用于从预处理过的木质纤维素原料产生醇和葡萄糖的基于纤维素酶的方法

摘要

本发明提供一种从预处理过的木质纤维素原料产生葡萄糖和乙醇的方法。所述方法包括利用纤维素酶酶促水解所述预处理过的木质纤维素原料以产生包含葡萄糖和未水解纤维素的水解物浆，以及在发酵反应中使所述水解物浆发酵以产生包含醇的发酵液。获得包含未水解纤维素的工艺流，随后对未水解纤维素进行变性步骤，优选包括使所述未水解纤维素暴露于升高的温度，由此产生包含未水解纤维素的热处理过的流。随后利用纤维素酶进一步水解所述包含未水解纤维素的热处理过的流，以将所述纤维素水解成葡萄糖。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于从木质纤维素原料产生可发酵糖的改进方法。更具体而言，本发明涉及从木质纤维素原料产生葡萄糖并随后将其转化成发酵产物。

背景技术

目前，燃料乙醇是从诸如玉米淀粉、甘蔗和甜菜的原料产生的。然而，近年来，从含有木质纤维素的原料例如农业废弃物和林业废弃物产生乙醇已经受到广泛关注。使用这些原料的一个优点是它们可广泛获得，并且可以以低成本获得。此外，木质纤维素原料通常被燃烧或填埋，因此，使用这些原料来产生乙醇提供了一种有吸引力的对其进行处置的替代方案。这些原料的另一优点是所述转化过程的副产物(称为木质素)可用作燃料来代替化石燃料为该工艺供能。一些研究已经得出结论，当考虑整个产生和消耗循环时，使用从纤维素产生的乙醇产生接近零的温室气体。

将木质纤维素原料转化成乙醇或其他发酵产物的第一化学处理步骤包括分解纤维材料以从原料释放糖单体如葡萄糖，用于在随后的发酵步骤中转化成乙醇。这两个主要步骤是酸或碱水解和酶促水解，所述酸或碱水解包括利用一步化学处理水解原料，所述酶促水解包括酸或碱预处理及随后利用纤维素酶水解。

在酸或碱水解过程中，使原材料与强酸或强碱在足以将纤维素水解成葡萄糖以及将半纤维素水解成木糖和阿拉伯糖的条件下接触。然后，利用酵母将葡萄糖发酵成乙醇，回收乙醇并通过蒸馏纯化。虽然该过程产生乙醇，但是由于酸或碱水解的非选择性，所以产率低。

在酶促水解过程中，首先使木质纤维素原料在比酸或碱水解过程温和的条件下进行预处理。预处理的目的是增加纤维素的表面积并将纤维原料转化成泥状质地，并将纤维素有限地转化成葡萄糖。然后，在使用纤维素酶的后续步骤中将纤维素水解成葡萄糖。在添加酶之前，将预处理过的原料的pH值调节至适于进行酶促水解反应的值。用于纤维素酶的最佳pH值范围通常为4至6，但是如果使用嗜碱性纤维素酶，则pH值可更高。

纤维素酶是通称，表示多种酶的混合物，包括催化纤维素(β-1，4-D-葡聚糖连接)水解的外切纤维二糖水解酶(CBH)和内切葡聚糖酶(EG)。CBH酶、CBHI和CBHII作用于纤维素微纤维中的葡萄糖聚合物的末端，释放出纤维二糖，而EG酶作用于纤维素的随机位置上。所述纤维素酶共同将纤维素水解成纤维二糖，其随后通过酶β-葡糖苷酶水解成葡萄糖。纤维素酶利用其纤维素结合域结合至底物上来水解纤维素，而β-葡糖苷酶通常没有这种结合域，因此保留在溶液中。

还已知的是在淀粉转化过程中使用纤维素酶来提高从原材料产生淀粉的产率。然而，从玉米或其他包含高淀粉水平的原料产生葡萄糖的处理步骤与用于从木质纤维素原料产生葡萄糖的处理步骤不同。在淀粉转化过程中，首先必需将淀粉从原材料中分离出来。这是通过如下步骤进行的：通过轻度加热和添加二氧化硫或亚硫酸来浸渍玉米，然后使浸渍过的原料经历多个研磨步骤，以及分离淀粉、蛋白质和其他成分。可以向浸渍液或随后的研磨步骤中添加纤维素酶以通过水解谷物纤维来提高淀粉产率。(例如，参见Silver的美国专利No.5,066,218和4,795,101)。相比之下，在木质纤维素转化过程中，使用纤维素酶来从原料的纤维素成分中产生葡萄糖以用于随后发酵成乙醇。

降低纤维素酶将木质纤维素原料水解成可发酵糖的效率的一个因素是酶被葡萄糖抑制。已经提出了在水解期间通过降低溶液中葡萄糖的浓度来降低这种抑制的方法。一种这样的方法被称为“同步糖化发酵”(SSF)，其包括在反应容器中进行酶促水解并同时将葡萄糖经酵母发酵成乙醇。通过同时进行两个反应，酵母通过将葡萄糖发酵成乙醇而消耗葡萄糖，由此降低其在反应器中的浓度，并进而降低其抑制效应。然而，SSF通常在35-38℃的温度下进行，该温度低于纤维素酶的最适温度50℃而高于酵母的最适温度28℃。这种非理想的温度范围导致纤维素酶和酵母表现出达不到标准的性能。结果，水解需要非常长的反应时间和非常大的反应容器，而两者均是成本高昂的。

已经提出的增加原料水解产生可发酵糖的效率的另一途径是使工艺下游阶段残余的未转化底物在上游或下游的水解反应中进行进一步的水解。这些工艺已经被提出，目的是提高从原材料获得的可发酵糖的产率，由此增加回收的乙醇。

这些工艺在美国专利No.2,529,131(Boinot等人)和美国专利No.4,578,353和4,497,896(Assarsson等人)中公开。具体而言，这些工艺包括对包含淀粉的原料进行酸水解以产生糖，然后通过发酵获得乙醇，以及蒸馏乙醇。使蒸馏之后残流进一步水解，其将剩余的不可发酵产物转化成可发酵的糖。美国专利No.2,529,131公开了在第二水解中将蒸馏后剩余的不可发酵材料(称为“酒糟”)进一步水解，而美国专利申请No.4,578,353和4,497,896则将从蒸馏后剩余的“釜馏物”流获得的流作为原料再循环到连续水解器中。然而，上述方法中的每种方法均使用酸水解来产生葡萄糖。虽然通常采用酸水解来水解淀粉，但是它不是适于从木质纤维素原料产生葡萄糖的方法，其原因是所获得的糖的产率低。

美国专利No.4,447,535(Zucker等人)公开了一种用于回收从淀粉或含有淀粉的原材料中产生醇过程中的浓缩釜馏物的工艺。根据该工艺，将淀粉或含有淀粉的原材料以适当粉碎的形式与流一起引至均化器中。凝胶化之后，使淀粉酶促液化、稀释、酶促糖化并随后发酵。随后蒸馏产物以产生醇和釜馏物，然后从釜馏物分离粗材料。之后是通过将釜馏物与加入至所述工艺中的原材料混合来使釜馏物再循环。然而，不能使用Zucker等人的工艺来从木质纤维素材料产生可发酵糖，其原因是该工艺步骤涉及水解原材料中存在的淀粉，而不是纤维素成分。

此外，使用淀粉产生乙醇的方法具有如下局限性：适合用于产生淀粉的大多数农田已经用作人和动物的食物来源。淀粉转化工艺的另一缺点是在转化工艺中和在含淀粉的谷物耕作所需肥料的生产中使用化石燃料。因此，这些工艺对减少温室气体仅具有有限的作用。

加拿大专利No.1,333,367(Gutschireiter)公开了一种从含有糖的原材料中产生乙醇的方法，该方法包括首先在加热的情况下用水溶液萃取原材料以除去可溶的糖，然后使萃取物发酵以产生乙醇。在蒸馏步骤之后，将剩余的富含水釜馏物流逆流再循环到萃取步骤中。然而，该公开内容涉及从甘蔗产生乙醇，而甘蔗不是木质纤维素材料。与含有淀粉的原材料类似，甘蔗用于人消费，因此不是优选的乙醇产生原料。此外，这些工艺可能也需要使用化石燃料来为转化过程提供能量。

美国专利No.4,421,856(Muller等人)公开了一种产生乙醇的方法：利用酸水解来水解选自淀粉或纤维素的碳水化合物聚合物的含水浆，然后进行发酵和蒸馏。将得自蒸馏的釜馏物流用作进料至初始水解的所添加水溶性碳水化合物的来源。然而，该方法采用酸水解，如前所述，酸水解不是将木质纤维素水解成葡萄糖的合适方法。

还已知的是使来自纤维素原料向乙醇转化的工艺流再循环回上游水解反应中。这些工艺由美国专利No.5,221,357(Brink)、美国专利No.5,554,520和5,487,989(Fowler等)、美国专利No.4,952,504(Pavilon)、Stenberg(PhD论文，Department of Chemical Engineering1，Lund University，瑞典)和Alkasrawi等(Appl.Biochem.and Biotech.，2002，98-100：849-861)公开。

美国专利5,221,357(如前所述)公开了一种两阶段酸水解木质纤维素材料的方法。使得自第二阶段水解的水解物进行固-液分离，其中将液体部分再循环到第一阶段水解。将分离的固体送至湿氧化过程中，其中通过放热氧化反应产生的流可以用作所述工艺的热源。该工艺的缺点是，被送至湿氧化过程的固体含有未水解的纤维素。因此，该工艺不能充分利用原材料中存在的可水解底物。

美国专利No.5,554,520和5,487,989(如前所述)公开了一种用于将生物质转化成乙醇的工艺，其包括在酶促水解反应器中将预处理过的生物质分解成更简单的寡聚糖和/或单糖与多糖，然后进行发酵和蒸馏以获得乙醇。从酶促水解反应器中吸出固体和液体的混合物，并送入固/液分离器中。固体被送回酶反应器中，而流出物被送去发酵。

美国专利4,952,504(如前所述)公开的工艺包括通过燃料加热的加热器来水解柑桔皮。水解依靠生物质自身中存在的有机酸进行以水解原料的半纤维素和纤维素成分。还公开了一种利用系统中由发酵反应过程中释放的二氧化碳产生的碳源来水解木料或其他生物质的方法。水解后，发酵糖以产生乙醇。然后蒸馏含有乙醇的发酵液，并且将釜馏物的一部分再循环至原材料中。然而，该工艺依赖于酸和加热来水解生物质的纤维素和半纤维素成分，其也存在前述局限性。

Stenberg(如前所述)公开了如下的工艺流再循环：预处理软木材(softwood)以产生乙醇，进行纤维素酶水解和发酵，然后蒸馏以回收乙醇。这些研究的目的是减少工艺中需要的新鲜水量。然而，在Stenberg中公开的工艺中，在工艺流再循环之前均采用过滤步骤以分离固体。这些过滤步骤将不仅除去木质素，而且还除去未水解纤维素，由此导致可发酵糖从工艺中损失。

在同一小组(Alkasrawi等人，如前所述)的一项最新相关研究中，研究了Stenberg所述的再循环经过滤的含水工艺流对乙醇产生的影响。进行这些研究是为了研究再循环流中存在的抑制剂对乙醇产率的影响。结果发现，再循环程度较高时，发酵明显受到抑制，导致乙醇产率降低，而水解似乎未受影响。

涉及将蒸馏后剩余的流再循环回到发酵反应器中的工艺也是已知的。美国专利4,460,687公开了一种用于产生乙醇的工艺，其包括将釜馏物再循环回到发酵器中。通过该釜馏物再循环，可以将发酵器中的乙醇浓度保持在低于乙醇抑制限度的期望低值。类似地，美国公开No.2005/0019932(Dale等人)公开了一种用于从糖浆或玉米糖浆产生乙醇的工艺，其中将釜馏物再循环回到发酵器中。在Dale等人的工艺中，采用再循环步骤来减少送至废弃物处理的釜馏物的量。然而，这些工艺中没有一种涉及提高将原材料酶促转化成可发酵糖的效率。

酶促水解木质纤维素原料的另一显著问题是需要大量的纤维素酶。这是工艺的主要缺点，其原因是纤维素酶占水解成本的50％以上。虽然可以通过增加水解时间(90-200小时)来减少酶用量，但是这需要非常大的反应器，其再次增加了总成本。通过增加酶促水解效率，可以减少酶用量。

在该相关文献中，已经提出回收纤维素酶并在进一步的水解反应中重新使用它们。重新使用酶的已知方法依赖于将酶结合到未转化的纤维素或添加新的纤维素。然后将含有结合酶的纤维素送回水解反应器中。该工艺由美国专利4,321,328(Hoge)公开。根据该工艺，对纤维素材料进行机械脱纤维，然后糖化以形成可发酵糖，随后发酵以产生含有乙醇的啤酒。然后将含有乙醇的啤酒与结合至啤酒中未反应纤维素材料的酶一起再循环至水解反应。

Knutsen和Davis(Appl.Biochem.Biotech.，2002，98-100：1161-1172)公开了一种用于在水解木质纤维素生物质期间回收纤维素酶的倾斜沉降和超滤联合工艺。该工艺首先包括利用纤维素酶水解木质纤维素颗粒，然后将所得混合物进料至倾斜的沉降器中。大的木质纤维素颗粒，包括与颗粒结合的酶，保留在倾斜的沉降器中并且随沉降器底流被送回到反应器中。然后将溢流进料至错流超滤单元中以回收未结合的纤维素酶，其随后被添加回到水解反应器中。

同样，Mores等人(Appl.Biochem.Biotech.，2001，91-93：297-309)公开了一种与Knutsen和Davis(如前所述)所描述的类似的倾斜沉降和超滤联合工艺，但是Mores等人的工艺包括额外的澄清步骤，其包括在超滤之前使沉降器的溢流进行微滤以减少超滤膜的污染。然而，Knutsen和Davis以及Mores等人(如前所述)的工艺的缺点在于，在商业级水解反应器中引入沉降器会明显增加成本和复杂性。

Ramos等人(Enzyme Microb.Technol.，1993，15：19-25)公开了一种工艺，其中利用纤维素酶水解蒸汽爆破的桉树碎片以除去可溶糖并使酶再循环。该工艺包括在选定的培育时刻终止反应、将未水解的含酶残渣收集在烧结的玻璃纤维上和用水解缓冲液洗涤含酶残渣以除去可溶糖。然后将洗涤后的残渣重新悬浮在含有新鲜的β-葡糖苷酶的新鲜水解缓冲液中并水解。类似的工艺由Lee等人公开(Biotech.Bioeng.，1994，45：328-336)。

美国专利No.4,316,956(Lützen)公开了从淀粉产生乙醇的方法：向与酵母并流流向反应器的淀粉颗粒添加葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，然后通过蒸汽蒸馏所得发酵液以回收乙醇。该方法包括将含有α-淀粉酶和少部分葡糖淀粉酶的釜馏物的一部分再循环回到发酵器中。然而，将蒸馏釜底部中存在的淀粉酶再循环回去进行发酵需要它们热稳定以耐受蒸汽蒸馏的高温，或者需要小心避免使发酵液进行使酶失活的温度。

美国专利No.4,220,721(Emert等人)公开了一种同步糖化发酵(SSF)的工艺，其中使EG和CBH纤维素酶成分再循环。该工艺包括从SSF反应混合物中分离出液体部分，然后使液体部分和酶与含有纤维素的固体接触以将酶吸附于其上。然后分离包含所吸附酶的固体部分并用作进一步SSF反应的进料的一部分。然而，该工艺的缺点是它需要添加新鲜的纤维素底物来结合酶，这增加了工艺的成本和复杂性。

因此，目前在本领域中，在运行有效的水解木质纤维素原料来产生高产率可发酵糖的工艺方面存在诸多困难。涉及进一步水解未转化底物或再循环酶的已知方法存在上述局限性。仍需要开发有效的工艺以将纤维素转化成发酵产物如乙醇。

发明内容

本发明涉及一种用于从木质纤维素原料产生可发酵糖的改进方法。更具体而言，本发明涉及从木质纤维素原料产生葡萄糖和随后将其转化成发酵产物。

本发明通过考虑在将木质纤维素原料转化成醇例如乙醇期间实施的步骤中遇到的难题而克服了现有技术的一些缺点。在本发明中，发明人已提供了增加从木质纤维素原料获得的可发酵糖的量的方法。有利的是，通过增加来自木质纤维素原料的可发酵糖的产率，可以显著提高该工艺所产生的醇或其他发酵产物的量。

具体而言，本发明基于如下出乎意料的发现：如果未水解纤维素之前暴露于酶变性步骤，所述酶变性步骤包括将未水解纤维素暴露于pH值变化、蛋白酶处理、添加氧化化学物质或使酶失活的其他化学物质，则在预处理过的原料经纤维素酶水解之后剩余的未水解纤维素尤其易于通过纤维素酶进行进一步水解。不希望受理论限制，认为所观察到的纤维素酶水解增强可能是由于结合的酶变性引起的，由此使纤维素的表面再生。这进而增加纤维素酶进一步水解可到达的底物表面上的位点。

因此，根据本发明的一个宽泛的方面，使工艺流进行下述处理步骤，所述工艺流包含未水解的纤维素，所述未水解的纤维素得自之前的木质纤维素原料预处理和纤维素酶水解，所述处理步骤包括使所述工艺流中的未水解纤维素暴露于使结合的纤维素酶变性的条件以及利用纤维素酶经进一步水解将已暴露于该变性条件的未水解纤维素水解成葡萄糖。

包含未水解纤维素的工艺流可得自将木质纤维素原料加工成醇的各个阶段。根据本发明的一个方面，所述工艺流是发酵液，其得自如下过程：预处理木质纤维素原料，然后进行纤维素酶水解以产生葡萄糖并将葡萄糖发酵成醇。然后蒸馏以该方式获得的发酵液以获得浓缩的醇和静止釜底流，随后使静止釜底流进行进一步纤维素酶水解。由于蒸馏步骤的温度苛刻至足以使从酶促水解剩余的结合的纤维素酶变性，所以可以将静止釜底流中剩余的未水解纤维素有效地水解成葡萄糖。或者，可以使发酵液进行包括将热直接施加到所述流的热处理，然后进行利用纤维素酶经进一步水解步骤。

根据本发明的另一个实施方案，该工艺流是水解物浆，其包含得自木质纤维素原料的预处理和纤维素酶水解的葡萄糖。通过使该工艺流进行包括热处理的工艺步骤，使结合至未处理纤维素的纤维素酶变性。然后利用效率提高的纤维素酶对热处理过的水解物浆进一步水解。

所述进一步纤维素酶水解可包括使所述热处理过的流再循环至上游水解或在循环至添加有新鲜纤维素酶的下游水解。

一种从木质纤维素原料产生醇的方法(A)，所述方法包括以下步骤：(i)在破坏纤维结构并增加待水解木质纤维素原料的可接近性(accessibility)的条件下预处理所述原料以产生包含预处理过的木质纤维素原料的组合物；

(ii)利用纤维素酶酶促水解所述预处理过的木质纤维素原料以产生包含葡萄糖和未水解纤维素的水解物浆；

(iii)使所述水解物浆发酵以产生包含醇和未水解纤维素的发酵液；

(iv)通过蒸馏从所述发酵液中分离出所述醇以获得包含浓缩醇的流和包含未水解纤维素的静止釜底流，所述蒸馏导致所述未水解纤维素的热处理；和

(v)利用纤维素酶进一步水解所述静止釜底流的至少一部分以将所述静止釜底流中存在的所述未水解纤维素的至少一部分转化成葡萄糖。

本发明还提供一种用于从木质纤维素原料产生葡萄糖的方法(B)，其包括以下步骤：

(i)在破坏纤维结构并增加水解所述原料的可接近性的条件下预处理木质纤维素原料以产生预处理过的木质纤维素原料；

(ii)利用纤维素酶酶促水解所述预处理过的木质纤维素原料以产生包含葡萄糖和未水解纤维素的水解物浆并且使所述葡萄糖发酵以产生包含醇的发酵液；

(iii)获得包含所述未水解纤维素的工艺流；

(iv)使所述工艺流的至少一部分进行包括将所述未水解纤维素暴露于约70℃至约250℃的温度的处理步骤，由此产生包含热处理的未水解纤维素的流；和

(v)利用纤维素酶进一步水解所述热处理过的未水解纤维素以将所述未水解纤维素的至少一部分转化成葡萄糖。

从木质纤维素原料产生葡萄糖还可以包括方法(C)，其包括以下步骤：

(i)在破坏纤维结构并增加水解木质纤维素原料的可接近性的条件下预处理所述原料以产生预处理过的木质纤维素原料；

(ii)利用纤维素酶酶促水解所述预处理过的木质纤维素原料以产生包含葡萄糖和未水解纤维素的水解物浆并且使所述葡萄糖发酵以产生包含醇的发酵液；

(iii)获得包含所述未水解纤维素的工艺流；

(iv)使所述工艺流的至少一部分进行包括将所述未水解纤维素暴露于使结合至所述未水解纤维素的纤维素酶变性的变性步骤的处理步骤；和

(v)利用纤维素酶进一步水解包含进行所述变性步骤的所述未水解纤维素的工艺流，以将所述未水解纤维素的至少一部分转化成葡萄糖。

附图说明

在附图中：

图1、2、3和4是描述木质纤维原料的预处理和随后从工艺获得的包含未水解纤维素的各种流的纤维素水解、发酵、蒸馏和进一步水解的工艺流程图。在图1中，将蒸馏釜的底液流进料至纤维素水解的下游，在图2中，将蒸馏釜的底液流再循环至纤维素水解的上游，在图3中，将发酵液进料至纤维素水解的上游，在图4中，将得自纤维素水解的水解物浆再循环回到上游纤维素酶水解中。

图5和6是显示经预处理的麦秆浆在pH 5的含水浆中的纤维素转化分数的图。在利用纤维素酶进行第一次水解、用酵母将葡萄糖发酵成乙醇、在90℃下加热浆以模拟蒸馏和随后利用纤维素酶进行第二次水解的整个过程中测量纤维素转化。在图5中，在水解开始时添加3mg/g的纤维素酶，并且麦秆浆含2.53％的纤维素。在发酵开始时以1.5g/L的浓度添加酵母，并且在从添加纤维素酶起第72小时进行模拟蒸馏。在模拟蒸馏之后，以30mg/g的量添加新鲜的纤维素酶。在图6中，在水解开始时添加30mg/g的纤维素酶，并且麦秆浆含6.01％的纤维素。在第24小时以1.5g/L的浓度添加酵母，并且在第48小时进行模拟蒸馏。在模拟蒸馏之后，添加30mg/g的新鲜酶。

图7是显示在没有模拟蒸馏的情况下经预处理麦秆的浆料在pH值5的含水浆料中的纤维素转化分数的图。在利用纤维素酶进行第一次水解和随后利用纤维素酶进行第二次水解的整个过程中测量纤维素转化。在水解开始时添加30mg/g的纤维素酶，并且麦秆浆料含2.5％的纤维素。在第24小时以30mg/g的量添加新鲜的纤维素酶。

具体实施方式

以下说明是仅以举例方式给出的实施方案但不限于实施本发明各个方面的必要特征的组合。

用于本发明方法的原料是木质纤维素材料。术语“木质纤维素原料”是指任意类型的植物生物质，例如但不限于非木质的植物生物质；种耕作物，例如但不限于草(例如但不限于C₄草，例如柳枝稷、互花米草(cordgrass)、黑麦草、芒草、草庐或其组合)；糖加工残渣，例如但不限于甘蔗渣、甜菜浆或其组合；农业废物，例如但不限于大豆秸秆、玉米秸秆、稻草、稻壳、大麦秸秆、玉米芯、小麦秸秆、油菜秸秆、燕麦秸秆、燕麦皮、玉米纤维或其组合；林业生物质，例如但不限于再循环的木浆纤维、锯屑、硬木如白杨木、软木材或其组合。此外，木质纤维素原料还可以包括纤维素废料或林业废料，例如但不限于新闻纸、硬纸板等。木质纤维素原料可以包含一种纤维，或者，作为替代方案，木质纤维素原料可包含源自不同木质纤维素原料纤维的混合物。此外，木质纤维素原料还可包含新鲜的木质纤维素原料、部分干燥的木质纤维素原料或完全干燥的木质纤维素原料。

木质纤维素原料包含大于约20％、更优选大于约30％、更优选大于约40％(w/w)的量的纤维素。例如，木质纤维素原料可包含约20％至约50％(w/w)的量或其间任意量的纤维素。木质纤维素原料还包含大于约10％、更通常大于约15％(w/w)的量的木质素。木质纤维素原料还可包含少量的蔗糖、果糖和淀粉。

优选的木质纤维素原料的实例包括(1)农业废物，例如玉米秸秆、小麦秸秆、大麦秸秆、油菜秸秆、燕麦秸秆、稻草和大豆秸秆；和(2)草，例如柳枝稷、芒草、互花米草和草庐。

本发明通常用已经被预处理的木质纤维素材料来实施。预处理方法的目的是传递足够的机械和化学联合作用以破坏纤维结构和增加原料表面积以使其可与纤维素酶接触。机械作用通常包括使用压力、研磨、碾磨、搅拌、切碎、压缩/膨胀，化学作用包括使用热(经常是蒸汽)、酸或碱或者溶剂。

预处理优选化学处理，其包括添加pH调节剂(alterant)，该pH调节剂改变原料的pH以破坏其纤维结构并增加其在随后的酶促水解中被水解的可接近性。

在本发明的一个实施方案中，所述pH调节剂是酸。使用酸的预处理使木质纤维素原料中存在的半纤维素或其一部分水解成单糖木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或其组合。优选地，进行酸处理，使得半纤维素几乎完全水解且少量的纤维素转化成葡萄糖。纤维素在使用纤维素酶的后续步骤中被水解成葡萄糖。通常，采用浓度为约0.02％(w/w)至约2％(w/w)或其间任意量(作为纯酸占干原料和水溶液总重的重量百分比测量的)的稀酸来进行预处理。优选地，在约0.8至约2.0的pH下，在约180℃至约250℃的峰值温度下实施酸预处理约6秒至约600秒的时间。应当理解的是，酸预处理可以以多于一个阶段来实施，但是优选以一个阶段来实施。

在本发明的一个实施方案中，在约180、190、200、210、220、230、240、250℃或其间任意值的峰值温度下进行酸预处理。在本发明的另一个实施方案中，预处理的持续时间为约6、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、450、500、550、600秒或其间的任意值。在又一个实施方案中，预处理期间原料的pH值为约0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0或其间的任意值。

一种实施原料的酸预处理的方法是利用美国专利No.4,461,648(Foody；其通过引用并入本文)中记载的工艺条件进行的蒸汽爆破。预处理可以是美国专利No.5,536,325(Brink；其通过引用并入本文)、共同未决的美国申请No.US 60/687,224(Foody和Tolan；其通过引用并入本文)和美国专利No.4,237,226(Grethlein；其通过引用并入本文)中公开的连续工艺。本领域中已知并且可以根据需要使用的其他技术包括但不限于美国专利No.4,556,430(Converse等；其通过引用并入本文)中公开的那些。

在本发明的另一个实施方案中，用于预处理木质纤维素原料的pH调节剂是碱。与酸预处理不同，用碱进行预处理不使原料的半纤维素成分水解，而是碱与半纤维素中存在的酸性基团反应以打开底物的表面。碱的添加还可以改变纤维素的晶体结构，使其更易于水解。可用于预处理的碱的实例包括氨、氢氧化铵、氢氧化钾和氢氧化钠。预处理优选不用不溶于水的碱(例如石灰和氢氧化镁)进行。

合适的碱预处理的一个实例是氨冷冻爆破、氨纤维爆破或氨纤维膨胀(“AFEX”工艺)。根据该工艺，在压力容器中使木质纤维素原料与氨或氢氧化铵接触足够的时间以使氨或氢氧化铵能够改变纤维素纤维的晶体结构。然后快速减压，其使氨闪蒸或沸腾并使纤维素纤维结构爆破。(例如参见美国专利No.5,171,592、5,037,663、4,600,590、6,106,888、4,356,196、5,939,544、6,176,176、5,037,663和5,171,592)。然后可以根据已知的工艺回收闪蒸的氨。另一种碱处理是利用低的氨浓度来进行(参见例如美国专利申请No.20070031918和美国专利申请No.2007/37259)。

在预处理之后，可以处理木质纤维素原料以获得包含预处理过的原料的固体流和包含可溶成分的含水流。这可以通过用含水溶液洗涤预处理过的原料来产生洗涤流和包含预处理过的原料的固体流来进行。这可以通过利用已知的方法例如离心、微滤、板框式过滤、错流过滤、压力过滤、真空过滤等使预处理过的原料进行固-液分离来实施。任选地，可将洗涤步骤引入到固-液分离中。当采用酸预处理时，水相包含通过水解半纤维素产生的糖以及在预处理期间添加的酸和在预处理期间释放的任何有机酸。随后可以对该流进行处理以除去矿物酸和有机酸，然后任选将其送回至包含预处理过的原料的固体流中。还可以使来自酸预处理过的原料的含水流进行发酵以使糖发酵。例如，可以将该流中存在的木糖发酵成乙醇、木糖醇、乳酸、丁醇或其混合物。

预处理过的木质纤维素原料通常在含水溶液如工艺水、新鲜水、蒸汽冷凝液或工艺再循环流中成浆。预处理过的木质纤维素原料在浆料中的浓度取决于颗粒尺寸、保水性、泵容量和原料的其他性质。典型地，浓度为约3％至30％(w/w)或约10％至约20％(w/w)的纤维固体(也称为悬浮或未溶解固体)或其间的任意量。含水浆优选具有使其能够被泵送的固体浓度。如本领域中公知的，悬浮或未溶解固体的浓度可以通过如下方法确定：利用玻璃微纤维滤纸过滤浆样品，用水洗涤滤饼，以及在105℃下过夜干燥滤饼。优选纤维固体包含至少约20％至约70％重量或其间任意量的纤维素。例如，纤维固体可包含约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70％或其间任意量的纤维素。

通常，将预处理过的原料的pH值调节至最适宜所用纤维素酶的值。通常，将预处理过的原料的pH值调节至约3.0至约7.0的范围或其间的任意pH值。例如，pH值在约4.0至约6.0的范围内，为约4.5至约5.5，或者为3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0或其间任意量的pH值。如果预处理过的原料是碱性的(即，如果进行碱预处理)，则可以使用硫酸来进行pH值调节。如果预处理过的原料是酸性的，则pH可以用选自氨、氢氧化铵、石灰、氢氧化钙、氢氧化钾、氢氧化镁和氢氧化钠的碱来调节。优选地，所述碱选自氨、氢氧化铵和氢氧化钠。

对预处理过的原料的温度进行调节以使其在纤维素酶活性的最适宜范围内。通常，约45℃至约55℃的温度或其间的任意温度，例如45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃或其间的任意值适合于大多数的纤维素酶。耐高温纤维素酶在55℃至70℃的温度下有效，因此约55℃至约70℃的温度可以用于在选定的温度下有效的相应纤维素酶。

在预处理之后，并且在调节含水浆的温度和pH值之前、期间或之后向预处理过的原料中添加纤维素酶和β-葡糖苷酶。优选地，在调节浆的温度和pH值之后向预处理过的木质纤维素原料中添加纤维素酶和β-葡糖苷酶。

术语“纤维素酶”是指水解纤维素的酶的混合物。该混合物可包括葡糖二糖水解酶(GBH)、纤维二糖水解酶(CBH)和内切葡聚糖酶(EG)。虽然GBH酶可以形成酶混合物的成分，但是其在纤维素酶水解中的使用没有CBH和EG酶常见。在一个非限定性实例中，所述混合物包含CBH和EG酶。GBH酶主要从纤维素聚合物链的末端将其水解以释放出葡萄糖，CBH酶主要从纤维素聚合物链的末端将其水解以释放出纤维二糖，而EG酶主要在链的中间水解纤维素聚合物。

本发明的方法可以利用任意类型的纤维素酶来实施，而不管其来源如何。可用于实施本发明的纤维素酶的实例包括得自曲霉菌属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)和木霉属(Trichoderma)的真菌以及得自杆状菌属(Bacillus)和喜热裂孢菌属(Thermobifida)的细菌。

合适的纤维素酶用量可以为约1.0至约40.0滤纸单位(FPU或IU)/克纤维素，或者其间的任意量。FPU是本领域技术人员熟悉的标准度量，并且根据Ghose(Pure and Appl.Chem.，L987，59：257-268；其通过引用并入本文)进行定义和测量。

将纤维二糖转化成葡萄糖是通过酶β-葡糖苷酶进行的。术语“β-葡糖苷酶”是指将葡萄糖二聚体、纤维二糖水解成葡萄糖的任何酶。β-葡糖苷酶的活性由酶学委员会按其活性定义为EC#3.2.1.21。β-葡糖苷酶可来自多种来源；然而，在所有的情况下，β-葡糖苷酶都可以将纤维二糖水解成葡萄糖。β-葡糖苷酶可以是家族1或家族3糖苷水解酶，但是其他家族成员也可以用于实施本发明。用于本发明的优选β-葡糖苷酶是来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的Bgl1蛋白质。本发明还包括可以将β-葡糖苷酶修饰为包含纤维素酶结合域，由此使该酶结合至纤维素上。

纤维素酶和β-葡糖苷酶可以在水溶液中或作为粉末或颗粒来处理。可以在将酶引入水解反应器中之前的任一时刻将酶添加到预处理过的原料中。或者，可以将酶直接添加到水解反应器中，但是为了最佳混合，优选在将酶引入水解反应器中之前添加酶。可以利用本领域技术人员熟知的混合设备将酶混合进预处理过的原料中。

在实践中，水解在包括一系列水解反应器的水解系统中实施。系统中水解反应器的数目取决于反应器的成本、含水浆的体积和其他因素。对于商业级乙醇工厂而言，水解反应器的典型数目可以为例如4至12个。为了保持期望的水解温度，可以用蒸汽、热水或其他热源给水解反应器通过夹套加热。优选地，纤维素酶水解是连续工艺，其中连续地进料预处理过的木质纤维素原料和抽出水解物浆。然而，应当理解的是，分批式工艺也包括在本发明的范围内。

水解系统的其他设计参数可以根据需要调节。例如，纤维素酶水解系统中水解反应器的体积可以为约100000L至约3000000L的范围或其间的任意体积，例如，为200000至750000L，或者其间的任意体积，但是可以优选小体积的反应器以降低成本。浆在水解系统中的总停留时间可以为约12小时至约200小时或者其间的任意值，例如25至100小时，或者12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、120、140、160、180、200小时，或者其间的任意值。水解反应器可以不混合，或者通常利用至多为0.8hp/1000加仑的最大输入功率进行轻微搅拌。

利用纤维素酶进行的酶促水解产生包含葡萄糖、未水解纤维素和木质素的水解物浆。水解物浆中可能存在的其他成分包括木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖，以及二氧化硅、不溶性盐和其他化合物。

水解物浆可以在70℃至200℃或其间任意值的温度，例如90至180℃或其间任意值，或70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200℃或其间任意温度下进行热处理以使结合的纤维素酶变性，然后利用纤维素酶进行进一步水解。所述进一步水解可以包括将热处理的水解物浆引至使用纤维素酶的上游或下游水解中。在本发明的一个实施方案中，水解物浆在进一步水解之前暴露于70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200℃或其间的任意温度。水解物浆在热处理中的停留时间可以为30秒至24小时或其间的任意时间，这取决于热处理的温度，当采用较低的温度时，通常需要较长的停留时间。在本发明的多个实施方案中，停留时间为约30秒、约1分、约10分、约20分、约30分、约1小时、约2小时、约3小时、约5小时、约8小时、约10小时、约15小时、约20小时或约24小时。热处理优选在约3至约9的pH值或其间任意的pH值下进行，例如，pH值可以为约3、约4、约5、约6、约7、约8或约9。

然后，通过微生物对水解物浆中存在的糖进行发酵以产生包含醇的发酵液。为了产生乙醇，通常利用酿酒酵母(Saccharomyces spp.yeast)进行发酵。优选地，通过野生型酿酒酵母将通常存在于水解物浆中的葡萄糖和其他己糖发酵成乙醇，但是也可以采用基因修饰的酵母。例如，可以利用重组酿酒酵母来进行发酵，其被加工以将己糖和戊糖发酵成乙醇。可将戊糖、木糖发酵成乙醇的重组酵母记载于美国专利No.5,789,210中，该专利的全部内容通过引用并入本文。此外，可以通过Boles等人(WO2006/096130)描述的酵母将戊糖、阿拉伯糖和木糖转化成乙醇。

包含在本发明范围内的其他发酵产物的实例包括山梨糖醇、丁醇、1，3-丙二醇和2，3-丁二醇。可以用于发酵的其他微生物包括野生型或重组的埃希氏菌(Escherichia)、发酵单胞菌(Zymomonas)、假丝酵母(Candida)、毕赤酵母(Pichia)、链霉菌(Streptomyces)、杆状菌、乳酸杆菌(Lactobacillus)和梭菌(Clostridium)。

优选地，发酵在发酵微生物的最适温度和pH值下或附近进行。利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)将葡萄糖发酵成乙醇的常用温度范围是约25℃至约35℃或其间的任意温度，但是如果酵母是天然或基因修饰对热稳定的，则温度可以更高。采用酿酒酵母的常用发酵pH值为约3至约6或其间的任意值。发酵微生物的用量将取决于其他因素，例如发酵微生物的活性、期望的发酵时间、反应器的体积和其他参数。应当理解的是，这些参数可以由本领域技术人员根据需要来调节以实现最适发酵条件。

水解物浆还可以补充有发酵微生物生长所需的其他营养物。例如，可以向水解物浆中添加酵母提取物、特定氨基酸、磷酸盐、氮源、盐、微量元素和维生素以支持微生物的生长。

发酵可以在搅拌或不搅拌的情况下以分批、连续或补料-分批的方式进行。优选地，用机械搅拌轻轻搅拌发酵反应器。可以利用一系列反应器如1至6个反应器进行典型的商业级发酵。发酵微生物可以再循环回到发酵器中，或者可以不再循环而被送去蒸馏。

应当理解的是，水解和发酵反应可以在同一反应器中同时进行，但是优选水解和发酵反应分开进行以实现各反应的最适温度条件。

然后，可以使包含醇的发酵液进行热处理以使结合的纤维素酶变性。热处理可以是为将醇与发酵液或“啤酒”分开而进行的蒸馏操作的一部分，如下文更详细描述的。或者，可以对发酵液直接加热来实施热处理。在后一情况下，使发酵液进行约70至约200℃或其间的任意温度，例如约90至约180℃或其间的任意温度，或者70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200℃或其间的任意温度。热处理的停留时间可以为约30秒至约24小时或其间的任意时间。在本发明的一个实施方案中，使发酵液暴露于约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190或约200℃的温度。在本发明的另一个实施方案中，停留时间为约30秒、约1分、约10分、约20分、约30分、约1小时、约2小时、约3小时、约5小时、约8小时、约10小时、约15小时、约20小时或约24小时。热处理优选在约3至约9的pH值或其间的任意pH值下进行，例如，pH值可以为约3、约4、约5、约6、约7、约8或约9。

可以利用常规方法通过蒸馏将醇从发酵液或“啤酒”中分离出来。如果分离条件非常苛刻而足以使本文所述的纤维素酶变性，则本文所用的术语“蒸馏”还包括汽提或真空提。

被送去蒸馏的发酵液或啤酒是含有固体(包括未转化的纤维素)和在发酵期间添加以支持微生物生长的任何成分的稀醇溶液。可能存在微生物，这取决于它们在发酵期间是否被再循环。优选对啤酒进行脱气以除去二氧化碳，然后泵送其穿过一个或更多个蒸馏柱以将醇与啤酒中的其他成分分开。蒸馏单元中的柱优选以连续模式运行，但是应当理解的是，本发明也包括分批式工艺。此外，所述柱可以在高于大气压、低于大气压或大气压下运行。用于蒸馏过程的热可以通过直接的蒸汽注入或通过热交换器间接地在一个或更多个点处添加。蒸馏装置可以包含一个或更多个分离啤酒柱和精馏柱。在该情况下，稀啤酒被送至啤酒柱并在其中被部分浓缩。就啤酒柱而言，蒸汽进入精馏柱以进行进一步纯化。或者，采用包括整体式富集或精馏段的蒸馏柱。余水可通过分子筛树脂、吸附或本领域技术人员熟悉的其他方法从蒸汽中除去。然后可以使蒸汽冷凝和变性。

蒸馏后剩余的且包含固体的含水流(在本文称为“蒸馏釜底液”)被从蒸馏单元的一个或更多个柱的底部抽出。该流含有未转化的纤维素。此外，该流可含有微生物、无机盐、未发酵的糖、有机盐和其他杂质。

蒸馏在苛刻至足以使结合的纤维素酶变性的条件下进行。蒸馏优选在如下条件下进行：约70℃至约200℃的温度，更优选约90℃至约180℃或其间的任意温度范围，例如在约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160和约170℃的温度或其间的任意温度，和约2.0磅/平方英寸至约215磅/平方英寸的压力或其间的任意压力范围，例如2、4、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200磅/平方英寸或其间的任意压力。含有未水解固体的液体流在蒸馏单元内的停留时间为约0.05至约12小时或其间的任意时间段。在蒸馏柱底部(包含纤维素的蒸馏釜底液从其取出)测量温度，并且在蒸馏柱的顶部测量压力。在一个实施方案中，蒸馏在约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约170、约180、约190或约200℃的温度下进行。在另一个实施方案中，蒸馏在约2.0、约5.0、约8.0、约10.0、约15.0、约20、约25、约50、约100、约125、约150、约175、约200或约215磅/平方英寸的压力下进行。在本发明的又一个实施方案中，包含未水解固体的液体流在蒸馏单元内的停留时间为约0.25、约0.30、约0.35、约0.40、约0.45、约0.50、约0.60、约0.70、约0.80、约0.90、约1.0、约1.25、约1.5、约1.75、约2.0、约2.5、约3.0、约4.0、约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0、约10.0、约11.0或约12.0小时。

随后将静止釜底流进料以进行进一步纤维素酶水解。这可以通过将其进料至利用添加新鲜纤维素酶的下游酶促水解中进行，或者作为替代方案，将所述流的至少一部分再循环回到上游酶促水解中来实施。当再循环静止釜底流时，未水解纤维素与送至该工艺的预处理过的原料一起变成进行纤维素酶水解的额外底物。

静止釜底流的悬浮固体浓度可以为3至40％，并且将取决于该流在进一步水解之前是否已浓缩。例如，固体浓度可以为约3、约5、约7、约8、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约26、约28、约30、约32、约34、约36、约38或约40％或约3至约40％之间的任意值。如果要浓缩该流，则可以使其进行任意已知的固-液分离，随后将固体送去进一步水解。根据该实施方案，固体浓度将通常为约12至约40％或其间的任意范围。优选的固-液分离技术的实例包括蒸发、离心、微滤、板框式过滤、错流过滤、压滤和真空过滤。如果使静止釜底流不进行分离而进行进一步水解，则其将通常具有约3至约10％或其间任意值的固体浓度。

现在参照附图中显示的实施方案，图1描述用于从木质纤维素原料102产生乙醇的工艺流程图。使木质纤维素原料102任选在水中成浆并随后进行预处理104，所述预处理104包括添加酸和蒸汽，并且使木质纤维素原料在pH、温度下反应一段持续时间以将原料的半纤维素成分水解成糖单体木糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。在利用碱将预处理过的原料的pH值调节到4.5至5.5之后，在第一酶促水解106中利用纤维素酶水解原料以产生包含葡萄糖和未水解纤维素的水解物浆。然后将水解物浆进料到第一发酵108以利用酿酒酵母将葡萄糖转化成乙醇。

然后在第一蒸馏110中蒸馏乙醇以产生包含浓缩乙醇的流和包含未转化纤维素的静止釜底流，后者被进料至第二纤维素酶水解112(也称为下游水解)，在该处将纤维素酶添加至固体中。在静止釜底流在第二水解112或下游水解中水解之后，抽出包含葡萄糖的水解物浆并进料至第二发酵118以产生乙醇，以及进行第二蒸馏20以从发酵液中回收乙醇。

图2显示一个替代方案，其中将静止釜底流214作为进料引至上游纤维素酶水解216。根据该实施方案，将蒸馏釜底液中剩余的未转化纤维素的至少一部分与从预处理204输入的预处理过的原料一起利用纤维素酶水解成葡萄糖。然后对含有来自预处理过的原料和再循环的蒸馏釜底液的水解物浆进行发酵208以产生乙醇，然后蒸馏210，如前所述。该实施方案尤其有利的是，它不必包括增加工艺成本和复杂性的第二(下游)水解系统、发酵和蒸馏系统。

任选地，可以将包含醇的发酵液的一部分作为进料流216再循环回到酶促水解206。通过将该流216再循环到水解206，蒸馏208的进料中的乙醇浓度处于足够高的水平以基本上降低其回收成本。此外，在该工艺阶段中，纤维素酶未进行蒸馏或汽提操作的苛刻条件，因此纤维素酶的一部分仍然有活性。因此，通过再循环流216，仍与未转化纤维素结合的活性纤维素酶被再次引入水解206。

此外，应当理解的是，在图1所述的实施方案中，可以将静止釜底流114的一部分再循环回到第一纤维素酶水解106。余量静止釜底流被送至第二下游纤维素酶水解112。

静止釜底流中剩余的未转化纤维素尤其适于利用纤维素酶进行进一步酶促水解。如图5和6所示，在模拟蒸馏的热变性之后，观察到了进一步纤维素酶水解后纤维素转化分数明显增加。因此，通过在该工艺阶段提供未水解纤维素的进一步水解，可以大幅增加从原料获得的可发酵糖的量，这进而增加原料的乙醇或其他发酵产物的产率。不希望受理论限制，认为纤维素转化的增加是通过苛刻的蒸馏条件(在70℃至200℃下进行0.05-12小时)使酶变性的结果。这产生含有非常少的或不含结合纤维素酶的再生底物表面，由此增加纤维素表面上酶可到达位点的数目。

图3显示本方面的另一个实施方案，其中使包含葡萄糖的发酵液进行包括热处理的处理步骤。根据该实施方案，抽出得自发酵308的包含未水解纤维素的发酵液的一部分，使其进行热处理320，并随后再循环至纤维素酶水解306。然后使余量流进行蒸馏310以获得浓乙醇。

图4显示本发明的又一个实施方案，其中得自纤维素酶水解406的水解物浆进行热处理422并随后再循环回到纤维素酶水解406。然后使余量流进行发酵408以获得乙醇，随后进行蒸馏410以获得乙醇。

应当理解的是，在水解中也可采用热稳定的纤维素酶。然而，当使用热稳定的酶时，它们必须暴露于高至足以确保酶变性的温度(即通常高于约90℃)。

尽管已经描述了使用热变性步骤，但是应当理解的是，可以通过改变pH值、蛋白酶处理、添加氧化性化学物质或使酶失活的其他化学物质来使结合纤维素的酶变性。

本发明将在以下实施例中进一步举例说明。然而，应当理解的是，这些实施例仅是用于举例说明的目的，而不应用于以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：模拟蒸馏后的酶促水解

在185℃、pH值1.0下用1wt％硫酸以与Foody的美国专利No.4,461,648一致的方式预处理小麦秸秆。预处理之后，用水洗涤秸秆并储存在4℃的冰箱中。用通过里氏木霉菌株制得的纤维素酶水解经洗涤的预处理过的小麦秸秆，该菌株被基因修饰为过度表达β-葡糖苷酶并在深层培养发酵中培养，如White和Hindle(美国专利No.6,015,703)所述。通过超滤将酶储备液浓缩至133滤纸单位/mL(165g蛋白质/L)的最终浓度并冷藏储存。在如下条件下进行纤维素水解：50mM KH₂PO₄缓冲液，pH值5.0，总体积50mL，螺旋盖烧瓶，纤维素浓度为2.53％。以3mg蛋白质/g纤维素(3mg/g)的用量添加纤维素酶，并且在发酵之前在50℃以250rpm摇动水解48小时。

然后将烧瓶冷却至30℃，并向水解浆中添加浓度为1.5g/L的Superstart^TM(得自Ethanol Technology Lallemand)干酿酒酵母。在添加酵母之后，密封烧瓶并在30℃摇动器中孵育，以200-250rpm摇动24小时以进行发酵。

在整个水解运行过程中收集样品并用于测量葡萄糖和乙醇浓度。这些浓度通过利用具有折光(RI)检测器和Aminex^TM柱的HPLC测量以分离糖、有机酸和醇。例如，为了计算样品中乙醇的浓度，使用标准品和样品的色谱。利用与标准品有相同保留时间的峰面积按如下测量浓度：

样品浓度＝面积(样品)/面积(标准品)＊稀释因子＊标准浓度。

一旦完成发酵过程，就将烧瓶浸渍在沸水中40分钟以模拟在常用的蒸馏过程中采用的温度。监测烧瓶内容物的温度，并且在整个加热过程中大致为90℃。在模拟蒸馏结束时，将烧瓶冷却至50℃，并且向浆中添加30mg/g的新鲜纤维素酶。然后将烧瓶放回50℃摇动器中，并且以250rpm摇动，直至运行结束。在整个水解过程中收集一些样品。如上所述测量样品中的葡萄糖和乙醇浓度。

通过用葡萄糖浓度除以如果所有的纤维素都转化成葡萄糖时存在的葡萄糖浓度来确定纤维素转化分数。该计算考虑到了纤维素与制得的每个葡萄糖分子水合的水分子。

图5是显示第一纤维素酶水解、发酵、模拟蒸馏和第二纤维素酶水解整个过程中纤维素转化分数的图。如图5可见，在72小时模拟蒸馏后进行的第二水解导致纤维素转化分数的明显增加。因此，这些结果表明可以采用蒸馏操作之后剩余的蒸馏釜底液的进一步水解来提高从木质纤维素原料产生可发酵糖的产率。认为在连续的纤维素酶水解期间观察到的纤维素转化的明显增加是由于在模拟蒸馏期间从纤维素中除去纤维素酶而由此在酶底物上产生新的位点引起的。

在上述反应条件下第二次试验中重复水解、发酵、模拟蒸馏和连续水解，只是有以下不同：初次水解只进行24小时，而不是48小时；初次纤维素酶用量为30mg/g，而不是3mg/g；以及浆的纤维素浓度为6.01％，而不是2.53％。

此第二次试验中的纤维素转化分数示于图6中。如图6可见，在48小时模拟蒸馏之后添加30mg/g纤维素酶也导致纤维素转化提高。因此，图6表现出与在图5中观察到的类似趋势，即在模拟蒸馏之后纤维素的转化分数提高。

实施例2：没有模拟蒸馏的对比例

为了确定所观察到的水解提高是否是由于模拟蒸馏引起的，在实施例1的第一次试验中进行了水解(见图2)，但是省略发酵和模拟蒸馏。此外，在第24小时添加含2.5％纤维素的小麦秸秆和用量为30mg/g的新鲜纤维素酶。

如图7所示，当在第24小时向烧瓶添加30mg/g的新鲜酶时，纤维素转化并未显著提高。当比较图7与图5和6时，可以看出，模拟蒸馏实际上确实显著提高了纤维素水解。

实施例3：蒸馏之后的酶促水解

根据图1中显示的工艺流程图，在210℃、pH值1.55下用0.25wt％硫酸以与Foody的美国专利No.4,461,648(其全文内容通过引用并入本文)一致的方式预处理104小麦秸秆102。预处理之后，用Alfa Laval沉降式离心机将秸秆脱水至25％固体含量。将沉降饼与离心滤液合并至13％的固体浓度，并且泵送至体积5000升的水解混合罐中。

在混合罐中，将浆冷却至50℃。通过添加30％氢氧化铵溶液将pH值调节至5.0。然后向浆中添加纤维素酶。纤维素酶通过里氏木霉菌株制得，该菌株被基因修饰为过度表达β-葡糖苷酶并在深层培养发酵中培养，如White和Hindle(美国专利No.6,015,703，其全文内容通过引用并入本文)所述。通过超滤将酶储备液浓缩至133滤纸单位/mL(165g蛋白质/L)的最终浓度并冷藏储存。以30mg蛋白质/g纤维素(30mg/g)的用量添加纤维素酶，容器106的体积为150000升。连续操作混合罐，停留时间为1小时。

将来自第一混合罐的浆进料至体积为150000升的主水解罐中。进料浆直至容器充满。在50℃下，以12-15RPM的搅拌速度进行水解96小时。此时，最终的葡萄糖浓度为75g/L，其对应于89％的纤维素转化。

此时，将水解浆泵送通过热交换器以将其冷却至30℃。然后将经冷却的浆料向上泵送到工作体积为68000升的三个发酵容器108之一中。在任意一个时刻，一个容器是充满的，一个在运行，一个正在被排空。以0.2g/L的浓度向发酵浆中添加Superstart^TM(得自Ethanol TechnologyLallemand)干酿酒酵母。在添加酵母之后，在发酵期间混合容器24小时。最终乙醇浓度为34g/L。

在完成发酵之后，将发酵液泵送至蒸馏柱110并进行蒸馏以回收乙醇。蒸馏在底部温度121℃、再沸器123℃和柱顶88℃的连续系统中进行。该蒸馏釜底液基本上不含乙醇。在蒸馏系统中10分钟的液体停留时间足以使纤维素酶变性。

在压滤机上将蒸馏釜底液浓缩至46％固体。

压滤机滤饼固体含11.9％的纤维素。该滤饼的一部分被送至第二水解112。这通过将滤饼悬浮在250ml摇瓶中的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH值5.0)中至10％的固体浓度来进行。以30mg蛋白质/g纤维素的用量添加纤维素酶。在50℃下摇动烧瓶24小时并定期取样。24小时后，摇瓶中的葡萄糖浓度为8.5g/L，其代表第一水解中初始纤维素转化为葡萄糖的总转化率为96.1％。含有葡萄糖的培养液被送至发酵118和第二蒸馏120。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种从木质纤维素原料产生醇和葡萄糖的方法，其包括以下步骤：

(i)在破坏纤维结构并增加待水解木质纤维素原料的可接近性的条件下预处理所述原料以产生包含预处理过的木质纤维素原料的组合物；

(ii)利用纤维素酶和β-葡糖苷酶酶促水解所述预处理过的木质纤维素原料以产生包含葡萄糖和未水解纤维素的水解物浆；

(iii)使所述水解物浆发酵以产生包含醇和未水解纤维素的发酵液；

(iv)通过蒸馏从所述发酵液中分离出所述醇以获得包含浓缩醇的流和包含未水解纤维素的静止釜底流，所述蒸馏导致对所述未水解纤维素的热处理；和

(v)利用纤维素酶进一步水解所述静止釜底流的至少一部分以将所述静止釜底流中存在的所述未水解纤维素的至少一部分转化成葡萄糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述进一步水解的步骤包括使所述静止釜底流的至少一部分再循环回到步骤(ii)中。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述进一步水解的步骤包括将所述静止釜底流的至少一部分引至下游水解反应器中。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中所述酶促水解所述预处理过的木质纤维素的步骤和所述使所述水解物浆发酵的步骤在分开的反应器中进行。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述预处理是利用pH调节剂进行的。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述pH调节剂是酸或碱。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述预处理过的木质纤维素原料的所述酶促水解在水解系统中进行，所述水解系统包含选自一个或更多个搅拌罐、未混合罐、搅拌塔和未混合塔的水解反应器。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述酶促水解步骤是分批式过程。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述酶促水解步骤是连续式过程。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中在所述发酵步骤中产生的所述醇是乙醇或丁醇。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述蒸馏步骤包括使所述发酵液经受约70℃至约200℃的温度。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述蒸馏实施约0.05至约12小时的浆停留时间。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述蒸馏步骤的温度为约70℃至约180℃。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其还包括使所述发酵液的至少一部分再循环回到步骤(ii)中。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述静止釜底流具有约3至约40％的悬浮固体浓度。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述静止釜底流在所述进一步水解的步骤之前被浓缩。

17.一种用于从木质纤维素原料产生乙醇和葡萄糖的方法，其包括如下步骤：

(i)在破坏纤维结构并增加待水解木质纤维素原料的可接近性的条件下预处理所述原料以产生包含预处理过的木质纤维素原料的组合物；

(ii)利用纤维素酶和β-葡糖苷酶酶促水解所述预处理过的木质纤维素原料以产生包含葡萄糖和未水解纤维素的水解物浆；

(iii)使所述水解物浆发酵以产生包含乙醇的发酵液；

(iv)通过蒸馏从所述发酵液中分离出所述乙醇以获得包含浓缩乙醇的流和包含所述未水解纤维素的剩余静止釜底流，所述蒸馏导致对所述未水解纤维素的热处理；和

(v)通过将所述静止釜底流的至少一部分再循环至步骤(ii)中，利用纤维素酶进一步水解所述静止釜底流的至少一部分以将所述未水解纤维素转化成葡萄糖。

18.一种用于从木质纤维素原料产生葡萄糖和醇的方法，其包括以下步骤：

(i)在破坏纤维结构并增加待水解木质纤维素原料的可接近性的条件下预处理所述原料以产生预处理过的木质纤维素原料；

(ii)利用纤维素酶和β-葡糖苷酶酶促水解所述预处理过的木质纤维素原料以产生包含葡萄糖和未水解纤维素的水解物浆并且使所述葡萄糖发酵以产生包含醇的发酵液；

(iii)获得包含所述未水解纤维素的工艺流；

(iv)使所述工艺流的至少一部分进行包括将所述未水解纤维素暴露于约70℃至约250℃之温度的工艺步骤，由此产生包含热处理的未水解纤维素的流；和

(v)利用纤维素酶进一步水解所述热处理过的未水解纤维素以将所述未水解纤维素的至少一部分转化成葡萄糖。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述工艺流是得自步骤(ii)的发酵液。

20.根据权利要求19所述的方法，其中

所述处理步骤是蒸馏步骤，其得到包含浓缩醇的流和包含所述未水解纤维素的静止釜底流；和

包含所述热处理过的未水解纤维素的所述流是所述静止釜底流。

21.根据权利要求18所述的方法，其中所述工艺流是在步骤(ii)中产生的包含葡萄糖和未水解纤维素的水解物浆。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述进一步水解的步骤包括使所述水解物浆的至少一部分再循环回到步骤(ii)中。

23.根据权利要求20所述的方法，其中所述进一步水解的步骤包括将所述静止釜底流的至少一部分引至下游水解反应器中。

24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述预处理是利用pH调节剂进行的。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述pH调节剂是酸或碱。

26.一种用于从木质纤维素原料产生醇和葡萄糖的方法中，其包括以下步骤：在破坏纤维结构并增加待水解木质纤维素原料的可接近性的条件下预处理所述原料以产生预处理过的木质纤维素原料；利用纤维素酶和β-葡糖苷酶酶促水解所述预处理过的木质纤维素原料以产生葡萄糖并且使所述葡萄糖发酵以产生醇；其改进包括：使含有由所述预处理和酶促水解而获得的未水解纤维素的工艺流暴露于使结合的纤维素酶变性的条件下；然后通过利用纤维素酶和β-葡糖苷酶经进一步水解使已经如此暴露于所述变性条件下的所述未水解纤维素水解成葡萄糖。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述变性步骤包括使所述未水解纤维素暴露于约70℃至约250℃的温度以使结合所述未水解纤维素的纤维素酶变性。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述变性步骤包括使所述未水解纤维素暴露于pH变化以使结合所述未水解纤维素的纤维素酶变性。

29.一种用于从木质纤维素原料产生葡萄糖的方法，其包括以下步骤：

(i)在破坏纤维结构并增加待水解木质纤维素原料的可接近性的条件下预处理所述木质纤维素原料以产生预处理过的木质纤维素原料；

(ii)利用纤维素酶和β-葡糖苷酶酶促水解所述预处理过的木质纤维素原料以产生包含葡萄糖和未水解纤维素的水解物浆并且使所述葡萄糖发酵以产生包含醇的发酵液；

(iii)获得包含所述未水解纤维素的工艺流；

(iv)使所述工艺流的至少一部分进行下述处理步骤，所述步骤包括使所述未水解纤维素暴露于酶变性步骤以使结合所述未水解纤维素的纤维素酶变性；和

(v)利用纤维素酶进一步水解包含已进行所述变性步骤之所述未水解纤维素的所述工艺流以将所述未水解纤维素的至少一部分转化成葡萄糖。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述变性步骤包括使所述未水解纤维素暴露于约70℃至约250℃的温度以使结合所述未水解纤维素的纤维素酶变性。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述变性步骤包括使所述未水解纤维素暴露于pH变化，以使结合所述未水解纤维素的纤维素酶变性。

32.根据权利要求29所述的方法，其中所述工艺流是得自步骤(ii)的发酵液。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述变性步骤是蒸馏步骤以获得包含浓缩醇的流和包含所述未水解纤维素的静止釜底流，所述蒸馏导致对所述未水解纤维素的热处理，并且其中所述静止釜底流在步骤(v)中进一步被水解。

34.根据权利要求29、30或31所述的方法，其中所述工艺流是在步骤(ii)中产生的包含葡萄糖和未水解纤维素的水解物浆。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述进一步水解的步骤包括使所述水解物浆的至少一部分再循环回到步骤(ii)中。

36.一种用于产生葡萄糖的方法，其包括使包含由之前对木质纤维素原料的预处理和纤维素酶水解而获得的未水解纤维素的工艺流中的未水解纤维素暴露于使结合的纤维素酶变性的条件下并随后通过利用纤维素酶和β-葡糖苷酶经进一步水解使已暴露于该变性条件下的所述未水解纤维素水解成葡萄糖。