水稻胚乳特异表达基因的启动子及表达模式鉴定

摘要

本发明属于植物基因工程领域。从水稻基因组中克隆了同一胚乳特异表达基因(登录号为GI：31415924)上游6个不同长度的启动子(EnP3、EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471、EnP3-292和EnP3-110)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-6所示；其中5个启动子(EnP3、EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471和EnP3-292)仅在转化植株的胚乳表达，并且随着胚乳发育阶段的不断进行，表达量呈现下降趋势；在其他组织如叶片、叶鞘、茎杆、根、花、颖壳及胚中均检测不到表达。启动子EnP3-110在叶片、叶鞘、茎杆及颖壳这些绿色组织中可以检测到表达，但是在根、花及种子(包括胚和胚乳)中却检测不到表达，成为一个短的绿色组织特异表达启动子。公开了6个启动子及其相应表达载体的制备方法，以及通过农杆菌介导的转基因方法导入水稻的应用。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及到水稻中同一胚乳特异性表达基因的不同长度启动子区域的分离克隆及表达模式鉴定。

背景技术

通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中具有很好的应用前景。自1983年获得第一株转基因烟草以来(Zambryski et al.，1983)，在近30年的时间里，植物基因工程的研究取得了突飞猛进的进展，已经成为现代生物学和育种学中一项重要的方法和技术。但是在其广泛运用的过程中也逐渐暴露了一些问题。其中之一就是现阶段研究中经常用组成型启动子来驱动外源基因表达，由于组成型启动子会使驱动的目的基因在植物各组织中恒定而持续的表达，从而过度消耗细胞内的物质和能量，并且不能从时间和空间上有效地调控目的基因的表达，所以有时会带来一些负面效应。如外源基因在整株植物中表达，产生的大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有的代谢平衡，不利于产量和品质的提高；有些产物对植物并非必需甚至有毒，因而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡(Karlowsikiand Hirsch，2003；Ehsani et al.，2003)。如利用组成型启动子表达病毒衣壳蛋白，就可能会引起病毒农壳转移，从而导致植物病毒新株系的产生(Robinson，1996)，因此也引起了一些安全性方面的思考。另外，重复使用同一种组成型启动子驱动两个或两个以上的外源基因表达可能会引起基因沉默或共抑制现象(Kumpatlaet al.，1998)，所以给多基因转化也带来了不少麻烦。因此，启动子在植物基因工程中的研究地位也越来越突出。研究者们通过寻找更为有效的组织、器官特异性表达启动子或者是诱导表达启动子来代替组成型启动子，以期更好地调控植物基因表达。诱导型启动子虽然优点突出，利用诱导型启动子获得转基因植株尽管也有一些报导，但到目前为止能用于生产实际的还比较少，而组织器官特异表达的启动子有望用于生产实际则有一些较成功的例子(Cai et al.，2007；Ye et al.，2009)。

所谓组织特异型启动子是指除具有一般启动子的结构外，通常还有增强子和沉默子的一般特性。在组织特异型启动子调控下，基因的表达常常只发生在某些特定的器官或组织部位，并常常表现出发育调节的特性。这些启动子的调控往往受到组织细胞生理状态和化学物理信号等物质的诱导，还受到发育阶段的调控，其表达是多种因子相互作用的结果。

果实和种子是植物的生殖器官，也是营养物质主要的储藏场所。利用果实或种子等器官特异性启动子调控基因表达，不仅可提高基因在这些部位的表达量，将生物能耗降到最低，利于表达产物的分离，而且可有目的地提高转基因植物果实或种子的营养或改善其品质。Sandhu等利用E8启动子(成熟果实中乙烯应答性基因的启动子)驱动呼吸道合胞病毒F抗原基因成功转化番茄植株，用果实特异表达抗原喂饲小鼠，可诱导小鼠产生特异的粘膜免疫反应、血清学抗体反应及TH1型细胞免疫反应(Sandhu et al.，2000)。Vasconcelos等用水稻胚乳特异性谷蛋白基因启动子驱动大豆铁蛋白基因，使转基因水稻谷粒中铁和锌的含量都有所增加，而且铁蛋白主要积累在胚乳中，不会在食品加工过程中丢失(Vasconcelos et al.，2003)。研究人员在一些单子叶植物的种子储藏蛋白中也分离了一些胚乳特异表达的顺式作用元件，最著名的GCN4元件被认为对维持胚乳特异表达活性是必须的(Wu et al.，1998)。但也有文献报导，GCN4元件仅仅是起到增强启动子在胚乳中的表达强度的作用，其并不能决定启动子胚乳特异表达的特性(Vickers et al.，2006)。另外，一些种子中特异表达的启动子如PsGNS2启动子(Buchner et al.，2002)、FAE1(Rossak et al.，2001)启动子等也有相关的报导。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，是禾本科作物功能基因组学研究的模式植物。启动子是精确调控基因表达的“开关”。因此对水稻组织器官特异表达启动子的分离克隆及深入研究，不仅有助于阐明植物形态、发育、代谢途径等基础理论，还可以指导转基因育种，创造巨大的经济效益和社会效益，更好的为人类生产生活服务。本发明就是利用有关分子生物学方法，从水稻“明恢63”基因组中分离克隆了同一个胚乳特异表达基因上游不同长度的启动子区域，将不同长度的启动子融合报告基因GUS导入水稻“中花11”中，验证其表达模式，进而鉴定出控制表达量及表达模式区段。

发明内容

本发明的目的在于克服现有可用于水稻基因工程研究的组织特异表达启动子数目的不足，从水稻“明恢63”(我国广泛应用的优良水稻恢复系)基因组中分离并鉴定出胚乳特异表达的启动子，有望将这些启动子用于水稻的基因工程改良。为了便于研究利用，我们创建了EnP3、EnP3-859、EnP3-678、EnP2-471、EnP3-292和EnP3-110共6个不同长度的启动子。将这些启动子融合报告基因β-葡糖醛酸酶基因(以下简称GUS基因)导入水稻“中花11”(中国农业科学院作物研究所商业经营品种)中，验证其表达模式，并进行表达量的测定，为日后利用该启动子奠定了基础。

本发明是这样实现的(本发明的技术路线见图1)：

利用华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻全生育期表达谱芯片数据库CREP(http://crep.ncpgr.cn)(Wang et al.，2010)及反转录PCR(以下简称RT-PCR)等方法，从水稻“明恢63”(我国广泛推广应用的优良水稻恢复系)基因组中分离并鉴定出具有胚乳特异性表达的启动子。申请人将其命名为EnP3、EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471、EnP3-292和EnP3-110。所述的启动子EnP3序列，它是序列表SEQ ID NO：1所示的序列。通过分析该启动子驱动GUS报告基因在转基因水稻中的表达模式发现：该启动子仅在转化植株的胚乳表达，并且随着胚乳发育阶段的不断进行，表达量呈现下降趋势；在其他组织如叶片、叶鞘、茎杆、根、花、颖壳及胚中均检测不到表达。所述的启动子EnP3-859、EnP3-678、EnP2-471和EnP3-292序列，分别是序列表SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5所示的序列，它们分别是由启动子EnP3截短的核心区859bp、678bp、471bp及292bp的序列。这4个片段均具有独立的启动基因表达的功能，并且在转化植株中的表达模式与EnP3相同，即仅在胚乳表达，不过表达量各有区别。所述的启动子EnP3-110序列，它是序列表SEQ ID NO：6所示的序列，是由EnP3-292进一步截短的110bp的序列，分析其驱动GUS报告基因在转基因水稻中表达情况发现，这个区段的表达模式发生了显著的改变：在叶片、叶鞘、茎杆及颖壳这些绿色组织中可以检测到表达，但是在根、花及种子(包括胚和胚乳)中却检测不到表达，成为一个短的绿色组织特异表达启动子。

本发明的具体步骤是：

首先在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻全生育期表达谱芯片数据库CREP(http://crep.ncpgr.cn)(Wang et al.，2010)上发现了一个可能是胚乳特异表达的候选基因，在美国国立生物研究所网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上获得该基因的序列，如SEQ ID NO：7所示，共459bp，以这459bp的序列设计引物来做RT-PCR反应从而进一步确定其表达谱，RT-PCR结果显示(见图2)：该基因仅在胚乳中表达。在此基础上用特异性引物以PCR的方法从水稻“明恢63”基因组中扩增得到一个被命名为EnP3的启动子候选片段，将该启动子候选片段EnP3与报告基因GUS编码序列构建成融合基因并装载到双元Ti载体DX2181(载体图及多克隆位点等信息见图3)上，装配成EnP3-GUS载体(见图4)，再通过农杆菌介导的遗传转化方法，将EnP3-GUS载体转入水稻受体“中花11”中，同时转化空载体DX2181作为阴性对照，转化花椰菜花叶病毒35S启动子驱动GUS(CaMV35S-GUS)作为阳性对照。获得转基因植株后通过细织化学染色及GUS活性定量分析，考察该启动子在胚乳发育各时期的表达变化，进而验证和克隆该启动子。检测结果表明：该启动子仅在转化植株的胚乳表达，并且随着胚乳发育阶段的不断进行，表达量呈现下降趋势；在其他组织如叶片、叶鞘、茎杆、根、花、颖壳及胚中均检测不到表达。采用片段缺失的方法，我们构建了5个来源于EnP3的5’端缺失片段连接GUS的表达载体，同样通过农杆菌介导的遗传转化方法将其转入水稻受体“中花11”中，分析这5个片段的表达模式，结果显示：来源于启动子EnP3的4个区段(EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471和EnP3-292)均具有独立的启动基因表达的功能，并且在转化植株中的表达模式与EnP3相同，即仅在胚乳表达，不过表达量各有区别；由EnP3-292进一步截短的EnP3-110区段的表达模式发生了显著的改变：在叶片、叶鞘、茎杆及颖壳这些绿色组织中可以检测到表达，但是在根、花及种子(包括胚和胚乳)中却检测不到表达，成为一个短的绿色组织特异表达启动子。

本发明的优点在于：

(1)本发明鉴定了胚乳特异表达的启动子EnP3及控制其表达量及表达模式的核心区域，为基因工程和分子育种提供了新的特异表达的启动子资源。

(2)本发明可以直接应用于水稻胚乳特异表达的启动子的鉴定和克隆。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1，公开了本发明克隆的的水稻胚乳特异表达启动子EnP3的核苷酸序列，长度为1040bp。

序列表SEQ ID NO：2是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子应用的核苷酸序列，长度为859bp。

序列表SEQ ID NO：3是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子应用的核苷酸序列，长度为678bp。

序列表SEQ ID NO：4是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子应用的核苷酸序列，长度为471bp。

序列表SEQ ID NO：5是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子应用的核苷酸序列，长度为292bp。

序列表SEQ ID NO：6是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列的克隆得到的作为另一个启动子应用的核苷酸序列，长度为110bp。

序列表SEQ ID NO：7是本发明克隆的水稻胚乳特异表达启动子EnP3在基因组中所驱动的基因(Genebank登录号为GI：31415924)的核苷酸序列，长度为459bp。

序列表SEQ ID NO：8是本发明克隆的水稻胚乳特异表达启动子EnP3在基因组中所驱动的基因(Genebank登录号为GI：31415924)编码的氨基酸序列，长度为134个氨基酸。

图1：实现本发明的技术路线图。

图2：利用RT-PCR的方法来分析EnP3在基因组中所驱动的基因(GI：31415924)的表达模式。上下列分别表示的为内参水稻Actin1基因和目的基因(GI：31415924)在各个组织中的表达情况。

图3：表示双元载体DX2181结构示意图。该载体是在pCAMBIA1380的基础上改造而来，在多克隆位点处以相反的方向分别构建了一个GUS基因和EGFP基因。

图4：构建好的以DX2181为骨架的表达载体简图。a为阴性对照，即DX2181空载体，无启动子驱动GUS基因表达；b为阳性对照，即用CaMV35S启动子来驱动GUS基因表达；c为EnP3及其系列缺失片段来驱动GUS基因表达。LB、RB分别为DX2181中T-DNA的左边界和右边界；hyg为潮霉素抗性筛选基因；gus为报告基因GUS(β-葡萄糖苷酸酶)；egfp为报告基因EGFP(增强的绿色荧光蛋白)；MCS表示多克隆位点；35sP表示CaMV35S启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)；EnP3-X表示EnP3及其系列缺失片段；箭头方向表示基因或启动子表达的方向。

图5：由EnP3驱动GUS基因的转化植株的各个组织的组织化学染色。a为叶片；b为叶鞘；c为茎杆；d为根；e为花；f为种子(含胚与胚乳)。

图6：由EnP3及其系列缺失片段驱动GUS基因的转化植株的成熟种子的组织化学染色。a、b、c、d、e、f分别表示的是启动子片段EnP3、EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471、EnP3-292和EnP3-110的表达情况，图中En表示胚乳，Em表示胚。

图7：由EnP3-110驱动GUS基因的转化植株的各个组织的组织化学染色。a为叶片；b为叶鞘；c为茎杆；d为根；e为花；f为种子(含胚与胚乳)。

图8：由EnP3-110驱动GUS基因的转化植株的各个组织的GUS活性定量检测，DX2181表示阴性对照。

图9：由EnP3及其系列缺失片段驱动GUS基因的转化植株的胚乳在不同发育时期的GUS活性定量检测。图例中的DAF表示开花后天数(days after flowering)；DX2181表示阴性对照。

具体实施方式

实施例1：胚乳特异表达候选基因(Genebank登录号为GI：31415924)的表达谱验证

材料准备：本实施例所用材料是籼稻品种(Oryza sativa ssp.Indica)明恢63(我国广泛应用的优良水稻恢复系)，种植方法是水培。营养液成分如下所示：1.44mM NH₄NO₃，0.3mM NaH₂PO₄，0.5mM K₂SO₄，1.0mM CaCl₂，1.6mM MgSO₄，0.17mM NaSiO₃，50μm Fe-EDTA，0.06μM(NH₄)₆Mo₇O₂₄，15μM H₃BO₃，8μMMnCl₂，0.12μM CuSO₄，0.12μM ZnSO₄，29μM FeCl₃，40.5μM Citric acid，pH5.5(Yoshida et al.，1976)。在孕穗期取叶片、叶鞘、茎杆、根、穗，受精14天后取胚乳。RNA提取采用Trizol Reagent(Invitrogen，Carisbad，CA，USA)方法。总RNA经1.4％琼脂糖胶电泳检测和浓度测定确认质量合格(18S、28S两条主带清晰无拖尾，OD260/OD280＝1.8-2.0)后方可进行后续试验。将各个组织的RNA反转录成cDNA，置于-20℃冰箱保存。反转录使用的试剂盒是Promega公司的M-MLV，按照产品说明书操作即可。

首先在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室水稻全生育期表达谱芯片数据库CREP(http://crep.ncpgr.cn)(Wang et al.，2010)中发现了一个可能是胚乳特异表达的候选基因，所对应的探针号是Os.13536.1.S1_at，芯片显示在胚乳发育的7，14，21天均高量表达，在其他组织无表达或表达量很低。该探针所表征的基因在TIGR上的登录号是LOC_Os03g55734，在NCBI上的基因号为GI：31415924，基因功能注释为“可能的醇溶谷蛋白(putative prolamin)”。基因大小为459bp，mRNA大小为459bp，编码134个氨基酸(见序列表SEQ ID NO：8)。设计能扩增部分mRNA的RT-PCR引物(YRJTZ3F：AAGCATCTCCCATACGCTGT，YRJTZ3R：TCAACAACAACCATAAGGAAAGA，扩增大小为430bp)，以水稻“明恢63”的叶片、叶鞘、茎杆、根、穗、胚乳的RNA反转录产物为模板，以水稻Actin1为内参(扩增引物为actin1F：GCCACACTGTCCCCATCTAT，actin1R：GCGACCACCTTGATCTTCAT)。PCR反应条件：94℃ 5min，94℃ 30sec，55.5℃ 30sec，72℃ 50sec，30个循环，72℃ 7min。PCR产物经0.8％琼脂糖胶电泳检测。检测结果见附图2。结果显示，候选基因GI：31415924在胚乳中表达，在其他组织不表达。

实施例2：胚乳特异表达启动子EnP3候选片段及相应缺失片段的获得(相应分子生物学常规操作参考《分子克隆实验指南(第二版)》(J.萨姆布鲁克等，1996))

明恢63基因组DNA的抽提：在明恢63分蘖盛期取新鲜叶片用于抽提其基因组DNA，具体方法为Murray报道的十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide，以下简称CTAB)抽提法(Murray and Thompson.1980)，抽提出的DNA完全溶解后置于-20℃冰箱保存。

在生物信息学网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上提取候选基因GI：31415924的上游序列，具体来讲是-976至+54(转录起始点为+1)区间共计1130bp作为启动子候选片段。将其命名为EnP3。利用PCR法，以抽提的明恢63基因组DNA为模板，通过设计特异引物(EnP3F：AAGCTTGGAGCATTTGTAGGAATGCC；EnP3R：GGATCCTGTTGACAGCGTATGGGAGA)来扩增EnP3，为了后续构建载体的方便，左右引物分别添加HindIII、BamHI酶切位点(下划线表示)及相应的保护碱基(阴影表示)。PCR反应条件：94℃ 5min，94℃ 1min，66℃ 50sec，72℃ 1min30sec，30个循环，72℃ 7min。

取EnP3的部分PCR产物用0.8％琼脂糖电泳检测。剩余的PCR产物用于做TA克隆。使用的试剂盒为Promega公司的T-Vctor系统。反应体系为5.0μl，具体如下：EnP3PCR产物1.9μl、T-Vctor 0.3μl、2倍缓冲液(以下简写为buffer)2.5μl、T₄ ligase 0.3μl。

连接产物于16℃低温水浴10h，然后电转化(1800伏，电击2-3秒)入大肠杆菌DH5α(该菌株为商业化的大肠杆菌菌株)，37℃复苏40min，涂含氨苄霉素(Amp)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)的平板，37℃培养过夜，挑选白斑用含Amp的LB培养基来扩大培养。抽提所摇菌的质粒，用HindIII和BamHI双酶切来筛选阳性克隆。酶切体系为20.0μl，具体如下：质粒3.0μl、10×K buffer2.0μl、HindIII0.1μl、BamHI0.1μl、ddH₂O14.8μl，37℃反应4h，酶切产物用0.8％琼脂糖电泳检测。挑选阳性克隆用ABI3730测序仪进行测序。测序结果显示来源于明恢63基因组的EnP3序列(序列表SEQ ID NO：1所示)与NCBI上报道日本晴的序列并非是100％完全匹配，存在少量差异，最终大小为1040bp，后续5’缺失片段的设计均以明恢63基因组的序列为准。

5个5’缺失片段与全长启动子共用同一个右引物(EnP3R：GGATCCTGTTGACAGCGTATGGGAGA)，左引物根据它们最终的扩增片段大小分别命名为EnP3F-859(AAGCTTTTGGAATTGCGCGAAGTTAG)、EnP3F-678(AAGCTTGCTAAATGTTACTTCCTCCG)、EnP3F-471(CAAGCTTGTCGTGACTTATGTAACACG)、EnP3F-292(AAGCTTGCACCAATGCACCATTGATC)和EnP3F-110(AAGCTTCCTATAAATAATCCCCTAGAGC)。在每条左引物5’端都引入HindIII酶切位点(以下划线表示)及相应的保护碱基(以阴影表示)。PCR模板为测序正确的TA-EnP3质粒。得到扩增产物之后，后续操作按照构建TA-EnP3的方法进行。

实施例3：胚乳特异表达启动子EnP3候选片段及相应缺失片段的转化载体构建(相应分子生物学常规操作参考J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南(第二版)》，科学出版社(1996)。

(1)酶切载体DX2181。DX2181载体是在pCAMBIA1380(该载体是澳大利亚CAMBIA(Center forthe Application of Molecular Biology to International Agriculture，CAMBIA)实验室在全世界公开交流使用的载体)的基础上改造而来，在多克隆位点处以相反的方向分别构建了一个GUS基因和EGFP基因，载体图及多克隆位点等信息见图3。用HindIII、BamHI双酶切DX2181，酶切产物用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司生产)回收，电泳检测其酶切完整性，置于-20℃冰箱保存。

(2)酶切EnP3及相应缺失片段的TA克隆质粒。用HindIII、BamHI双酶切经过测序为正确的EnP3及相应缺失片段的TA克隆质粒，酶切产物用0.8％琼脂糖电泳分离，然后目标带用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，电泳检测其酶切完整性，置于-20℃冰箱保存。

(3)将酶切回收的EnP3及相应缺失片段构建到载体DX2181上(见附图4)，电转化入大肠杆菌DH5α(该菌株为商业化的大肠杆菌菌株)。酶切检测与测序后将构建好的载体导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105菌株(该菌株为商业化的农杆菌菌株)，构成可用于转化的工程菌株。然后通过农杆菌介导的遗传转化法(林拥军等，2002)转化水稻品种“中花11”。

实施例4：农杆菌介导的遗传转化

农杆菌介导的遗传转化方法主要参照华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”所示的方法(林拥军等，2002)。转化受体为水稻品种“中花11”的成熟种子所诱导产生的胚性愈伤组织。经过预培养、侵染、共培养、筛选得到具有潮霉素抗性的愈伤，再经过分化、生根、炼苗和移栽，得到转基因植株。本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基配制过程中所涉及到得的主要试剂的名称及缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N₆max(N₆大量元素成分溶液)；N₆mix(N₆微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)N₆培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10X)配制)：

硝酸钾(KNO₃)            28.3g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)      4.0g

硫酸铵((NH₄)₂SO₄)       4.63g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)     1.85g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)     1.66g

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100X)配制：

碘化钾(KI)              0.08g

硼酸(H₃BO₃)             0.16g

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)     0.44g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)     0.15g

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂-EDTA)贮存液(按照100X浓缩液配制)：

将3.73克乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78克FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000ml，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100X浓缩液配制)：

烟酸(Nicotinic acid)      0.1g

维生素B1(Thiamine HCl)    0.1g

维生素B6(Pyridoxine HCl)  0.1g

甘氨酸(Glycine)           0.2g

肌醇(Inositol)            10g

加蒸馏水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(按照10X浓缩液配制)：

硝酸铵(NH₄NO₃)            16.5g

硝酸钾(KNO₃)              19.0g

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)     1.7g

硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)    3.7g

氯化钙(CaCl₂·2H₂O)    4.4g

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(按照100X浓缩液配制)：

硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)    2.23g

硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)    0.86g

硼酸(H₃BO₃)            0.62g

碘化钾(KI)             0.083g

钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)  0.025g

硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)    0.0025g

氯化钴(CoCl₂·6H₂O)    0.0025g

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液(1mg/ml)的配制：

称取2，4-D 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1mg/ml)的配制：

称取6-BA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取NAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1mg/ml)的配制：

称取IAA 100mg，用1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)的配制：

称取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

称取AS 0.392g，加入DMSO 10ml溶解，分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液配制：

称取氢氧化钾5.6g，用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

N6max母液(取已经制备好的10X浓缩液，下同)    100ml

N6mix母液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)        10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)   10ml

维生素贮存液(取已经制备好的100X浓缩液，下同)     10ml

2，4-D贮存液(取上述制备好的)                     2.5ml

脯氨酸(Proline)                                  0.3g

CH                                               0.6g

蔗糖                                             30g

Phytagel                                         3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

N6max母液(10X)                                   100ml

N6mix母液(100X)                                  10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)                             10ml

维生素贮存液(100X)                               10ml

2，4-D贮存液                                     2.0ml

脯氨酸                                           0.5g

CH                                               0.6g

蔗糖                                             30g

Phytagel                                         3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

N6max母液(10X)                                   12.5ml

N6mix母液(100X)                                  1.25ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)                             2.5ml

维生素贮存液(100X)                               2.5ml

2，4-D贮存液                                     0.75ml

CH                                               0.15g

蔗糖                                             5g

琼脂粉                                           1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

N6max母液(10X)                 12.5ml

N6mix母液(100X)                1.25ml

Fe^2+EDTA贮存液(100X)           2.5ml

维生素贮存液(100X)             2.5ml

2，4-D贮存液                   0.75ml

CH                             0.2g

蔗糖                           5g

琼脂粉                         1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250微升AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

N6max母液(10X)                 5ml

N6mix母液(100X)                0.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)           0.5ml

维生素贮存液(100X)             1ml

2，4-D贮存液                   0.2ml

CH                             0.08g

蔗糖                           2g

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1ml无菌葡萄糖贮存液和100微升AS贮存液。

6)选择培养基

N6max母液(10X)                 25ml

N6mix母液(100X)                2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)           2.5ml

维生素贮存液(100X)             2.5ml

2，4-D贮存液                   0.625ml

CH                             0.15g

蔗糖                           7.5g

琼脂粉                         1.75g

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升HN(50mg/ml)和400微升CN(250mg/ml)分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400mg/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250mg/l)。

7)预分化培养基

N6max母液(10X)             25ml

N6mix母液(100X)            2.5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)       2.5ml

维生素贮存液(100X)         2.5ml

6-BA贮存液                 0.5ml

KT贮存液                   0.5ml

NAA贮存液                  50微升

IAA贮存液                  50微升

CH                         0.15g

蔗糖                       7.5g

琼脂粉                     1.75g

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升HN(50mg/ml)250微升CN(250毫g/ml)，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

N6max母液(10X)             100ml

N6mix母液(100X)            10ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)       10ml

维生素贮存液(100X)         10ml

6-BA贮存液                 2ml

KT贮存液                   2ml

NAA贮存液                  0.2ml

IAA贮存液                  0.2ml

CH                         1g

蔗糖                       30g

Phytagel                   3g

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

MSmax母液(10X)             50ml

MSmix母液(100X)            5ml

Fe²⁺EDTA贮存液(100X)       5ml

维生素贮存液(100X)         5ml

蔗糖                       20g

Phytagel                   3g

加蒸馏水至900ml，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口，按上述方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

1)愈伤诱导

a.将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；

b.用灭菌水洗种子4-5次；

c.将种子放在诱导培养基上；

d.将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

2)愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

4)农杆菌培养

a.在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司商业化的农杆菌菌株)两天，温度28℃；

b.将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

5)农杆菌侵染

a.将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

b.调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；

c.将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

d.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

6)愈伤洗涤和选择培养

a.灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

b.浸泡在含400毫克/L羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；

c.转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

d.转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

7)分化

a.将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

b.转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(1500-2000Lux)下培养，培养温度26℃。

8)生根

剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照(1500-2000Lux)下培养2-3周，培养温度26℃。

9)移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

实施例5：PCR法检测转基因阳性植株

转化苗移入温室后，待其返青，然后分单株取1-2cm幼嫩叶片，抽提其基因组DNA为模板，用PCR法检测阳性植株。扩增片段为报告基因gus的部分片段，大小为699bp。引物序列为GUS-F：GGGCGAACAGTTCCTGATTA，GUS-R：AACGTATCCACGCCGTATTC。PCR反应条件：94℃ 5min，94℃ 50sec，57℃ 40sec，72℃ 50sec，30个循环，72℃ 7min。PCR产物经0.8％琼脂糖胶电泳检测。通过此法，可剔除阴性植株。

小量叶片基因组DNA的提取方法：取适量幼嫩叶片，加800ul 1.5×CTAB(1.5×CTAB配方：1.5％CTAB、75mM Tris-HCl、15mM EDTA及1.05M NaCl)研磨，转入1.5ml离心管中；65℃水浴30min；加入600μL氯仿/异戊醇(体积比为24∶1)上下颠倒数次(约15min)，下层液相呈深绿色为止；室温下12000r/min离心10min；取500μL上清于一新1.5ml离心管，加入预冷的95％乙醇1mL，混匀后置-20℃，30min；室温下12000r/min离心10min，去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，自然干燥；加入100μLddH₂O溶解，备用。

实施例6：GUS组织染色法分析EnP3候选片段及相应缺失片段各种组织中的表达模式

分别取经PCR检测(参考实施例5)为阳性的EnP3-GUS转化植株(10株以上)的根、叶片、叶鞘、茎杆、颖壳、花、种子切成约0.5CM长度的适当大小，浸入约200μl的GUS染液，37℃过夜，然后用75％酒精脱色，观察是否有蓝色出现。染色液的配方参照Jefferson等报道的方法(Jefferson等，1987)。结果表明：EnP3候选片段仅在转化植株的胚乳表达，在其他组织如叶片、叶鞘、茎杆、根、花、颖壳及胚中均检测不到表达(见附图5)。这些结果证实，EnP3为一个胚乳特异表达的启动子。

用同样的办法分析了EnP3的系列缺失片段驱动下的GUS在各种组织中的表达模式(见图6)。结果表明：启动子EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471、EnP3-292均具有独立的启动基因表达的功能，并且在转化植株中的表达模式与EnP3相同，即仅在胚乳表达，不过表达量各有区别。同时发现，由EnP3-292进一步截短的EnP3-110区段的表达模式发生了显著的改变：在叶片、叶鞘、茎杆及颖壳这些绿色组织中可以检测到表达，但是在根、花及种子(包括胚和胚乳)中却检测不到表达，成为一个短的绿色组织特异表达启动子(见图7)。

实施例7：启动子EnP3及相应缺失片段GUS活性定量检测

取EnP3及相应缺失片段经GUS组织化学染色为阳性(参考实施例6)植株及转空载体DX2181植株的T₀代种子，统一播种。待其开花受精后7天、14天、21天时取胚乳组织，抽提其总蛋白，然后测定其GUS活性(见图9)；同时取EnP3-110及空载体DX2181抽穗期的叶片、叶鞘、茎杆、穗子和根组织，同样抽提其总蛋白，然后测定其GUS活性(见图8)。具体方法参考Bradford及Jefferson等报道的方法(BradfordM，1976；Jefferson等，1987)。结果表明：在胚乳组织发育的不同时期，启动子片段(EnP3、EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471和EnP3-292)和阴性对照DX2181相比，均有显著差异；启动子片段EnP3-110的主要绿色组织(叶片、叶鞘、茎杆、颖壳(实验测量时为整穗))和阴性对照DX2181相比，均有显著差异这和组织化学染色结果是吻合的，即EnP3、EnP3-859、EnP3-678、EnP3-471和EnP3-292为胚乳特异表达启动子，而EnP3-110为一绿色组织特异表达启动子。从胚乳组织的表达量上来看，全长启动子EnP3的表达量最高(在各个发育时期均是如此)，并且随着胚乳发育阶段的不断进行，表达量呈现下降趋势。对EnP3-678、EnP3-471和EnP3-292这三个启动子来讲，它们的表达模式与EnP3相同，即：随着胚乳发育阶段的不断进行，表达量呈现下降趋势；并且随着启动子长度的逐渐缩短，对同一发育时期比较而言，表达量呈现下降趋势。与其他几个胚乳特异表达的启动子相比而言，EnP3-859的表达模式略有不同，即在胚乳发育前期(开花受精后7天及14天)表达量无明显变化，在后期有一个急剧下降的过程。绿色组织特异表达启动子EnP3-110在叶片、叶鞘中的表达量(以阴性对照DX2181的相应组织为基准)要强于在茎杆和穗子中的表达量。同时从图上可以发现胚乳中开花受精后7天的GUS活性从EnP3到EnP3-859以及EnP3-471到EnP3-292有一个急剧下降的现象；而开花受精后14天及21天的GUS活性的急剧下降则出现在EnP3-471到EnP3-292。从上面所有结果可以推测启动子EnP3是一个在胚乳发育前期高量表达的特异表达启动子；在胚乳发育早期1040-859及471-292这两个区段中可能存在控制其表达量的顺式作用元件；在胚乳发育的中后期471-292这个区段中可能存在控制其表达量的顺式作用元件。EnP3-110为一绿色组织特异表达启动子，而EnP3-292为一胚乳特异表达启动子，表达模式发生显著改变，说明292-110这个区段可能存在控制启动子表达模式的顺式作用元件。

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序列表

<110>华中农业大学

<120>水稻胚乳特异表达基因的启动子及表达模式鉴定

<130>

<141>2010-04-15

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

 

<210>1

<211>1040

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1040)

<223>

<400>1

ggagcatttg taggaatgcc acgtggcggc ttaggagcgt ttgtagaaag tttaatggat     60

ttttagtata taatagaaga tttgtataag acagcgtact agctatacat gtacaaggga    120

gaagtgagga taacaaagct aagtatggcg caattctgat tttccataat tccattaact    180

tttggaattg cgcgaagtta gtttttcccc cctttttttc acgttttcat ttataaagta    240

acagtgttcg atccttccat ttcctgttaa gaactcaatg tacatgccaa actacaaata    300

tgtatgtatt ctattaaagc acttttactt gaaaaaaaaa ctctaacgta acaatcacct    360

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tctcccatac gctgtcaaca                                               1040

 

<210>2

<211>859

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(859)

<223>

<400>2

ttggaattgc gcgaagttag tttttccccc ctttttttca cgttttcatt tataaagtaa   60

cagtgttcga tccttccatt tcctgttaag aactcaatgt acatgccaaa ctacaaatat  120

gtatgtattc tattaaagca cttttacttg aaaaaaaaac tctaacgtaa caatcaccta  180

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atcctttttg gcgtgtaata ttgctattac ctataaataa tcccctagag caattgttat  780

ctcatcaccc tcaacatata atcttctaca tttacaccat ctagtaatct tgttaagcat  840

ctcccatacg ctgtcaaca                                               859

 

<210>3

<211>678

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(678)

<223>

<400>3

gctaaatgtt acttcctccg tttcacaata taagtcattc tagcatttcc cacattcata   60

ttgatgttaa tgaatctcga catctagatt cattaacatt aatatgaatg tgggaaatgc  120

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tgtgaaacgg agggagtata tatgtaagtc gtgacttatg taacacgctc ttaaaattgg  240

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agaatacaaa tttagtttaa catagtgccg agccaatatg gtatatcttt atcatcagaa  360

 

tttgtttcca cgcaattctc aataaagcac caatgcacca ttgatcaaac acctttatat  420

ctacagcatc atctcgccac gttcttccaa aatattggtt gaacaaatgt ccaaatacac  480

ctcatgactc attgtttcta gcttacttga cctccaccag gtagttttgc aaaaattaaa  540

tcctttttgg cgtgtaatat tgctattacc tataaataat cccctagagc aattgttatc  600

tcatcaccct caacatataa tcttctacat ttacaccatc tagtaatctt gttaagcatc  660

tcccatacgc tgtcaaca                                                678

 

<210>4

<211>471

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(471)

<223>

<400>4

gtcgtgactt atgtaacacg ctcttaaaat tggacaaatt atatatatgc ttataatcaa   60

aatactactt cacccatcta aaagaatatt gttagaatac aaatttagtt taacatagtg  120

ccgagccaat atggtatatc tttatcatca gaatttgttt ccacgcaatt ctcaataaag  180

caccaatgca ccattgatca aacaccttta tatctacagc atcatctcgc cacgttcttc  240

caaaatattg gttgaacaaa tgtccaaata cacctcatga ctcattgttt ctagcttact  300

tgacctccac caggtagttt tgcaaaaatt aaatcctttt tggcgtgtaa tattgctatt  360

acctataaat aatcccctag agcaattgtt atctcatcac cctcaacata taatcttcta  420

catttacacc atctagtaat cttgttaagc atctcccata cgctgtcaac a           471

 

<210>5

<211>292

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(292)

<223>

<400>5

gcaccaatgc accattgatc aaacaccttt atatctacag catcatctcg ccacgttctt   60

ccaaaatatt ggttgaacaa atgtccaaat acacctcatg actcattgtt tctagcttac  120

ttgacctcca ccaggtagtt ttgcaaaaat taaatccttt ttggcgtgta atattgctat  180

tacctataaa taatccccta gagcaattgt tatctcatca ccctcaacat ataatcttct  240

acatttacac catctagtaa tcttgttaag catctcccat acgctgtcaa ca          292

 

<210>6

<211>110

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(110)

<223>

<400>6

cctataaata atcccctaga gcaattgtta tctcatcacc ctcaacatat aatcttctac    60

atttacacca tctagtaatc ttgttaagca tctcccatac gctgtcaaca              110

 

<210>7

<211>459

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(459)

<223>

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(459)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(55)..(459)

<223>

<400>7

ctacatttac accatctagt aatcttgtta agcatctccc atacgctgtc aaca atg     57

                                                            Met

                                                            1

gca tca tac aag atc ttg gtt gtc ttt gct ttg cta gct ctt tct gca    105

Ala Ser Tyr Lys Ile Leu Val Val Phe Ala Leu Leu Ala Leu Ser Ala

            5                   10                  15

agt gca gct acc gca atc acc acc act ata cca tac ttc cca tca aca    153

Ser Ala Ala Thr Ala Ile Thr Thr Thr Ile Pro Tyr Phe Pro Ser Thr

        20                  25                  30

cta gca atg ggc acc atg aat ccc tgt aag ctg tac atg atg caa act    201

Leu Ala Met Gly Thr Met Asn Pro Cys Lys Leu Tyr Met Met Gln Thr

    35                  40                  45

ttg ggc atg ggt agc tac gca acc atg ttc atg tca caa cca att gct    249

Leu Gly Met Gly Ser Tyr Ala Thr Met Phe Met Ser Gln Pro Ile Ala

50                  55                  60                  65

ctc ctg caa caa caa tgt tgc atg caa cta caa ggc atg ata cca cag    297

Leu Leu Gln Gln Gln Cys Cys Met Gln Leu Gln Gly Met Ile Pro Gln

                70                  75                  80

tgc cat tgt ggt gct agt tgt caa atg atg cag aac atg caa aat gct    345

Cys His Cys Gly Ala Ser Cys Gln Met Met Gln Asn Met Gln Asn Ala

            85                  90                  95

att tgt ggt gga ctc ggg caa caa caa atg atg atg aag atg gtg atg    393

Ile Cys Gly Gly Leu Gly Gln Gln Gln Met Met Met Lys Met Val Met

        100                 105                 110

caa ctg cca tat gtg tgc aac atg gca ccc gcc aac ttt caa ctc ttt    441

Gln Leu Pro Tyr Val Cys Asn Met Ala Pro Ala Asn Phe Gln Leu Phe

    115                 120                 125

cct tat ggt tgt tgt tga                                            459

Pro Tyr Gly Cys Cys

130

 

<210>8

<211>134

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>8

Met Ala Ser Tyr Lys Ile Leu Val Val Phe Ala Leu Leu Ala Leu Ser

1               5                   10                  15

Ala Ser Ala Ala Thr Ala Ile Thr Thr Thr Ile Pro Tyr Phe Pro Ser

            20                  25                  30

Thr Leu Ala Met Gly Thr Met Asn Pro Cys Lys Leu Tyr Met Met Gln

        35                  40                  45

Thr Leu Gly Met Gly Ser Tyr Ala Thr Met Phe Met Ser Gln Pro Ile

    50                  55                  60

Ala Leu Leu Gln Gln Gln Cys Cys Met Gln Leu Gln Gly Met Ile Pro

65                  70                  75                  80

Gln Cys His Cys Gly Ala Ser Cys Gln Met Met Gln Asn Met Gln Asn

                85                  90                  95

Ala Ile Cys Gly Gly Leu Gly Gln Gln Gln Met Met Met Lys Met Val

            100                 105                 110

Met Gln Leu Pro Tyr Val Cys Asn Met Ala Pro Ala Asn Phe Gln Leu

        115                 120                 125

Phe Pro Tyr Gly Cys Cys

    130