到病毒；或者裂解细胞后，用羟基磷灰石等凝胶吸附病毒，再改变缓冲液条件把病毒洗脱下来。无论是沉淀离心还是凝胶吸附，都涉及复杂设备(离心机或层析设备)，这一过程很难与磁珠法病毒核酸提取技术中基于磁分离的自动化提取操作整合在一起，仍需手工操作。目前也有采用抗体包覆的磁珠分离病毒的技术，但是其后续的核酸提取并未采取磁分离法。同时针对不同类病毒需要包覆不同的抗体，该技术不具有通用性。因此目前报道的磁珠法病毒核酸提取技术均无法实现具有通用性的从病毒提取到病毒核酸提取整个过程的高通量全自动化操作。

发明内容

本发明的目的就是克服现有技术的不足，提供一种可用于高通量全自动化提取的磁珠法病毒核酸提取方法。

为实现上述目的，本发明提供一种可用于高通量全自动化提取的磁珠法病毒核酸提取方法，其特征在于包括下列步骤：

1、先用磁珠I分离病毒：从生物样品中将病毒吸附到磁珠I上，得到吸附有病毒的磁珠I，简称病毒-磁珠I复合物，外加磁场将病毒-磁珠I复合物与样品分开，将病毒-磁珠I复合物悬浮于裂解液I中，在裂解液I中病毒从磁珠I上解离，外加磁场除去磁珠I，加热使病毒裂解；

2、再用磁珠II分离病毒核酸：用磁珠II吸附病毒裂解物中的病毒核酸，外加磁场将吸附有病毒核酸的磁珠II与病毒裂解物分开，用洗涤液洗涤吸附有病毒核酸的磁珠II后，用溶解液将病毒核酸从磁珠II上洗脱下来得到纯化的病毒核酸。

所述磁珠I具有可吸附病毒的特征，它包含两个部分，一部分是可吸附病毒的凝胶；另一部分为具有超顺磁性的磁性纳米粒子Fe、Co、Ni、Fe₂O₃、Fe₃O₄、Co₂O₃、Co₃O₄中一种或两种以上的混合物。

所述可吸附病毒的凝胶为羟基磷灰石凝胶或焦磷酸镁凝胶。

本发明中使用的磁性纳米粒子可购买商品化的成品，也可利用文献公开报道的方法直接合成。

所述磁珠II为二氧化硅磁性复合微粒，具有可吸附病毒核酸的特征，它包含两个部分，一部分为二氧化硅，或者是用氨基或羧基修饰的高聚物聚乙烯醇、多糖、硅树脂、聚苯乙烯中一种或两种以上的混合物；另一部分为具有超顺磁性的磁性纳米粒子：Fe、Co、Ni、Fe₂O₃、Fe₃O₄、Co₂O₃、Co₃O₄中一种或两种以上的混合物。(见专利申请号200810050941.0)

所述裂解液I能够使吸附于磁珠I表面的病毒解离，并促进病毒在加热条件下裂解，还能促进病毒核酸吸附于磁珠II，其包含使吸附于磁珠I表面的病毒解离的物质。对羟基磷灰石磁珠来说，使吸附于其表面的病毒解离的物质为50-500mmol/L磷酸缓冲液，而使焦磷酸镁磁珠表面病毒解离的物质为0.3mol/L枸椽酸钠溶液，裂解液I还包含但不限于0-2mol/L离液盐和/或0-50mmol/LEDTA和调节pH在3.5-7.0的缓冲液。

所述离液盐为盐酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钾中一种或两种以上的混合物。

所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)中一种或两种以上的混合物。

所述洗涤液和溶解液是本技术领域所采用的各种洗涤液和溶解液。例如，洗涤液为75％乙醇，溶解液为无RNase的水。

所述病毒核酸包括RNA或DNA。

本发明中使用的磁珠II可购买商品化的成品，也可利用文献公开报道的方法直接合成。

对于有细胞液体样品如细胞、全血、动物组织匀浆液、植物组织匀浆液等，需要在用磁珠I分离病毒之前用裂解液II裂解生物样品中的细胞。

裂解细胞用的裂解液II可以彻底裂解细胞而保持病毒完整性，其成分为离液盐、尿素、去垢剂、EDTA、还原剂、蛋白酶中的一种或两种以上的混合物，还包含调节pH范围在3.5-7.0的缓冲液，还包含磁珠I表面凝胶吸附病毒所必需的物质。

在一个实施例中，所用羟基磷灰石凝胶吸附病毒所必需的物质为5mmol/L磷酸缓冲液。

所述离液盐为盐酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸钾中的一种或两种以上的混合物。

所述去垢剂是能够溶解脂质的去垢剂，其包括但不限于十二烷基磺酸钠(SDS)、月桂基二甲基氧化胺(LDAO)、曲拉通(Triton)、吐温(Tween)、磷酸三正丁酯、辛基β-葡萄糖苷中一种或两种以上的混合物。

所述还原剂为DTT或β-巯基乙醇或二者的混合物。

所述蛋白酶为蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶中一种或两种以上的混合物。其浓度为0.01-0.1mg/ml。

所述调节pH范围在3.5-7.0的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)中一种或两种以上的混合物。

所述各种生物样品为细胞、全血、动物组织匀浆液、植物组织匀浆液等。

所述无细胞液体样品为血清、血浆、组织提取液、拭子洗液、无细胞体液、病毒培养液、尿液等。

本发明的主要优点在于：使用可以通用性地吸附病毒的磁珠使得裂解细胞和分离病毒在一管中一步完成；使用两种磁珠实现病毒和病毒核酸的提取，使得整个提取过程操作简便快速；无需复杂设备，易实现高通量自动化操作。

附图说明

图1为从咽拭子样品中提取禽流感病毒RNA，PCR扩增得到的545bp产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。泳道M为2000bp DNA Ladder：100，250，500，750，1000，2000bp；泳道1为阴性对照；泳道2为545bp PCR产物。

具体实施方式

实施例1

第一步：磁珠I——1.2μm Fe₃O₄-羟基磷灰石磁性复合微粒的制备

利用文献公开报道的共沉淀法合成12nm Fe₃O₄磁性纳米粒子。取20ml冰醋酸和780ml水混合后，加入5g Fe₃O₄磁性纳米粒子，超声分散。在搅拌速度为100rpm的条件下，加入200ml含14.11g Ca(NO₃)₂、7.02g KH₂PO₄和4ml冰醋酸的混合溶液，搅拌15分钟。向混合溶液中缓慢滴加2mol/L的NaOH溶液，保持溶液pH值大于13。在搅拌速度为150rpm的条件下，反应12小时。用永磁铁从反应溶液中分离出固体，用高纯水清洗所得固体3次，即得到Fe₃O₄-羟基磷灰石磁性复合微粒，其平均尺寸为1.2μm；

第二步：从各种生物样品中提取病毒核酸

本实施例所使用的磁珠I为本实施例第一步合成的磁珠I。

本实施例所使用裂解液I组分为：50mmol/L磷酸缓冲液，50mmol/LEDTA、2mol/L盐酸胍，0.25mol/L醋酸缓冲液，pH3.5。

本实施例所使用裂解液II组分为：3mol/L盐酸胍、2％LDAO、1mmol/LEDTA、0.25mol/L醋酸缓冲液，5mmol/L磷酸缓冲液，pH3.5。

本实施例所使用的洗涤液为75％乙醇；所使用的溶解液为无RNase的水。洗涤液和溶解液还可以是本技术领域所采用的各种洗涤液和溶解液。

其步骤包括：

a)取适量样品放入0.5或1.5ml离心管中，加入150μl裂解液II和1.5μl 1mol/L DTT，旋涡振荡混匀，加入10μl磁珠I，旋涡振荡混匀，室温吸附5min(不要置于磁架上)；

b)室温吸附后，旋涡振荡混匀，立即将离心管放于磁架上，待磁珠I完全吸附到离心管管壁上(5-10秒)，吸弃液体；

c)将吸附病毒的磁珠I悬浮于150μl裂解液I中，旋涡振荡混匀，立即将离心管放于磁架上，待磁珠I完全吸附到离心管管壁上(5-10秒)，将液体转移到另一离心管中，70-100℃加热1-3分钟使病毒裂解，加入10μl磁珠II，旋涡振荡混匀，室温吸附5min(不要置于磁架上)；

d)吸附后，旋涡振荡混匀，立即将离心管放于磁架上，待磁珠II完全吸附到离心管管壁上(5-10秒)，吸弃液体；

e)用150ul洗涤液洗涤吸附于磁珠II上的病毒核酸两次后，于磁架上室温开盖干燥10min；

f)加入8～100μl溶解液，旋涡振荡混匀，65℃温浴5min，旋涡振荡混匀后立刻放到磁架上，磁吸5-10秒，吸出溶液放于另一离心管中保存待用。

实施例2

第一步：磁珠I——0.6μm Ni-羟基磷灰石磁性复合微粒的制备

取25ml冰醋酸和775ml水混合后，加入5g 8nm商品化的Ni磁性纳米粒子，超声分散。在搅拌速度为150rpm的条件下，加入200ml含8.5g Ca(NO₃)₂、4.21g KH₂PO₄和7.5ml冰醋酸的混合溶液，搅拌30分钟。向混合溶液中缓慢滴加2mol/L的NaOH溶液，保持溶液pH值大于13。在搅拌速度为200rpm的条件下，反应6小时。用永磁铁从反应溶液中分离出固体，用高纯水清洗所得固体3次，即得到Ni-羟基磷灰石磁性复合微粒，其平均尺寸为0.6μm；

第二步：从各种生物样品中提取病毒核酸

本实施例所使用的磁珠I为本实施例第一步合成的磁珠I。

本实施例所使用裂解液I组分为：250mmol/L磷酸缓冲液，25mmol/LEDTA，1mol/L盐酸胍，0.25mol/L醋酸缓冲液，pH5.5。

本实施例所使用裂解液II组分为：3mol/L盐酸胍、2％LDAO、1mmol/LEDTA、0.25mol/L醋酸缓冲液，5mmol/L磷酸缓冲液，pH5.5。

其它同实施例1中第二步。

实施例3

第一步：磁珠I——2μm Ni-Fe₃O₄-羟基磷灰石磁性复合微粒的制备

取40ml冰醋酸和760ml水混合后，加入5g商品化的平均尺寸为8nm Ni磁性纳米粒子和5g商品化的平均尺寸为10nm Fe₃O₄磁性纳米粒子，超声分散。在搅拌速度为150rpm的条件下，加入200ml含28.22g Ca(NO₃)₂、12.64g KH₂PO₄和8ml冰醋酸的混合溶液，搅拌30分钟。向混合溶液中缓慢滴加4mol/L的NaOH溶液，保持溶液pH值大于13。在搅拌速度为200rpm的条件下，反应6小时。用永磁铁从反应溶液中分离出固体，用高纯水清洗所得固体3次，即得到Ni-Fe₃O₄-羟基磷灰石磁性复合微粒，其平均尺寸为2μm；

第二步：从各种生物样品中提取病毒核酸

本实施例所使用的磁珠I为本实施例第一步合成的磁珠I。

本实施例所使用裂解液I组分为：500mmol/L磷酸缓冲液，0.25mol/LTris-HCl，pH7.0。

本实施例所使用裂解液II组分为：3mol/L盐酸胍、2％LDAO、1mmol/LEDTA、0.25mol/L Tris-HCl，5mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0。

其它同实施例1中第二步。

实施例4

第一步：磁珠I——3μm Co2O3-焦磷酸镁磁性复合微粒的制备

利用文献公开报道的方法合成15nm Co₂O₃磁性纳米粒子。取10g Co₂O₃磁性纳米粒子分散在760ml水中，加入200ml 0.1mol/L MgCl₂溶液，混匀。在搅拌速度为300rpm，缓慢滴加0.1mol/L焦磷酸钠溶液40ml。室温反应12小时。用永磁铁从反应溶液中分离出固体，用高纯水清洗所得固体3次，即得到Co₂O₃-焦磷酸镁磁性复合微粒，其平均尺寸为3μm；

第二步：从各种生物样品中提取病毒核酸

本实施例所使用的磁珠I为本实施例第一步合成的磁珠I。

本实施例所使用裂解液I组分为：0.3mol/L枸橼酸钠溶液，25mmol/LEDTA、2mol/L盐酸胍，0.25mol/L Tris-HCl，pH6.5。

本实施例所使用裂解液II组分为：3mol/L盐酸胍、2％LDAO、1mmol/LEDTA、0.25mol/L Tris-HCl，pH6.5。

其它同实施例1中第二步。

实施例5

第一步：磁珠I——6μm Fe₂O₃-Co₃O₄-焦磷酸镁磁性复合微粒的制备

购买商品化的平均尺寸为8nm Fe₂O₃磁性纳米粒子和平均尺寸为10nm Co₃O₄磁性纳米粒子。分别取20g Fe₂O₃磁性纳米粒子和20g Co₃O₄磁性纳米粒子超声分散在775ml水中，加入150ml 0.5mol/L MgCl₂溶液混匀。在搅拌速度为250rpm，缓慢滴加0.2mol/L焦磷酸钠溶液75ml。室温反应12小时。用永磁铁从反应溶液中分离出固体，用高纯水清洗所得固体3次，即得到Fe₂O₃-Co₃O₄-焦磷酸镁磁性复合微粒，其平均尺寸为6μm。

第二步：从各种生物样品中提取病毒核酸

本实施例所使用的磁珠I为本实施例第一步合成的磁珠I。

其它同实施例4中第二步。

实施例6

从无细胞液体样品中提取病毒核酸

本实施例所使用的磁珠I为实施例1所制备的磁珠I。

本实施例所使用裂解液I组分为：500mmol/L磷酸缓冲液，20mmol/LEDTA、2mol/L盐酸胍，0.25mol/L Tris-HCl，pH6.5。

本实施例所使用的洗涤液为75％乙醇；所使用的溶解液为无RNase的水。洗涤液和溶解液还可以是本技术领域所采用的各种洗涤液和溶解液。

其步骤包括：

取适量样品放入0.5或1.5ml离心管中，加入150μl 0.25mol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，5mmol/L磷酸缓冲液，pH6.6，加入10μl磁珠I，旋涡振荡混匀，室温吸附5min(不要置于磁架上)；其余步骤同实施例1中的b)-f)。

试验例1：提取RNA病毒核酸的质量鉴定

对实施例1~6中从各种样品中提取出来的RNA病毒核酸采用常规方法进行逆转录、PCR扩增和PCR产物的检测。

用本发明方法从咽拭子样品中提取禽流感病毒RNA，PCR得到的结果如图1所示，扩增得到的545bp产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。

试验例2：在自动化移液工作站上自动化提取病毒核酸

对各种生物样品步骤同实施例1，对无细胞液体样品步骤同实施例6，除了：用微孔板取代离心管；用自动化工作站移液取代移液器移液；用适用于96孔板或384孔板的磁力架取代普通离心管用磁力架。