检测含有筛选基因Hpt的转基因植物及产品的基因芯片及其应用

摘要

本发明涉及一种检测含有筛选基因Hpt的转基因植物及产品的基因芯片及其应用，属于生物工程技术领域。该种芯片，包括表面醛基化修饰的载玻片和阵列涂布于其上的筛选基因Hpt探针以及核酸固定的阳性对照、杂交阳性对照、阳性质控探针、阴性质控探针和空白对照；其中所述的筛选基因Hpt的序列为NH2-(CH2)6-O-Poly(dT)15-ATTTCGATGATGCAGCTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGC。本发明设计的检测转基因植物及其产品筛选基因Hpt的基因芯片，能进行转基因植物及其产品筛选基因Hpt特异性检测，具有较高的特异性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测含有筛选基因Hpt的转基因植物及产品的基因芯片及其应用，属于生物芯片技术领域。

背景技术

近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获得批准种植和生产，有的被加工成食品、饲料或用做食物添加剂。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，40多个国家和地区相继实施转基因产品标识制度。

各国转基因标识制度的相继建立，对转基因检测技术的灵敏度和准确性提出了严格的要求，各种转基因检测技术也成为研究热点。常用的转基因检测方法有聚合酶链式反应(PCR)法，外源蛋白检测法，基因芯片检测技术。虽然国外对转基因作物检测方法研究已有十几年，但由于转基因作物的种类多、数量大，一些转基因产品经过深加工、各种条件处理与保存后，转基因成分部分或完全降解，所以检测难度大。因此，需要根据科学技术的发展不断更新检测方法。

但不容乐观的是，设计PCR反应引物是一个棘手的问题，必须确保反应中两条引物有相近的熔接温度，引物之间不会发生相互作用，另外还要注意非特异性扩增，特别是当非特异性扩增带与目的带相近时，就会出现假阳性问题，从而干扰结果的判断。随着GMO检测技术的发展情况及研究趋势，基因芯片技术在此展示了更大的优势。基因芯片检测原理是利用带有荧光标记的样品同探针特异杂交，从而产生阳性信号。因而非目的带的扩增只要不产生阳性信号，就不会干扰，而且芯片检测不依据电泳条带。并且基因芯片可根据任何已知基因组序列设计特异性探针，以人工合成的方法快速制备芯片，且高度并行性、高通量、微型化、自动化、高准确度和灵敏度等优点具有广泛的应用前景。

经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现关于Hpt基因的基因芯片检测技术的专利报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足和实际检测的需要，本发明提供了一种特异性检测含筛选基因Hpt的转基因植物及其产品的基因芯片及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测含筛选基因Hpt的转基因植物及其产品的基因芯片，包括表面醛基化修饰的载玻片和阵列涂布于其上的筛选基因Hpt探针以及核酸固定的阳性对照(HEX)、杂交阳性对照(PC)、阳性质控探针(18S rRNA)、阴性质控探针和空白对照；

其中，所述阳性对照和杂交阳性对照为北京博奥生物技术有限公司提供的晶核酸固定阳性对照(HEX)(产品号为：502000)和晶杂交阳性对照(PC)(产品号为：503000)；

所述阳性质控探针为18S rRNA，其探针序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-ATGGTGGTGACGGGTGACGGAGAATTAGGGTTCGATTCCG；

所述阴性质控探针为SHDC-人类表达特异蛋白基因，其探针序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-ATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCC，

所述阳性质控探针和阴性质控探针序列均来源于许小丹，文思远等(检测及鉴定转基因大豆寡核苷酸芯片的制备.农业生物技术学报，2005，13(4)：429-434)的报道；

所述空白对照为点样液-双蒸水；

所述的筛选基因Hpt探针序列为：

NH2-(CH2)6-O-Poly(dT)15-ATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGC。

上述检测转基因植物及其产品筛选基因Hpt的基因芯片，还包括探针对照，探针对照选自转基因玉米Bt176转化体特异性探针、转基因玉米Bt11转化体特异性探针、转基因玉米TC1507转化体特异性探针、转基因玉米Mon810转化体特异性探针、转基因玉米GA21转化体特异性探针。

转基因玉米GA21、Bt11、Mon810、TC1507和Bt176的转化体特异性探针均来源于路兴波，武海斌等(转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片检测方法的研制.作物学报，2009，35(8)：1432-1438)的报道。

所述芯片的阵列布局为人为规定，可以任意布局，本发明所用的布局如图1所示。

所述的阳性对照、杂交阳性对照、阳性质控探针、阴性质控探针、空白对照、筛选基因Hpt探针的点样浓度为25μmol/L。探针对照的点样浓度为25μmol/L。

本发明的基因芯片的的应用方法为：提取待测植物的基因组DNA，然后在二重荧光PCR反应体系中扩增，其中，荧光染料为Cy3-Amidite；然后取PCR产物，与杂交液混匀后，于PCR仪中95℃热变性10min，冰浴骤冷后加样于芯片上的点样区，盖玻片封片；42℃水浴杂交2h；杂交后，芯片分别在42℃的洗液I和洗液II中各清洗4min，500r/min离心甩干，用晶LuxScanTM 10K激光共聚焦扫描仪进行扫描，波长532nm；PMT为850v，Power为90v，产生分析精度为10μm的16位TIFF图像；用LuxScan3.0软件进行数据采集和图像分析，分析扫描图像的荧光强度值以确定是否含有Hpt基因；

所述杂交液包括：3×SSC缓冲液，0.2％SDS，25％甲酰胺，5×Denhart’s，33nmol/LPC杂交阳性对照样品；

所述洗液I包括：2×SSC缓冲液，0.1×SDS；

所述洗液II为0.2×SSC缓冲液。

本发明的芯片的制备原理是：以含有筛选基因Hpt的转基因水稻科丰6号为材料；以转基因玉米Bt11、Bt176和TC1507，转基因大豆GTS40-3-2，转基因棉花Mon531、Mon1445、Mon15985和LLcotton25，转基因油菜MS8、RF3，非转基因玉米郑单958、非转基因大豆1138-2、非转基因棉花中49等作为对照，根据Hpt序列，利用Primer premier 5.0引物设计软件设计特异性引物，并对引物进行筛选和优化。荧光标记引物在5’端用Cy3-Amidite进行荧光标记。利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件设计40mer Oligo Hpt备选探针，探针在5’端以氨基己烷修饰，氨基和探针序列之间以间隔臂poly(dT15)相连，使最终探针长度为55bp。

检测含筛选基因Hpt的转基因植物及其产品的基因芯片在检测转基因植物及其产品筛选基因Hpt特异性中的应用。可以利用本发明设计的引物进行转基因植物及其产品筛选基因Hpt特异性定性PCR检测，也可以利用本发明设计的探针进行转基因植物及其产品筛选基因Hpt特异性芯片检测。

本发明检测含筛选基因Hpt的转基因植物及其产品的基因芯片，具有很好的特异性，灵敏度高，为筛选基因Hpt基因芯片检测分析提供了基于简单、可靠的测定方法，可以用于转基因植物及其产品的检测。本发明为转基因标识提供了一种有用的参考，为转基因产品的控制提供了必要的手段，可以满足我国在进出口检验、种子市场抽检、转基因作物监控监测等方面的检测需求，提高我国转基因生物的监管水平。

附图说明

图1为本发明的基因芯片阵列分布图；

其中：a1～a5-核酸固定的阳性对照(HEX)，a6～a10、b6～b10、c6～c10、d1～d5、d6～d10、c1～c5、e6～e10-空白对照(点样液)；b1～b5-杂交阳性对照(PC)；e1～e5-Hpt探针；f1～f5，g6～g10-阳性质控探针(18S rRNA)；f6～f10，g1～g5-阴性质控探针(SHDC-人类表达特异蛋白基因)；

图2为本发明的实施例1中的基因芯片阵列分布图；

其中，A1～A5-核酸固定的阳性对照(HEX)；A6～A10，B6～B10-空白对照(点样液)；B1～B5-杂交阳性对照(PC)；C1～C5-Bt11；C6～C10-GA21；D1～D5-TC1507；D6～D10-Mon810；E1～E5-Hpt探针；E6～E10-Bt176；F1～F5，G6～G10-阳性质控探针(18SrRNA)；F6～F10，G1～G5-阴性质控探针(SHDC-人类表达特异蛋白基因)。

图3为筛选基因Hpt特异性PCR检测示意图；

其中：M-分子量Marker；1-阳性对照DNA模板；2-转基因水稻科丰6号基因组DNA模板；3-转基因玉米Bt11基因组DNA模板；4-转基因玉米Bt176基因组DNA模板；5-转基因玉米TC1507基因组DNA模板；6-转基因大豆GTS40-3-2基因组DNA模板；7-转基因棉花Mon1445基因组DNA模板；8-转基因棉花Mon15985基因组DNA模板；9-转基因棉花LLCotton25基因组DNA模板；10-转基因棉花Mon531基因组DNA模板；11-转基因油菜MS8基因组DNA模板；12-转基因油菜RF3基因组DNA模板；13-非转基因玉米郑单958基因组DNA模板；14-非转基因大豆1138-2基因组DNA模板；15-非转基因棉花中49基因组DNA模板；16-空白对照。

图4(a)为筛选基因Hpt特异性芯片杂交信号图；

图4(b)为非转基因植物及其产品的芯片杂交信号图(为图4(a)的对照)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1：

1、引物和探针设计

根据Hpt基因序列，利用Primer premier 5.0引物设计软件设计筛选基因Hpt特异性检测引物，并对引物进行筛选和优化。荧光标记引物在5’端用Cy3-Amidite进行荧光标记。引物由上海博亚生物公司合成，引物稀释成10μmol/L备用。

利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件根据Hpt的序列设计40mer Oligo备选探针，设计一般原则为：(1)具有较相近的TM值，上下波动范围为5℃；(2)GC含量为45％～55％之间，否则将增加非特异性杂交背景；(3)重复的单一碱基连续不超过4个；(4)探针分子最稳定二级结构配对碱基长度不大于4bp。探针在5’端以氨基己烷修饰，氨基和探针序列之间以间隔臂poly(dT15)相连，使最终探针长度为55bp。所有探针在上海博亚生物公司合成。

2、芯片制备

将筛选基因Hpt的特异性探针溶解在芯片点样液中，稀释成25μmol/L，取20μL转移到384孔板，用博奥生物芯片有限公司晶SmartArrayerTM-16芯片点样仪点样。先预点40点后再点至醛基化玻片上，点间距为350μm，点样后的芯片进行处理备用。每种样品点样重复5次，并同时点有核酸固定的阳性对照(HEX)，杂交阳性对照(PC)，阳性质控探针(18SrRNA)，阴性质控探针(SHDC-人类表达特异蛋白基因)，空白对照(点样液)，探针对照。以保证信号的重复性及稳定性。图2为本实施例所制备芯片阵列示意图，除包括筛选基因Hpt的特异性探针外，还包括GA21、Bt176、Bt11、Mon810、及TC1507的特异性探针对照。

3、应用方法

1)利用本发明中所设计的特异性引物序列进行转基因植物及其产品筛选基因Hpt特异性定性PCR检测方法：

所设计的引物序列如下：

Hpt-F：5’TGACGGCAATTTCGATGATG 3’

Hpt-R：5’TCTGCGGGCGATTTGTGTAC 3’。

用博日Biospin植物基因组DNA提取试剂盒，分别取转基因玉米Bt11、Bt176和TC1507等转基因玉米；转基因大豆GTS40-3-2、转基因棉花Mon1445，Mon15985，LLcotton25，Mon531；转基因油菜MS8，RF3；非转基因玉米郑单958、非转基因大豆1138-2、非转基因棉花中49的基因组DNA为模板，应用引物进行PCR扩增。在20μL反应体系中以100ng不同来源的基因组DNA为模板，其他各组分终浓度为：PCR Buffer 2×(含有1U Taq DNA聚合酶，10mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，250μM dNTPs)，引物各为0.5μM。反应条件为，95℃5min预变性，95℃30秒，58℃30秒，72C 30秒，循环35次，72C保温2分钟。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。

2)利用本发明中所设计的特异性探针序列进行转基因植物及其产品筛选基因Hpt特异性基因芯片检测方法：

所述的筛选基因Hpt探针序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-ATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGC

所述的探针对照转基因玉米Bt176转化体特异性探针序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-

TGCCCGTCACCGAGATCTGATGTTCTCTCCTCCATTGATG。

所述的探针对照转基因玉米Bt11转化体特异性探针的序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-

TGTATCCGCTCATGGAGGGATTCTTGGATTTTTGGTGGAG。

所述的探针对照的转基因玉米TC1507转化体特异性探针的序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-

GCGGAACACAAGAACGAAAGCACCTTTTCATTCTTTCATA。

所述的探针对照转基因玉米Mon810转化体特异性探针的序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-ACCTGAACGAGGACTTTCGGTAGCCTTCTTTCATTTCCGA。

所述的探针对照转基因玉米GA2l转化体特异性探针的序列为：

NH₂-(CH₂)₆-O-Poly(dT)15-ATACTAACTCATATCTCTTTCTCAACAGCAGGTGGGTCCG。

在30μL二重荧光PCR反应体系中以100ng待测植物的基因组DNA为模板，其他各组分终浓度为：PCR Buffer 2×(含有1U Taq DNA聚合酶，10mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，250μM dNTPs)，0.4μM上下游玉米引物，0.04μM的18S rRNA的上下游引物。反应条件为，95℃5min预变性，95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，循环35次，72℃保温5分钟。取7μL PCR产物与8μL杂交液(3×SSC，0.2％SDS，25％甲酰胺，5×Denhart’s，33nmol/L PC杂交阳性对照样品)混匀后，于PCR仪中95℃热变性10min，冰浴骤冷后加样于芯片上的点样区，盖玻片封片。42℃水浴杂交2h。杂交后，芯片分别在42℃的洗液I(2×SSC，0.1×SDS)和洗液II(0.2×SSC)中各清洗4min，500r/min离心甩干，用晶LuxScanTM 10K激光共聚焦扫描仪进行扫描(波长532nm)。PMT为850v，Power为90v，产生分析精度为10μm的16位TIFF图像。用LuxScan3.0软件进行数据采集和图像分析。所有的反应都重复3次。以非转基因玉米的基因组DNA作为对照。

3、实验结果

1)利用本发明中所设计的特异性引物序列进行转基因植物及其产品筛选基因Hpt特异性定性PCR检测方法：

利用所设计的引物以提取的基因组为模板进行PCR扩增，结果如图3所示。由图可见，只有阳性对照和含有筛选基因Hpt的转基因水稻科丰6号基因组成功扩增出特异性100bpPCR产物，而其他转基因和非转基因样品做模板时都没有扩增产物可观察到。因此，该引物具有良好的特异性，适合用于转化体特异性的检测。

2)利用本发明中所设计的特异性探针序列进行筛选基因Hpt特异性基因芯片检测方法：

针对外源基因与玉米基因组连接区域设计相应的探针，利用二重荧光PCR产物与芯片杂交，经反复对杂交温度、杂交时间等条件的优化，验证是否产生预期的有效信号。并且无其他探针产生非特异性信号来说明探针的特异性。结果如图4(a)、(b)所示。探针特异性检验结果表明，针对转化体特异性基因所设计的探针符合预期设计的目的，核酸固定的阳性对照(HEX)，杂交阳性对照(PC)，阳性质控探针(18S rRNA)和筛选基因Hpt特异性相应探针点样位置均有阳性信号，而阴性质控探针(SHDC-人类表达特异蛋白基因)，空白对照(点样液)及其他转基因玉米探针对照均无阳性信号出现，说明所设计的探针具有很好的特异性，所建立的芯片检测平台是可靠的。

以上结果可以看出，本发明为转基因植物及其产品筛选基因Hpt特异性基因芯片检测分析提供了基于简单、可靠的测定方法，可以用于转基因植物及其产品筛选基因Hpt的检测。本发明为转基因标识提供了一种有用的参考，为转基因产品的控制提供了必要的手段。

序列表

<110>山东省农业科学院植物保护研究所

 

<120>检测含有筛选基因Hpt的转基因植物及产品的基因芯片及其应用

 

<160>3

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>筛选基因Hpt探针

<222>(1)..(40)

 

<400>1

atttcgatga tgcagcttgg  gcgcagggtc gatgcgacgc

40

 

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>阳性质控探针序列

<222>(1)..(40)

 

<400>2

atggtggtga cgggtgacgg agaattaggg ttcgattccg

40

 

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>阴性质控探针序列

<222>(1)..(40)

 

<400>3

attgccagaa gacatcctta cttttatgcc ccggaactcc

40