MRI引导聚焦超声联合载基因微泡靶向开放血脑屏障促进外源基因体内转染

摘要

第一部分MRI引导聚焦超声靶向可逆开放小鼠BBB
　　 目的：
　　 建立MRI引导超声靶向微泡破裂(ultrasound-targeted microbubbledestruction，UTMD)开放小鼠血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的模型，并为后续MRI引导UTMD介导基因体内转染筛选出最优的超声参数。
　　 方法：
　　 将15只昆明小鼠随机分成三组，分布接受MRI引导1.1 MHz聚焦超声联合微泡以1.1W、2.2 W、4.4 W不同强度辐照小鼠脑部40 s，通过靶点MRI增强扫描、伊文氏蓝(EB)染色和HE组织学检查了解不同超声强度下BBB开放的程度、24 h后恢复状态和组织学变化，筛选出对脑组织影响最小的超声参数。
　　 结果：
　　 1.MRI增强扫描图像:在超声辐照结束当时及24 h两个时间点对鼠脑行增强扫描，结果显示:声功率1.1W组在两时间点均无增强;2.2W组在超声辐照后靶区当即出现明显的小范围增强，在24 h后已未见增强;4.4W组在超声辐照后靶区出现明显的大范围增强，且24 h后仍可在该区域见片状增强信号，但范围有所减小。
　　 2.EB染色:超声辐照后立即行EB染色，声功率1.1W组靶区脑组织未见蓝染，2.2W组和4.4W组均见蓝染，且4.4W组蓝染的程度和范围比2.2W组更为明显，并与辐照后靶点MRI增强扫描结果吻合。
　　 3.HE组织学检查:1.1W组靶区脑组织在光镜下未见红细胞渗出和组织损伤，与靶区外组织无明显区别;2.2W组靶区见少量红细胞渗出，但脑实质未见明显异常;4.4W组靶区见红细胞广泛渗出，脑组织液化坏死严重，间质水肿明显。
　　 结论：
　　 MRI引导UTMD能成功可逆、靶向性的开放小鼠BBB，并筛选出最优超声参数为1.1 MHz、2.2 W、40 s，为后续基因转染实验奠定基础。
　　 第二部分MRI引导聚焦超声联合载pEGFP-N1微泡跨BBB靶向基因转染研究
　　 目的：
　　 探讨在MRI引导下聚焦超声联合载EGFP微泡跨BBB在脑组织内靶向转染的可行性，并对外源基因表达部位和表达量进行分析。
　　 方法：
　　 通过“层-层”吸附的方式将质粒pEGFP吸附在微泡的表面。将60只小鼠根据处理因素的不同随机分成5组:对照组（Con组）、质粒组(P组)、质粒+微泡组（P+M组）、质粒+超声组（P+U组）、质粒+超声+微泡组（P+U+M组），分别在各实验组加入相应的处理因素，48 h后通过免疫组化和免疫荧光来检测EGFP表达部分，通过RT-PCR和western-blot检测不同处理组EGFP转录和翻译情况。另将90只均接受P+U+M组处理方式的小鼠，根据观察时间点的不同，随机分为9组，分为0h/6h/12h/24h/48h/5d/7d/14d/28d组，通过RT-PCR和western-blot检测不同时间点EGFP转录和翻译情况。
　　 结果：
　　 1.免疫组化:仅P+U+M组靶区能见到若干棕色胞浆的阳性细胞，而该组靶点对侧非超声照射区域及其他各组的脑组织均只能看到蓝染的细胞核。
　　 2.免疫荧光:绿色荧光的EGFP与红色荧光的神经元特异性标记物β-TubulinⅢ在神经元的胞浆内明显共区域化。
　　 3.RT-PCR和western-blot: Con组、P组、P+M组均未检测到EGFP,虽然在P+U组检测到少量的EGFP mRNA和蛋白，但不具备统计学意义，而在P+U+M组检测到较高水平EGFP mRNA和蛋白，其表达量分别是是P+U组的15倍和10倍(P＜0.01)。EGFP基因的转录和翻译在超声辐照后的6h内发生，且在24 h显著增加，在48 h到达顶峰，然后逐渐降低，最后在28 d时降到很低的水平。
　　 结论：
　　 证实MRI介导UTMD促进外源基因跨BBB靶向转染的可行性，且首次提出转染部位为靶区神经元的胞浆，并具有较高的转录和翻译水平，外源基因的表达量在48 h达到高峰，然后逐渐降低。
　　 第三部分MRI引导聚焦超声联合载pEGFP-BDNF微泡跨BBB靶向基因转染及相关机制研究
　　 目的：
　　 探讨MRI介导UTMD促进外源基因pEGFP-BDNF跨BBB在脑组织内靶向转染的可行性，分析该转染过程是否会对内源性BDNF产生影响，并对基因转染的相关过程和机制做初步的探索。
　　 方法：
　　 将31只小鼠根据处理因素的不同，随机分为5组:对照组（Con组）、1组（载pBDNF-EGFP基因微泡组）、2组（载pEGFP基因微泡+超声组）、3组（微泡+质粒pBDNF-EGFP+超声组）、4组（载pBDNF-EGFP基因微泡+超声组）。每组5只于处理48h后行Western blot检测各组BDNF的含量，4组的另外6只于超声辐照1h后分别行电镜和冰冻切片检测基因转染的相关过程。
　　 结果：
　　 1.Western blot结果显示:在载pBDNF-EGFP微泡+超声组的小鼠靶区脑组织内BDNF含量最高，是对侧非超声照射区域BDNF含量的20倍(P＜0.01)，尽管在微泡+质粒pBDNF-EGFP+超声组的小鼠脑内检测到轻微BDNF含量的升高，但和对照组相比不具备统计学意义，而在载pBDNF-EGFP微泡+超声组对侧非超声照射区域、载pBDNF-EGFP基因微泡组和载pEGFP基因微泡+超声组靶区BDNF含量均较对照组无明显变化。
　　 2.冰冻切片在共聚焦显微镜下示:载DNA微泡经PI染色后在微泡表面形成红色的荧光，注入小鼠体内经超声辐照1h后，在对侧非超声照射区域的脑组织内除了看到些少量散在的红色小点外并没有看到明显的红色荧光，而在靶区脑组织内发现PI染色的质粒被吞噬进入许多神经元的胞浆内，呈现出簇状高浓度不均一分布的红色斑点。
　　 3.电镜:在靶区脑组织神经元胞浆内见到很多小的透明囊泡样结构，而对侧非超声照射区域的脑组织未见到任何超微结构的改变。
　　 结论：
　　 本研究部分证实MRI引导UTMD能促进外源基因BDNF在靶区高表达，且该方式本身不会造成靶区及周围非超声辐照区域脑组织内源性的BDNF含量的升高。在超声辐照1h后，质粒已以较高的浓度不均一的分布在靶区神经元的胞浆内，且胞浆内见大量囊泡样结构，提示超声辐照后治疗性大分子物质进入神经元很可能是由囊泡介导的胞吞作用，其过程和机制仍需进一步研究，本试验为UTMD介导大分子内摄的体内研究提供了新的证据。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

参考文献

第一部分 MRI引导聚焦超声靶向可逆开放小鼠BBB

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 MRI引导聚焦超声联合载pEGFP-N1微泡跨BBB靶向基因转染研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 MRI引导聚焦超声联合载pEGFP-BDNF微泡跨BBB靶向基因转染及相关机制研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

全文总结

文献综述 聚焦超声联合微泡靶向治疗中枢神经系统疾病

附图

致谢

攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文