一种自发淋巴高转移性人卵巢癌细胞系

摘要

本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，具体涉及一种自发淋巴高转移性人卵巢癌细胞系及其建立方法和用途。本发明以人卵巢癌细胞系SKOV-3(ATCC编号：HTB-77，)为亲本细胞，通过BALB/c裸小鼠腹腔注射、腹膜后淋巴结连续筛选、体外扩增和传代等策略，分离得到了具有自发性淋巴高转移潜能的人卵巢癌细胞系SKOV-3/LN403，保藏编号：CGMCC No.2940，本发明细胞系以及由此建立的动物模型能模拟卵巢癌患者的临床实际情况，为研究卵巢癌淋巴结转移的生物学行为和调控机制，及其为临床抗转移药物的筛选提供了理想的实验工具。

说明书

技术领域

本发明属生物技术、微生物动物细胞系领域，具体涉及一种自发淋巴高转移性人卵巢癌细胞系及其建立方法和用途。

背景技术

研究报道，卵巢癌死亡率位居女性生殖系统恶性肿瘤首位，高复发转移率和化疗耐药成为影响预后的两大特点。淋巴转移是卵巢癌早期播散的主要途径，是引起卵巢癌术后复发、影响预后的重要因素。因卵巢癌死亡的患者中有48％～70％发生淋巴结转移(Pereira A，Magrina JF，Rey V，et al.Pelvic and aortic lymph nodemetastasis in epithelial ovarian cancer.Gynecol Oncol.2007；105：604-608.)。在进展期的患者中腹膜后淋巴结的转移率为55％～75％(Di Re F，Baiocchi G.Value of lymph node assessmentin ovarian cancer：Status of the art at the end of the secondmillennium.Int J Gynecol Cancer.2000；10：435-442.)。腹膜后淋巴结转移与患者生存率相关，有报道(吴小华，张志毅.卵巢癌腹膜后淋巴结切除术：生存预后因素分析.现代妇产科进展.1996；5：133-136.)有淋巴结转移的患者的死亡风险是无淋巴结转移患者的2.75倍。因此，有必要加强对卵巢癌细胞淋巴转移机制的研究，而建立可靠的淋巴高转移细胞系和动物模型则是当务之急。

在人卵巢癌细胞系中，可用于小鼠移植瘤模型转移研究的细胞系包括SKOV-3、CAOV-3、CAOV-4、OVCAR-3、AO、3AO及HO-8910等。由这些细胞株所建立的裸鼠皮下移植瘤和腹腔转移瘤模型均少见淋巴结转移的发生。其中AO、CAOV-3、CAOV-4和OVCAR-3有相对较高的转移率，但研究显示主要是出现在肺转移(60％-90％)(高庆蕾，孟力，王世宣，et al.卵巢癌高频转移细胞模型的建立及其与nm23-H1的相关性研究.现代妇产科进展.2003；12：161-163.)。而许沈华等(许沈华，钱丽娟，牟瀚舟，et al.高转移人卵巢癌细胞系HO-8910PM的建立及其生物学特性.中华病理学杂志.1998；27：451-452.)从HO-8910中建立的卵巢癌高转移株HO-8910PM也是通过肺转移灶建立的。临床实践显示，卵巢癌很少发生肺转移，研究者认为，从肺转移灶中寻找的高转移株似不能完全反应临床真实情况。另有学者从低转移潜能的卵巢癌细胞株SKOV-3从分离出淋巴定向转移细胞株SKOV3-pm3，淋巴结转移率可达到100％(阮和云，黎丹戎，李力，et al.卵巢癌淋巴结定向转移裸鼠动物模型的建立.现代妇产科进展.2007；16：338-340.)。但是，所建立的卵巢癌转移模型是采用细胞在裸鼠足垫注射，从局部引流淋巴结内筛选到定向到淋巴结的高转移细胞株。该模型只有淋巴结转移，没有腹腔转移和腹水，与患者临床病情转归有所不同。

发明内容

本发明的目的是提供一种自发淋巴高转移性人卵巢癌细胞系-SKOV-3/LN403。本发明的进一步目的是提供该淋巴高转移性人卵巢癌细胞系的医用用途。

本发明以人卵巢癌细胞系SKOV-3(美国典型培养物保藏中心ATCC编号：HTB-77，由一位64岁女性卵巢腺癌患者的腹水中分离而得)为亲本细胞，通过多次BALB/c裸小鼠腹腔注射、腹膜后淋巴结连续筛选、体外扩增和传代等策略，分离得到了具有自发性淋巴高转移潜能的人卵巢癌细胞系SKOV-3/LN403。已于2009年3月27日保藏，保藏单位：CGMCC，北京市朝阳区大屯路，保藏编号：CGMCC No.2940，分类命名：人卵巢癌细胞系参照的细胞株为SKOV-3/LN403，该细胞株具有明显的淋巴高转移性。

本发明细胞系具有以下生物学特性：

1)SKOV-3/LN403与其亲本肿瘤细胞SKOV-3相比细胞形态类似，均为不规则形，但多呈集落生长；

2)SKOV-3/LN403在体外的细胞生长、增殖能力和侵袭能力均高于其亲本细胞；

3)接种BALB/c裸小鼠后患鼠的生存期显著缩短，淋巴转移率由亲本肿瘤细胞SKOV-3的10％(n＝10)上升为90％(n＝10)。

本发明的细胞系SKOV-3/LN403具有以下特点：

1.所建立的动物模型接近于卵巢癌患者的临床实际情况：能广泛腹腔内转移；血性腹水；淋巴转移率高达90％，累及腹膜后淋巴结。

2.生存期缩短(35.1±8.3)vs(64.5±21.2)，可使实验周期缩短，便于观察。

3.遗传背景清楚，生物学特性稳定：来自于广泛使用的人卵巢癌细胞系SKOV-3，经多次传代及修饰后仍保持稳定。

本发明细胞系以及由此建立的动物模型能模拟卵巢癌患者的临床实际情况，为研究卵巢癌淋巴结转移的生物学行为和调控机制，及其为临床抗转移药物的筛选提供了理想的实验工具。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。

附图说明

图1是SKOV-3/LN403与SKOV-3细胞形态学差异(倒置相差显微镜×200倍)。

图2是SKOV-3/LN403与SKOV-3细胞的生长曲线。

图3是SKOV-3/LN403腹膜后淋巴结转移。

图4是SKOV-3/LN403淋巴结浆液性腺癌转移(HE×200倍)。

具体实施方式

实施例1

(一)细胞培养

本发明所涉及的细胞均培养于含10％胎牛血清(FCS)的McCoy’s5A细胞培养基中。培养温度为37℃，气体环境为5％C02/95％空气，湿度为饱和湿度。传代时，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，按1∶3的比例传代。

(二)淋巴高转移细胞的筛选和建系

1.淋巴高转移细胞的首轮筛选

①将处于生长对数期的SKOV-3细胞用0.25％的胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液；

②无菌条件下，用1ml注射器将肿瘤细胞接种于6周龄BALB/c雌性裸小鼠腹腔，接种量为5×10⁶细胞/1ml/只，共五只；

③常规饲养4周后，断头放血，处死裸小鼠，并用75％的酒精浸泡消毒5分钟；

④无菌操作，解剖裸小鼠，取出腹膜后淋巴结，在生理盐水中漂洗3次；

⑤剪取淋巴结，剪碎后，移至6孔板中培养；

⑥待细胞贴壁后，更换新鲜细胞培养基；

⑦用半消化法和半机械法清除成纤维细胞；

⑧体外继续扩增本轮筛选所得的肿瘤细胞，部分用于下轮筛选，部分予以冻存备用。

2.淋巴高转移细胞的连续筛选和建系

同法进行第2～4轮肺转移细胞的筛选，各轮所得的细胞分别命名为SKOV-3/LN101～5、SKOV-3/LN201～5、SKOV-3/LN301～5和SKOV-3/LN401～5。其中SKOV-3/LN403在体外长期培养逾10代，成为连续传代的细胞系。

(三)小鼠淋巴转移实验

1.BALB/c裸小鼠

①将处于对数生长期的SKOV-3和SKOV-3/LN403细胞用0.25％的胰蛋白酶消化，分别制成单细胞悬液；

②无菌条件下，用1ml注射器将肿瘤细胞接种于裸小鼠腹腔，接种量为5×10⁶细胞/1ml/只；

③隔天观察裸小鼠的健康状况、腹水生成情况和生存期；

④患鼠死亡时解剖并经病理检查有无淋巴结转移。

结果显示：

通过多次BALB/c裸小鼠腹腔注射、腹膜后淋巴结连续筛选、体外扩增和传代等策略，分离得到了具有自发性淋巴高转移潜能的人卵巢癌细胞系SKOV-3/LN403。该细胞系体外培养生长良好，每3天传代一次。

SKOV-3和SKOV-3/LN403的细胞形态类似，均为不规则形，但多呈集落生长(图1)。

采用MTT法描记SKOV-3和SKOV-3/LN403的细胞生长曲线，结果表明SKOV-3/LN403细胞生长、增殖能力高于SKOV-3细胞(图2)。

Transwell实验的结果证实，SKOV-3/LN403细胞较SKOV-3细胞有更强的侵袭能力。前者穿透人工基底膜的细胞数是163±26/HP，后者穿透人工基底膜的细胞数是54±8/HP。

接种SKOV-3/LN403细胞后小鼠的平均生存期为(35.1±8.3)天，患鼠腹腔肿瘤分布广泛，肿块增大相互融合成片，有6只出现血性腹水，淋巴转移率为90％；接种SKOV-3细胞后小鼠的平均生存期为(64.5±21.2)天，患鼠腹腔多处肿瘤种植，有1只出现少许血性腹水，淋巴转移率为10％。图3显示腹膜后淋巴结，病理证实为转移性浆液性腺癌(图4)。