白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系及其制备方法

摘要

本发明涉及血栓防治药物领域，公开了一种白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系，包括载重组tPA基因质粒白蛋白纳米粒和蔗糖白蛋白超声微泡；其制备方法包括以下步骤：1)制备载重组tPA基因质粒白蛋白纳米粒；2)制备蔗糖白蛋白超声微泡；3)用载重组tPA基因质粒白蛋白纳米粒和蔗糖白蛋白超声微泡制备白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系。本发明构建重组tPA基因质粒并选择白蛋白纳米粒和超声微泡为载体，将其转导机体细胞获得有效和持续tPA的产生，可达到长期抗凝和防止血栓形成的作用，且安全、无创。

说明书

技术领域

本发明涉及血栓防治药物领域，尤其涉及一种白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系及其制备方法。

背景技术

在正常生理情况下，凝血-抗凝和纤溶-抗纤溶机制互相平衡，保证血液在体内正常流动，既不形成血栓，也不至于出血。血栓形成与血栓溶解机制的失衡使得血栓不适当地形成或者形成后不能被有效清除，导致组织或器官缺血/坏死；另一方面，抗凝/纤溶过度也会导致出血的发生。

tPA(tissue-type Plasminogen Activator，tPA)是纤溶系统主要激活因子，是机体重要的抗凝成分。它由血管内皮细胞合成，在各种刺激尤其是纤维蛋白的作用下释放入血，作用于血浆素原使其转换为血浆素促进纤维蛋白降解。自tPA的cDNA克隆成功，人们已能够构建其逆转录病毒载体并在体外转导内皮细胞获得tPA蛋白的高表达。动物实验证实，将这种转导的内皮细胞贴附于球囊支架表面或动脉桥吻合口可防止支架术后或血管搭桥术后血栓形成和再狭窄的发生，明显提高手术的远期效果。人重组tPA作为生物制剂已应用于冠心病急性心肌梗塞、脑栓塞、肺梗塞等的溶栓治疗并取得了显效，但由于价格昂贵未能广泛应用。

白蛋白是近年来研究较多的一种纳米材料，它的生物相容性好，生物可降解，无免疫源性和细胞毒性，基因转移效率较高。由于它有精确的纳米结构和表面与内部可携带分子的特性，使之成为一个很好的DNA导入细胞的载体。

基因导入体内的方式多为将目的基因直接注射于靶组织，如心血管疾病多采用心肌内直接注射或心导管注入质粒DNA或腺病毒载体。中国发明专利CN200610033187.0公开了一种基因缝线，该缝线为载有高表达tPA基因质粒的外科涤纶缝线，将该基因缝线直接缝合于心肌组织，可消除或避免凝血块的形成。中国发明专利CN200910106773.7公开了用壳聚糖做原料制备了纳米tPA基因载体并直接注射于心肌均获得tPA的有效表达。但上述两专利记载的方法存在有创性，限制其临床应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种安全、有效、无创的白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系。

本发明的第二个目的在于提供一种制备白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系，包括载重组tPA基因质粒白蛋白纳米粒和蔗糖白蛋白超声微泡。

所述重组tPA基因质粒含有重组tPA基因、启动子、终止子和筛选标记基因表达盒。

所述重组tPA基因由1686个碱基组成，其碱基序列如SEQ ID：NO.1所示。

所述白蛋白为牛血清白蛋白。

靶向体系中蔗糖白蛋白超声微泡含量为0.8-1.8×10⁹个/ml，重组tPA基因质粒含量为0.1-0.3mg/ml。

白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系的制备方法，包括以下步骤：

1)制备载重组tPA基因质粒白蛋白纳米粒；

2)制备蔗糖白蛋白超声微泡；

3)用载重组tPA基因质粒白蛋白纳米粒和蔗糖白蛋白超声微泡制备白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系。

步骤1)具体为将重组tPA基因质粒加入牛血清白蛋白溶液中孵育后，在超声场的存在下滴入乙醇水溶液，直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5％的戊二醛溶液，搅拌，室温下静置，得到载重组tPA基因质粒白蛋白纳米粒。

步骤2)具体为无菌制备含蔗糖的牛血清白蛋白液体，并置于容器中，依次用氧气和氟碳气体饱和液体，超声波发生器处理，得到氧-氟丙烷蔗糖白蛋白超声微泡。

步骤3)具体为步骤1)制备的白蛋白纳米粒加至步骤2)制备的白蛋白微泡中，加入戊二醛，4℃下孵育进行交联，用生理盐水洗涤、离心、分层，上浮泡沫悬液即为白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系。

本发明构建重组tPA基因质粒并选择白蛋白纳米粒和超声微泡为载体，将其转导机体细胞获得有效和持续tPA的产生，可达到长期抗凝和防止血栓形成的作用，且安全、无创；

本发明采用一步法制备载基因白蛋白纳米粒，这种方法将质粒物理包裹于白蛋白纳米粒中，其主要优点是携带被转基因量较高；药物缓释和转基因时间较长；具有较好的酶保护和防止体内DNA酶降解作用；容易设计成靶向载体，应用于体内研究或制备成纳米药物应用更具优越性；

本发明在制备超声微泡过程中在白蛋白液体中加入10％蔗糖，避免蔗糖白蛋白液体粘滞性强，制备时超声困难且所需能量较大的问题，且微泡稳定性良好；

含全氟碳的微泡同时加有少量氧气会进一步促进微泡在血液中的稳定性，从而取得更强的心肌显影效果；

采用超声触发破坏白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系，可使载有基因质粒的白蛋白纳米粒靶向定位释放和靶基因的表达增强，这种方法是一种简易有效的靶向纳米基因转移新技术。

附图说明

图1是重组tPA基因质粒pSecTag2B-tPA构建流程图；

图2是载重组tPA基因质粒白蛋白纳米粒Zetasizer3000仪粒度分析结果图；

图3是琼脂糖凝胶电泳DNA阻滞实验和DNA酶保护实验结果图；

图4是白蛋白超声微泡与白蛋白纳米粒交联后普通光学显微镜下400倍放大图；

图5是超声波靶向治疗前后心脏超声影像学改变图，A输入微泡前；B输入微泡后心脏显影增强；C超声波治疗后；

图6是超声波靶向治疗前后肝脏超声影像学改变图，A输入微泡前；B输入微泡后肝脏显影增强；C超声波治疗后；

图7是超声靶向转基因的心肌组织心肌细胞增大图，胞浆红染，HE 200×；

图8是超声靶向转基因的骨骼肌组织肌细胞肥大图，胞浆红染，细胞核增多，HE 200×；

图9A是对照组心肌组织tPA抗体阴性反应免疫组化结果图，图9B实验组心肌组织tPA抗体阳性反应免疫组化结果图，200×；

图10A是对照组心肌组织tPA抗体阴性反应免疫组化结果图，图10B是实验组心肌组织tPA抗体阳性反应免疫组化结果图，免疫组化200×；

图11是实验组肝细胞tPA抗体阳性反应免疫组化结果图，400×；

图12是实验组肋软骨基层软骨细胞tPA抗体阳性反应免疫组化结果图，400×；

图13是实验组骨髓细胞tPA抗体阳性反应免疫组化结果图，400×。

具体实施方式

本发明白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系制备方法主要包括以下步骤：

1、构建重组tPA基因质粒pSecTag2B-tPA，下述实施例1会详细说明；

2、采用上述重组tPA基因质粒和白蛋白，进行白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系的制备，下述实施例2会详细说明。

实施例1 重组tPA基因质粒pSecTag2B-tPA的制备

1、主要试剂

A、质粒pSecTag2B，购自美国Invitrogen生物公司，

B、感受态细胞E.Coli JM109，购自Promega公司，

C、限制性内切酶HindIII，KpnI，BamHI和XhoI，购自宝生物工程有限公司，

D、T4-DNA连接酶，购自New England Biolabs公司，

E、QIAquick Gel Extraction Kit、QIAGEN PCR Product

Purification Kit，购自QIAGEN公司。

2、方法

人工合成三个EST：tPA-1如SEQ ID NO.2所示、tPA-2如SEQ ID NO.3所示和tPA-3如SEQ ID NO.4所示，分别连接克隆载体，制备成质粒pOTB6、pOTB7和pCMV-SPORT6。

采用三对引物tPA-1F(SEQ ID NO.5)和tPA-1R(SEQ ID NO.6)、tPA-2F(SEQ ID NO.7)和tPA-2R(SEQ ID NO.8)、tPA-3F(SEQ ID NO.9)和tPA-3R(SEQ ID NO.10)分别扩增上面描述的所述质粒pOTB6、pOTB7和pCMV-SPORT6，扩增tPA-1和tPA-3的PCR程序为：94℃预变性4min，94℃45sec，55℃45sec，72℃1min，共25个循环，最后72℃延伸5min；扩增tPA-2的PCR程序为：94℃预变性4min，94℃45sec，60℃45sec，72℃1min，共25个循环，最后72℃延伸5min。

将所得产物经QIAGEN PCR Product Purification Kit纯化后分别用三对限制性内切酶HindIII和KpnI、KpnI和BamHI、BamHI和XhoI进行消化，同时用限制性内切酶HindIII和XhoI消化质粒pSecTag 2B，纯化方法见QIAGEN PCR Product Purification Kit说明书。

将上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，QIAquick Gel ExtractionKit回收目的DNA片段，纯化方法见QIAquick Gel Extraction Kit说明书，用T4-DNA连接酶连接上述收回产物，构建出重组tPA基因质粒pSecTag2B-tPA，构建流程见图1。

实施例2白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系的制备

利用实施例1制得的重组tPA基因质粒pSecTag2B-tPA和白蛋白制备白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系，包括以下步骤：

1、一步法制备载重组tPA基因质粒白蛋白纳米粒，具体为：100mg牛血清白蛋白加入5ml双蒸水溶解，用0.1N HCI调整pH值至5.5。将已构建的1mg重组tPA基因质粒加入上述白蛋白溶液中，孵育30min后在超声场的存在下缓慢滴入乙醇水溶液(乙醇∶水＝2∶1)，直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5％的戊二醛溶液30ul，适当搅拌，室温下静置2h。减压使残余的乙醇挥发后，所得溶液17000r/min离心30min以除去游离的白蛋白和多余的交联剂，所得沉淀为载基因白蛋白纳米粒。沉淀用双蒸水重悬并用超声波(条件：180W，固定频率20kHz，30sec)分散成乳胶状，4℃下储存备用。

取部分制备扫描电镜标本观察纳米粒形态、做包封率检测和凝胶阻滞实验，并用Zetasizer3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。扫描电镜结果显示，白蛋白纳米粒球形，大小较均匀且分散良好。Zetasizer3000仪粒度分析显示，白蛋白粒径大小呈正态分布，平均粒径大小为132.0nm，最大粒径为152.4nm，最小粒径为49.1nm。多分散指数平均0.33，见图2。表面Zeta平均+31.32-+41.42mV。样品的包封率用紫外分光光度计进行检测，测量加入的总的质粒DNA含量。将包裹基因后的纳米溶液离心并测量上清液中游离质粒DNA，包封率(％)＝(W总-W游)/W总×100％(W总：的加入量；W游：上清液中质粒DNA测得量)。测定结果显示包封率平均为73.58％，符合实验要求。

0.9％琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，可见经白蛋白纳米包裹后DNA完全阻滞于加样孔中未能移动(DNA：白蛋白为1/100)。质粒DNA未被白蛋白纳米粒包裹经DNase I消化后降解，电泳未见条带显现。而包裹纳米粒的质粒DNA则保持完好，被完全阻滞于加样孔内，表明白蛋白纳米粒对质粒DNA具保护作用。

2、制备氧-氟丙烷蔗糖白蛋白超声微泡，具体为：无菌制备含10％蔗糖的5％(g.ml^-1)牛血清白蛋白液体10ml；并置于有盖50ml塑料离心管中，依次用氧气和氟碳气体饱和液体(流量：6ml.min^-1)，约10min，超声波发生器处理1min(条件：180W，固定频率20kHz)；将制备的微泡4℃下密闭保存备用。

取部分显微镜观察微泡形态、测量大小并计数；Zetasizer3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。普通光学显微镜显示制备的糖蛋白超声微泡园球形囊泡状，大小较一致，分散良好，直径最小0.9μm，最大9.8μm，95％以上微泡直径2-5μm，可满足微血管超声造影需求。含10％蔗糖的白蛋白微泡经4℃保存30天形态学上未发生改变，且对热稳定性良好(40℃，30min)。

3、用载基因白蛋白纳米粒和氧-氟丙烷蔗糖白蛋白超声微泡制备白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系，具体为：将一次制备的白蛋白纳米粒(含1mg质粒)加至5ml白蛋白微泡中，加入50％戊二醛10ul溶液4℃下孵育2h进行交联(戊二醛溶液终浓度为0.1％)。用生理盐水洗涤、离心、分层，离心速度200转/min，1min，取上浮泡沫悬液即得白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系。调整微泡浓度使5ml靶向体系中含微泡0.8-1.8×10⁹个/ml，基因质粒含量为1mg。4℃下保存备用。白蛋白超声微泡与白蛋白纳米粒交联后形态、大小等性状亦未发生明显变化，见图4。

实施例3白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系超声治疗效果

1.材料：纯种新西兰白兔25只，雄性，体重2.3-2.5kg，南方医科大学动物中心提供。

2.主要试剂：羊抗人tPA多克隆抗体、兔抗羊多克隆抗体、牛血清白蛋白、tPA ELISA检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供。全氟丙烷气体(Halocarbon-218)由广东佛山捷锐公司提供。

3.主要仪器：超声波发生器系宁波新芝生物科技有限公司产品；治疗性超声仪(US-700，系德国产品)。

4.方法：

4.1兔用5％戊巴比妥钠静脉麻醉(20-25mg/kg)；用二维超声观察心、肝等脏器显影。经耳缘静脉注入载tPA基因纳米白蛋白微泡剂5ml并观察到相关脏器显影明显增强。分组：(1)实验组(n＝16)：进一步分心脏组6例，肝脏组6例和肌肉组4例。静脉注入载tPA基因纳米白蛋白微泡剂5ml后立即经胸前壁正对心脏前壁及肝区、经皮肤左后腿内收肌群等超声照射30min并观察到将微泡击碎(二维超声观察)，超声频率1MHz；强度1.5W/cm²。(2)对照组(n＝9)：单纯微泡组3例，经耳缘静脉注入载tPA基因纳米白蛋白微泡剂5ml；不用超声照射；纳米基因组3例，静脉输入白蛋白纳米tPA基因及超声照射；空白对照组3例，静脉输入5ml生理盐水和超声治疗。超声治疗条件同前。后2组靶器官为肝脏。术后普通饲料喂养，观察期4周。

4.2病理和免疫组化观察：动物经常规饲养和观察4周后分别处死，取心脏、肝脏、大腿内收肌组织以及超声场通过的胸壁肋软骨组织，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，常规切片和HE染色病理检查；间接免疫组化法染色检测tPA基因在各组织和细胞中的表达，阳性反应细胞为细胞浆内黄褐色颗粒状沉淀。取肺脏、肾脏组织作为对照。动物于术前和观察结束分别取血液检测D-二聚体含量并用ELISA法检测血tPA含量

5.结果

5.1超声显像和靶向治疗：经兔耳缘静脉注入载tPA基因纳米白蛋白微泡剂5ml后超声显像心脏、肝脏等设定的靶组织，观察到与注射前相比相关脏器显影明显增强。经超声波治疗30min后组织显像回复至注射前水平。非超声治疗的单纯微泡组、纳米基因组和空白对照组超声显像无明显改变，见图5和图6。

5.2组织病理学改变和tPA基因表达：超声靶向处理的心肌细胞、骨骼肌细胞和肝细胞等体积增大，细胞浆深染，细胞核增大，骨骼肌细胞核增多。部分细胞胞浆可见空泡。未经超声照射的组织和细胞未见明显改变；对照组织如肾组织、肺组织等未见明显异常，见图7和图8。超声靶向转染4周后可见心脏、肝脏、骨骼肌组织和骨组织中的实质细胞表达tPA抗原。tPA抗原表达阳性心肌和骨骼肌细胞呈散在分布，这些细胞体积增大，胞浆横纹减少或消失呈细颗粒状，部分间质细胞和小血管壁可见弱的阳性反应。tPA反应阳性的肝细胞呈散在或放射状分布，主要分布在肝小叶门管区，其它细胞未见阳性反应。骨组织中阳性反应细胞主要分布在软骨生发层细胞和骨髓造血细胞和部分间质细胞(图9、10、11、12)。

5.3血D-二聚体和tPA含量：靶向转基因前后血D-二聚体和tPA含量检测结果如表1所示，转基因后4周血液2项反应纤溶活性的指标均显著增高(表1)。

表1：兔靶向转tPA基因术前和术后4周血D-二聚体和tPA含量(μg/L，x±s)

*0.025＜P＜0.01，**P＜0.01，术前与术后相比

在获得靶组织表达tPA的同时检测到血tPA含量增高以及D-二聚体含量增高，反应了tPA抗凝活性明显增强。

SEQUENCE LISTING

<110>姬，尚义

     季，军

 

<120>白蛋白纳米-超声微泡载组织型纤溶酶原激活物基因靶向体系及其制备方法

 

<130>P11498

 

<160>10

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>1686

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>1

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tcgcccagcc aggaaatcca tgcccgattc agaagaggag ccagatctta ccaagtgatc    120

tgcagagatg aaaaaacgca gatgatatac cagcaacatc agtcatggct gcgccctgtg    180

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cgaccg                                                              1686

 

<210>2

<211>678

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

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tcagcctacc gtggtacc                                                  678

 

<210>3

<211>385

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>3

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atactcatca gctcctgctg gatcc                                          385

 

<210>4

<211>642

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>4

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gcgattcggg aggccccctg gtgtgtctga acgatggccg catgactttg gtgggcatca    540

tcagctgggg cctgggctgt ggacagaagg atgtcccggg tgtgtacacc aaggttacca    600

actacctaga ctggattcgt gacaacatgc gaccgcctcg ag                       642

 

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>5

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<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>6

ggggtaccac ggtaggctga cccattc                                      27

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>7

ggggtaccca cagcctcacc gagtcg                     26

 

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>8

cgggatccag caggagctga tgagtatgcc                 30

 

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>9

cgggatcctc tctgccgccc actgct                     26

 

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>10

ccctcgaggc ggtcgcatgt tgtcac                     26