玫瑰孢链霉菌高效生产达托霉素的分批式补料发酵方法

摘要

本发明涉及玫瑰孢链霉菌高效生产达托霉素的分批式补料发酵方法。在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces reseosporus斜面孢子用无菌水制成孢子悬液；然后用0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，28℃～32℃，180～220rpm摇床中培养48小时；然后以1％的接种量，加到装有发酵培养基的自动7.5LDE发酵罐中；添加0.5～30毫克每升的辅因子亚铁血红素或甲酰四氢叶酸或吡哆醛磷酸VB6的一种或其组合；在28℃～32℃，通气量控制0.8～1.2v/v/m，pH6.5～7.5发酵90～144小时。利用本发明的方法来调节生物酶活，使通向达托霉素合成的胞内代谢流增大，从而提高达托霉素产量，本法操作简单，成本低廉，本发明的发酵培养玫瑰孢链霉菌，达托霉素的发酵单位可比对照提高0.24～4.6倍。

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉玫瑰孢链霉菌高效生产达托霉素的分批式补料发酵方法。

背景技术

“玫瑰孢链霉菌”(拉丁名称为：“Streptomyces roseosporus”)是一种链霉菌属的放线菌，其生长指数增长后期到稳定期合成的达托霉素(英文名“daptomycin”)为N-癸酰-L-色氨酰-L-天冬酰胺酰-L-天冬氨酰-L-苏氨酰甘氨酰-L-鸟氨酰-L-D-天冬氨酰-D-丙氨酰-L-天冬氨酰甘氨酰-D-丝氨酰-threo-3-甲基-L-谷氨酰-3-丙氨酸ε1-内酯，是由一个十碳烷侧链与一个环状β氨基酸肽链N-末端的色氨酸连接而成，是一种大环内酯类新型抗生素。

达托霉素是一种钙离子依赖型的抗生素，在钙离子存在的条件下，达托霉素将以非共价键的形式结合到细胞膜蛋白上，细胞膜上的达托霉素结合蛋白(DBPs)为其作用靶位，达托霉素可扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的磷壁(酸)脂质(LTA)的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的。也有报道是其与细胞膜的结合，导致膜电位的降低，从而破坏胞内RNA和DNA的合成，最终抑制细菌生长。达托霉素由于独特的结构特征和作用机理，对于耐药菌，如耐万古霉素的肠球菌(VRE)，耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)，糖肽类敏感的金葡菌(GISA)，凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS)和耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)的感染具显著的治疗效果。是继万古霉素之后一种新型的抗生素，在治疗皮肤感染和心膜炎方面有着显著的疗效。2003年和2006年达托霉素(Daptomycin，LY146032)先后被美国FDA和了欧洲药品评价署(EMEA)的认证和批准上市。尽管国内已经有生产达托霉素的菌种，以初步实现中试生产，但是没有经过发酵优化，达托霉素的产量低，生产成本很高，因此优化达托霉素发酵工艺，进一步提高达托霉素的产量，具有重要意义。

分批式补料发酵，可在发酵中后期为菌体生长提供碳源和代谢产物前提，解除菌体生长中后期的碳源氮源耗尽而产生的菌体死亡和自溶，提高菌体活性，延长菌体的稳定生长期。在发酵中后期添加目的代谢物前提，解除前提供应瓶颈，有利于其高效合成。分段控制发酵条件，严格控制菌体的生长期和次级代谢产物和合成，使发酵有利于次级代谢产物合成而不是生长是发酵工艺优化的主要方法之一。

发明内容

本发明的目的是提出玫瑰孢链霉菌高效生产达托霉素的分批式补料发酵工艺

依此法可以有效的提高达托霉素的产量。

本发明的一种玫瑰孢链霉菌高效生产达托霉素的分批式补料发酵工艺方法，包括以下过程：

(1)在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces reseosporus斜面孢子用无菌水制成孢子悬液(10⁸个孢子/ml)；然后取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，28℃～32℃，180～220rpm摇床中培养48小时，作为发酵种子液；

(2)然后以1％～4％的接种量，接种到7.5L装有4L发酵培养基的自动发酵罐中；

从0到30h，控制pH6.5，溶氧45％，有利于菌体的快速生长；

从30h到144h，控制pH7.0，溶氧30％使菌体生长快速进入稳定期，有利于达托霉素的合成；

在30h以0.10mL/h的速度开始流加1∶1的癸酸和油酸甲酯溶液，为达托霉素合成提供癸酸前体，同时油酸甲酯起到消泡剂的作用；

在96h开始补加甘油，流速为0.25mL/L·h，以甘油作为菌体后期的主要碳源，使菌体的稳定期延长，从而延长达托霉素合成时间，提高达托霉素的合成效率。

本发明的种子液体培养基组成及质量含量为：糊精1g，葡萄糖0.5g，蛋白胨0.5g，酵母浸粉0.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.05g，MgSO₄·7H₂O 0.05，CaCO₃ 0.02g，溶解到1L蒸馏水中，初始pH7.0。

本发明的发酵培养基组成及质量含量为：葡萄糖1.0g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生饼粉0.6g/L，L-天冬素0.12g/L，K₂SO₄ 0.6g/L，初始pH7.0。

本发明的优点在于：本发明的方法在成本不变的情况下，可使达托霉素的产量提高4倍以上，且发酵过程易于控制，因此具有极好的产业应用推广价值。

附图说明

图1：实施例1产量曲线图；

图2：实施例2产量曲线图；

图3：实施例3产量曲线图；

图4：实施例4产量曲线图.

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces reseosporus斜面孢子用无菌水制成孢子悬液。然后取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30℃，180～220rpm摇床中培养48小时。然后以1％的接种量，接种到7.5L自动发酵罐中。其中发酵培养基组分(葡萄糖1.0g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生饼粉0.6g/L，L-天冬素0.12g/L，K₂SO₄ 0.6g/L，初始pH7.0。)然后，30℃，通气量控制0.8v/v/m，发酵144小时。通过HPLC监测发酵液中的达托霉素浓度。达托霉素发酵单位为41±0.6mg/L提高到了；如图1所示。

实施例2

在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces reseosporus斜面孢子用无菌水制成孢子悬液。然后取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30℃，180～220rpm摇床中培养48小时。然后以4％的接种量，接种到7.5L自动发酵罐中。其中发酵培养基组分(葡萄糖1.0g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生饼粉0.6g/L，L-天冬素0.12g/L，K₂SO₄ 0.6g/L，初始pH7.0。)然后，32℃，在0～30h，控制pH6.5，溶氧45％；30h～144h，控制pH7.0，通气量控制0.8v/v/m，发酵144小时。通过HPLC监测发酵液中的达托霉素浓度。达托霉素发酵单位为85±0.8mg/L比提高到了实施例1产量提高2倍.如图2所示。

实施例3

在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces reseosporus斜面孢子用无菌水制成孢子悬液。然后取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30℃，180～220rpm摇床中培养48小时。然后以3％的接种量，接种到7.5L自动发酵罐中。其中发酵培养基组分(葡萄糖1.0g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生饼粉0.6g/L，L-天冬素0.12g/L，K₂SO₄ 0.6g/L，初始pH7.0。)然后，28℃，在0～30h，控制pH6.5，溶氧45％，；30h～144h，控制pH7.0，通气量控制0.8v/v/m，30h时以0.10mL/h的速度开始流加1∶1的癸酸和油酸甲酯溶液发酵144小时。通过HPLC监测发酵液中的达托霉素浓度。达托霉素发酵单位为110±0.8mg/L比提高到了实施例1产量提高2.68倍.如图3所示。

实施例4

在室温下取玫瑰孢链霉菌Streptomyces reseosporus斜面孢子用无菌水制成孢子悬液。然后取0.5毫升孢子悬液接种到装有30毫升种子培养基的250毫升的摇瓶中，30℃，180～220rpm摇床中培养48小时。然后以4％的接种量，接种到7.5L自动发酵罐中。其中发酵培养基组分(葡萄糖1.0g/L，糊精3g/L，干酪素1.0g/L，花生饼粉0.6g/L，L-天冬素0.12g/L，K₂SO₄ 0.6g/L，初始pH7.0。)然后，30℃，在0～30h，控制pH6.5，溶氧45％，；30h～144h，控制pH7.0，通气量控制0.8v/v/m，30h时以0.10mL/h的速度开始流加1∶1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在96h开始补加甘油，流速为0.25mL/L·h，发酵144小时。通过HPLC监测发酵液中的达托霉素浓度。达托霉素发酵单位为185±0.8mg/L比提高到了实施例1产量提高4.5倍.如图4所示。

本发明并不局限于实例中所描述的技术，它的描述是说明性的，并非限制性的，本发明的权限由权利要求所限定，基于本技术领域人员依据本发明所能够变化、重组等方法得到的与本发明相关的技术，都在本发明的保护范围内。