用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片及其制作和使用方法

摘要

本发明的技术方案是提供一种用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片，包括基质以及设置在基质上的探针，所述探针由149个基因组成。本发明的优点是：采用基因组比较研究，经大样本量独立验证，证明该预测模型可对肝癌患者转移潜能进行准确预测和评估，从而可对患者术后生存和转移、复发进行准确预测(即使早期肝癌患者也可进行准确预测)，将有助于早期识别或预测高危患者，对其进行重点监测和有效干预，从而进一步延长肿瘤病人生存。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片及其制作方法，属于基因芯片技术领域。

背景技术

癌转移是影响肿瘤病人生存的首要因素，也是攻克肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)(简称肝癌)的重要关键。目前尚无足够特异、敏感的转移复发预测指标及预测模型，而早期准确预测转移复发是及时有效防治的前提，也是进一步延长病人生存的保证。本预测芯片可对肝癌转移潜能进行准确预测，从而能对根治术后肝癌患者转移、复发风险进行准确的预测和评估，对高风险患者进行重点监测和有效干预，减少复发、转移，进一步改善患者预后。

癌转移是本世纪生命科学要迫切解决的重大问题，也是攻克肝癌的重要关键。肝癌是世界上最常见、恶性程度最高的肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率第5位、死因第3位；每年新发病564,000例，死亡549,000例，我国占其中一半以上，是我国恶性肿瘤中第2位的杀手。虽然部分肝癌病人因早诊、早治及积极、综合治疗而获得长期生存，但转移、复发已成为进一步提高肝癌治疗效果的最主要障碍。如何及早预测、诊断、防治肝癌转移就成为进一步提高肝癌治疗效果的关键。近年肝癌转移复发研究备受关注，虽有所进展，但仍存在许多问题：

转移机理不明是缺乏有效防治手段的关键原因：目前临床的主要困惑在于无法早期判断和预测哪些病人已经或将会发生转移复发、更无有效防治措施。如能了解调控癌转移的分子机制，将有助于早期识别或预测高危患者，有助于探索有效的干预措施、及时有效的治疗，从而进一步延长肿瘤病人生存。目前已知肿瘤转移是一个多因素参与并相互作用的复杂过程，涉及癌细胞本身及其与癌周微环境和宿主免疫状态间的相互作用。但其确切机制尚不清楚。

尚无足够特异、敏感的转移复发预测指标及预测模型：早期准确预测转移复发是及时有效防治的前提，也是进一步延长病人生存的保证。传统的肿瘤诊断、分级、分型方法仅以肿瘤细胞组织来源、细胞形态学和蛋白标记物等为标准，不能充分反映肿瘤的真实情况，无法解决肿瘤的异质性问题。临床上适合手术治疗的肝癌患者绝大多数具有相同的病理分级(II-III级)和临床分期(TNM I-II期)，给予相同治疗后，病程和预后却截然不同。目前临床应用的病理分级和临床分期(如TNM分期)无法对临床复发、转移作出准确预测，无法解释为何临床分期同期、病理分级同级患者给予相同治疗但预后可以截然不同。加上病理医师的人为因素(主观性)等原因，具有严重的局限性，往往要在肿瘤转移之后才能作出诊断，而无法在肿瘤转移之前作出正确的诊断和预测。

近年，随着分子生物学技术的进步以及对肿瘤生物学的更多了解，已探索了许多与肿瘤侵袭转移相关的分子标记物，但以往研究的另一个重大缺点是这些研究大都为单因素研究模式，每次研究都集中在一个或少数几个基因，无法全面了解整个基因组多个基因的变化情况，不能反映肝癌转移的确切分子生物学特征。且由于肿瘤转移是由多因素参与调节的复杂过程，既往的单因素研究难以反映复杂转移过程的整体本质，难以准确预测临床转移过程。所以至今没有一个指标能在临床上用作肝癌转移复发的预测、诊断。

90年代后期以来发展的基因组与转录组学技术，改变了传统的单基因研究模式，使我们能从全基因组水平分析相关基因表达水平及其结构异常，以及相互作用网络、途径及调控机制等。也使研究肿瘤转移过程中多基因改变的模式及其调控机制成为可能。最近，基因表达谱已被用于多种肿瘤的分子分期、以及对治疗反应及预后判断等，如关于乳腺癌患者术后复发转移多基因预测模型已经过美国FDA批准作为诊断工具进行临床应用。但在肝癌转移及其预测中尚无相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因芯片，用于对术后肝癌患者转移与复发风险进行准确的预测和评估，对高风险患者进行重点监测和有效干预，进一步降低术后转移复发，改善患者预后。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片，包括基质以及设置在基质上的基因检测探针，其特征在于，所述探针共有146个，其特异寡核苷酸序列如下：

所述的基质为玻璃基片。

本发明还提供了上述基因芯片的制作方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：用寡核苷酸合成仪制备探针；

第二步：使用基因芯片点样仪将合成好的探针点在玻璃基片上，制成基因芯片。

本发明还提供了上述基因芯片的使用方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：对患者切除的肝癌组织和癌旁组织采用TRIzol法进行总RNA抽提：

将患者切除的肝癌组织和癌旁组织与TRIzol试剂按比例50-100毫克：1ml混合，用匀浆器匀浆；将匀浆液在室温下孵育5分钟，按1∶0.2的体积比加入氯仿，盖严，用手摇晃15秒钟，室温下孵育2-3分钟；于12000×g、4℃条件下离心15分钟，离心后混合液分成三层，取上层水相，按照每1ml TRIzol试剂加入0.5ml的比例加入异丙醇，混匀，15-30℃下静置10分钟，于12000×g、4℃条件下离心10分钟，RNA沉淀形成胶状物沉在管底管壁；倒掉上清液，按照1ml TRIzol试剂加入1ml的比例加入75％乙醇，振荡混匀；于7500×g、4℃条件下离心5分钟，弃上清液，用移液器吸干试管内残留酒精，室温下自然干燥RNA沉淀5-10分钟；用DEPC处理过的水重新溶解RNA；取1μl RNA溶液用199μl pH7.4的TE缓冲液稀释，用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度；

第二步：采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳对组织标本总RNA样品进行质量检测：

将10X MOPS缓冲液10ml、0.1％DEPC(焦碳酸乙二酯)水70ml、37％甲醛20ml与RNA琼脂糖1.0g混合制备甲醛变性琼脂糖凝胶；用DEPC处理过的水将10X MOPS缓冲液稀释成1X MOPS缓冲液配制电泳缓冲液；将RNA样品5.5μl、10X MOPS缓冲液1.0μl、37％甲醛3.5μl以及去离子甲酰胺10.0μl混合，配成电泳样品，65℃孵育5分钟，冰上冷却；将电泳槽内注入电泳缓冲液，置入甲醛变性琼脂糖凝胶；电泳样品内加入2μl 10X RNA加样缓冲液以及0.1μl EB，混合均匀后加入上样孔内，电压100V条件下电泳30分钟，紫外线凝胶分析仪下观测，拍照；当检测证实RNA没有降解时，进入下一步；

第三步：将肝癌组织和癌旁组织RNA逆转录制成cDNA，纯化洗涤采用双荧光间接标记法分别对肝癌组织cDNA和癌旁组织cDNA进行标记，用Monoreactive Cy5 Dye(AmershamPharmacia Biotech，#PA23001)标记肿瘤组织cDNA，用Monoreactive Cy3 Dye(Amersham PhamaciaBiotech，#PA25001)标记癌旁组织cDNA；分别用Microcon YM-30(MILLIPORE，Amicon，Cat#42410)离心柱对cDNA进行纯化：

(1)将组织总RNA、浓度为2μg/μl Oligo dT 20-mer以及DEPC处理过的水按比例40μg∶2μl∶23μl混合，总体积为25μl，65℃孵育5分钟，冷却至室温得到RNA样品混合液；配制20X dNTP混合液，所述混合液中含有10mM dATP，10mM dGTP，10mM dCTP，4mMdTTP以及6mM氨基修饰的dUTP；将5X RT buffer 10μl、20X dNTP混合液2.5μl、0.1MDTT 5μl、superRNase IN 1μl以及DEPC treated water 4.5μl混合得到逆转录反应混合液；将RNA样品混合液与逆转录反应混合液混合，加入2μl浓度为200U/μl的逆转录酶Superscript II，42℃孵育60分钟，70℃孵育5分钟，短暂离心，加入2μl浓度为2U/μl的RNA酶H，37℃孵育30分钟；加入0.5μl浓度为0.5M EDTA终止反应，加入10μlQuickclean enzyme remove resin，振摇1分钟，以13000转/分的速度离心1分钟；将上清液移至0.65μm过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟；收集滤液，加入5.5μl 3M醋酸钠溶液，137.5μl冰预冷的100％乙醇，振荡混匀，-20℃放置1小时，使cDNA沉淀；4℃以14000转/分的速度离心15分钟；弃上清，用500μl 70％的乙醇洗涤沉淀两次；37℃孵育4-6分钟；用20μl 0.1M碳酸氢钠溶液重新溶解cDNA；

(2)用10μl去离子蒸馏水将Monoreactive Cy3 Dye和Monoreactive Cy5 Dye完全溶解，混匀后短暂离心备用；取2ul染料溶液加入用碳酸氢钠溶解的cDNA溶液中，立即用振荡器振荡混匀，用Monoreactive Cy5 Dye标记肿瘤组织cDNA，用Monoreactive Cy3Dye标记癌旁组织cDNA；室温下于暗处放置1小时，每20分钟振荡混匀一次，使染料与氨基修饰过的dUTP充分结合，从而标记cDNA；

(3)在标记过的cDNA混合液中加入2.5μl 3M醋酸钠溶液，62.5μl冰预冷的100％乙醇，振荡混匀，-20℃放置1小时，使标记后的cDNA沉淀；4℃以14000转/分的速度离心15分钟，使沉淀离心至管底；吸去上清液，用800μl 70％的乙醇洗涤沉淀；37℃孵育4-6分钟；用80μl TE缓冲液将沉淀重新溶解，将Cy5标记的肝癌组织cDNA和相对应的Cy3标记的癌旁组织cDNA溶液混合于同一个离心管中，混合均匀；加入550μl的PB缓冲液，混合均匀；将溶液移至纯化过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟，弃滤过液，在纯化过滤离心柱中加入750μl的PE缓冲液，室温下放置5分钟，以13000转/分的速度离心1分钟；弃过滤液，以13000转/分的速度离心1分钟去除残留乙醇；在纯化过滤离心柱中加入50μl的EB洗脱液，室温放置5分钟，以13000转/分的速度离心5分钟洗脱回收纯化后的cDNA；

(4)在Microcon YM-30离心柱中加入400μl pH 7.4的TE缓冲液，以9000转/分的速度离心1分钟，洗涤离心柱；将洗脱回收cDNA溶液加入YM-30离心柱中，以9000转/分的速度离心8-10分钟，至液体剩余体积为20-40μl；加入400μl pH 7.4的TE缓冲液，以9000转/分的速度离心8-10分钟洗涤cDNA，重复3-4次；最后一次洗涤后离心至剩余液体体积小于15μl，将离心柱倒置于新的离心管中，以9000转/分的速度离心5分钟，回收经纯化的cDNA；加入pH 7.4的TE缓冲液使体积为17μl；

第四步：将基因芯片浸入预杂交液进行预杂交：

按下列比例配制预杂交缓冲液：20X SSC 15ml、10％SDS 0.6ml、10％BSA6ml以及去离子蒸馏水38.4ml；将预杂交液倒入预杂交槽中，于42℃水浴箱内预热10分钟；将微阵列芯片浸入预杂交液中预杂交1小时以上；用双蒸水洗涤微阵列芯片2分钟；将微阵列芯片转移至异丙醇液中洗涤2分钟；于700rpm离心洗涤过的芯片5分钟，使芯片干燥；将芯片置芯片盒内保存；将基因芯片浸入预杂交液中进行预杂交1-3小时，用双蒸水洗涤后以转速700rpm离心5分钟，使基因芯片干燥；

第五步：基因芯片杂交：

将去离子甲酰胺250μl、20X SSC250μl以及10％SDS10μl混合配制2X F-杂交缓冲液；震荡摇匀后42℃保存；将1μl浓度为10μg/μl的Human COT-1DNA、1μl浓度为8-10μg/μl的poly A及1μl浓度为4μg/μl的yeast tRNA加入纯化后的cDNA溶液中，最终杂交样品体积为20μl；震荡混匀、短暂离心，将杂交样品置100℃加热器中变性2分钟，置冰上冷却1分钟，短暂离心后置于42℃加热器内5分钟；加入20μl的2X F-杂交缓冲液至杂交样品中，混合均匀，短暂离心，最后总体积为40μl；将杂交样品加入微阵列芯片及其盖玻片之间的空间内；将芯片放置杂交槽内，杂交槽内两端各加入20μl双蒸水；盖严密封杂交槽，将杂交槽放入42℃水浴箱内孵育过夜；

第六步：杂交后芯片的洗涤和扫描分析：

将杂交芯片浸入含有1X SSC及0.1％SDS的洗涤液中，洗涤芯片2分钟；在1X SSC洗涤液中洗涤2分钟；在0.2X SSC洗涤液中洗涤2分钟；在0.2X SSC洗涤液中洗涤1分钟；在0.05X SSC洗涤液中洗涤30秒；于700rpm离心芯片5分钟；用GenePix 4000A扫描仪扫描芯片并进行芯片图像的分析处理。

本发明的原理如下：

过去经典肿瘤转移理论认为转移是肿瘤细胞高度克隆选择的过程，在原发瘤中仅少数癌细胞具有转移潜能，而且转移发生在肿瘤晚期(Fidler.Nat Rev Cancer 2003)。这些理论对指导肿瘤转移研究起到重要作用。但这些理论大多从动物实验模型中得出，缺乏人类肿瘤转移的直接证据。临床上常见肿瘤很小，但很早已出现远处转移，甚至原发瘤隐匿不现而全身转移者；并且许多病理特征、临床分期相同的肿瘤病人却具有完全不同的疾病过程和预后(Ramaswamy et al.Nat Get 2003)。这些是经典肿瘤转移理论所难以解释的。

本发明应用cDNA microarrays技术在全基因组范围比较研究40例伴或不伴肝内播散的肝癌组织中9，180个基因表达谱的变化，发现伴转移肝癌与不伴转移肝癌之间基因表达差异明显(153个基因有显著差异，p＜0.001)，而肝癌原发瘤与其转移灶间基因表达谱差异并不非常显著(p＞0.05)；且这种差异与肿瘤大小等临床病理特征并无明显关系。不同临床分组间基因表达谱差异分析(CCP法)如下表所示：

由此提示促使肝癌转移的基因改变可能在原发肿瘤阶段就已经发生，高转移倾向肝癌与低转移倾向肝癌具有完全不同的基因谱。这可能就是临床上为何肝癌的临床病例特征(肿瘤大小、病理分级及临床分期等)相似、而治疗效果和生存期差异明显的原因之一。据此，该研究在国际上首次提出促使肝癌转移的基因改变主要发生在原发瘤阶段的新观点，回答了有关肿瘤转移潜能是在原发瘤阶段即已存在、还是在肿瘤转移过程中逐渐获得的这一长期存在争论的问题，有助于转移前肿瘤的及早发现。此为肝癌转移理论的重要创新，这一发现丰富了经典转移理论，也为肝癌转移复发的早期预测、诊断和防治奠定了理论基础。提示转移复发可早期预测及发现、转移防治应从“源头”抓起。研究结果以封面文章形式发表在“自然医学杂志”(Nat Med 2003，IF 28.9)。

如何及早、准确地预测肝癌的转移潜能是困扰临床的一大难题。根据上述研究发现的伴转移肝癌与不伴转移肝癌之间153个显著差异基因，在国际上首次建立了能正确预测病人有无肝内转移的多分子预测模型，可将20例(100％)建立模型标本进行准确分类，经小样本验证，可以准确预测另外20例待测标本中的至少18例，预测准确率达90％(Nat Med2003)。

最近，本发明采用Affymetrix U133A基因芯片(不同平台)对该预测模型进行了241例大样本独立验证，在新基因芯片中，对153个预测基因进行优化，应用优化后其中146个基因组成的预测模型对患者进行生存预测分析并分组，发现高风险组生存预后比低风险组显著差(P＝0.0014，如图1所示，为肝癌转移预测模型对241例术后肝癌患者生存预测分析结果图)，可以对患者生存进行准确预测。更重要的是该预测模型可以对单发肿瘤肝癌(P＝0.0006，如图2所示，为肝癌转移预测模型对189例单发肿瘤肝癌患者生存预测分析结果图)和小肝癌(肿瘤小于5cm)(P＝0.0029，如图3所示，为肝癌转移预测模型对154例小肝癌患者生存预测分析结果)进行准确的生存预测。此外应用该预测模型还可以对肝癌患者术后早期复发进行准确的预测(P＝0.0006，如图4所示，为肝癌转移预测模型对186例肝癌患者早期复发预测分析结果图)。

这是国际上第一个经过不同试验平台和不同病例分组(大样本)验证可用于肝癌临床转移复发及预后预测的分子诊断模型。这是肝癌转移预测方法的重要进展，揭示了肿瘤细胞分子生物学特性是决定肿瘤转移的重要因素，经大样本量的进一步验证，证实其具有重要的临床应用价值。146个预测基因列表及其权重如下表所示：

预测计算公式如下：

P＝∑_iw_ix_i-0.166532

其中，Wi表示i基因的权重，Xi表示i基因的表达结果的对数值。

预测结果的判定如下：

根据预测计算公式计算每个病例的预测值P值，如果P＞-0.055761，则判定为高风险，如果P≤-0.055761，则判定为低风险。

本发明的优点是：采用基因组比较研究，经大样本量独立验证，证明该预测模型可对肝癌患者转移潜能进行准确预测和评估，从而可对患者术后生存和转移、复发进行准确预测(即使早期肝癌患者也可进行准确预测)，将有助于早期识别或预测高危患者，对其进行重点监测和有效干预，从而进一步延长肿瘤病人生存。

附图说明

图1为肝癌转移预测模型对241例术后肝癌患者生存预测分析结果图；

图2为肝癌转移预测模型对189例单发肿瘤肝癌患者生存预测分析结果图；

图3为肝癌转移预测模型对154例小肝癌患者生存预测分析结果图；

图4为肝癌转移预测模型对186例肝癌患者早期复发预测分析结果图。

具体实施方式

下面结合实施例来具体说明本发明。

实施例1

一种用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片，包括基质以及设置在基质上的基因检测探针，所述的基质为玻璃基片。所述探针共有146个，其特异寡核苷酸序列如下：

上述基因芯片的制作方法如下：

第一步：用寡核苷酸合成仪制备探针；

第二步：使用基因芯片点样仪将合成好的探针点在玻璃基片上，制成基因芯片。

实施例1

患者洪某，男，39岁，因患原发性肝癌于2002年8月21日于我院进行根治性手术切除治疗，术后我们收集患者手术标本，使用实施例1制成的基因芯片按下述方法进行检测：

第一步：对患者切除的肝癌组织和癌旁组织采用TRIzol法进行总RNA抽提：

1.取50毫克组织，加入1ml TRIzol试剂(GIBCO公司生产)，组织的体积不应超过加入TRIzol体积的10％。使用匀浆器充分匀浆。

2.将匀浆液在室温下孵育5分钟，使核蛋白复合体充分裂解。

3.按1∶0.2(TRIzol∶氯仿)的体积比加入氯仿，盖严，用手剧烈摇晃15秒钟，室温下孵育2分钟。

4.于12000×g、4℃条件下离心15分钟，离心后混合液分成三层，分别为底层红色的酚-氯仿相，中间相和无色的上层水相。RNA只存在于上层水相中，水相的体积约为加入TRIzol体积的60％。

5.将水相移入一个干净的离心管中，按照每1ml TRIzol加入0.5ml的比例加入异丙醇，混匀，15-30℃静置10分钟。

6.于12000×g、4℃条件下离心10分钟，RNA沉淀形成胶状物沉在管底管壁。

7.RNA洗涤：倒掉上清液，按照1ml TRIzol加入1ml的比例加入75％乙醇，振荡混匀。

8.于7500×g、4℃条件下离心5分钟，弃上清液，用移液器吸干试管内残留酒精，室温下自然干燥RNA沉淀5分钟，注意不要让RNA完全干燥，因RNA完全干燥后很难溶解。

9.用DEPC处理过的水重新溶解RNA。

10.用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度：取1μl RNA溶液用199μl TE缓冲液(pH7.4)稀释，用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度及纯度。

11.当证实RNA样品纯度良好时进入下一步。

第二步：采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳对组织标本总RNA样品进行质量检测：

1.甲醛变性琼脂糖凝胶的制备(1％琼脂糖，100ml)：

2.电泳缓冲液的制备：用DEPC处理过的水将10X MOPS缓冲液稀释成1X MOPS缓冲液。

3.按下列组成配制电泳样品，65℃孵育5分钟，冰上冷却。

4.加2μl 10X RNA加样缓冲液、0.1μl EB，电压100V条件下电泳约30分钟，紫外线凝胶分析仪下观测，拍照。当检测证实RNA没有降解时，进入下一步；

第三步：将肝癌组织和癌旁组织RNA逆转录制成cDNA，纯化洗涤采用双荧光间接标记法分别对肝癌组织cDNA和癌旁组织cDNA进行标记，用Monoreactive Cy5 Dye标记肿瘤组织cDNA，用Monoreactive Cy3 Dye标记癌旁组织cDNA；分别用Microcon YM-30离心柱对cDNA进行纯化；

(1)肝癌组织和癌旁组织RNA逆转录制成cDNA：

1.取组织总RNA 40μg，加入2μl Oligo dT 20-mer(2μg/μl)，加入DEPC处理过的水到总体积为25μl，混合均匀。

2.65℃孵育5分钟，室温下放置超过3分钟，使样品混合液冷却至室温。

3.按以下比例配制逆转录所需20X dNTP混合液：10mM dATP，10mM dGTP，10mM dCTP，4mM dTTP，6mM aminoally-dUTP(氨基修饰的dUTP，可以和N-羟琥珀酰亚胺活化的荧光染料进行偶联反应)。

4.按以下列表准备逆转录反应混合液，混合均匀。

5.将RNA样品混合液与逆转录反应混合液混合。

6.加入2μl逆转录酶(Superscript II，200U/μl)，充分混匀(注意防止气泡形成)。

7.42℃孵育60分钟。

8.70℃孵育5分钟，使逆转录酶失去活性。

9.加入2μlRNA酶H(2U/μl)，37℃孵育30分钟，降解残余RNA。

10.加入0.5μl 0.5M EDTA终止反应，加入10μl Quickclean enzyme remove resin，振荡器剧烈振摇1分钟，以13000转/分的速度离心1分钟。

11.将上清液移至0.65μm过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟。

12.收集滤过液，加入5.5μl 3M醋酸钠溶液，137.5μl冰预冷的100％乙醇，振荡混匀，-20℃放置1小时，使cDNA沉淀。

13.4℃以14000转/分的速度离心15分钟。

14.弃上清，用500μl 70％的乙醇洗涤沉淀两次。

15.37℃孵育4分钟，使沉淀干燥。

16.用20μl 0.1M NaHCO₃溶液重新溶解cDNA。

(2)cDNA的间接标记：

1.用10μl去离子蒸馏水将Monoreactive Cy3 Dye和Monoreactive Cy5 Dye完全溶解，混匀后短暂离心，备用。

2.取2ul染料溶液加入用NaHCO₃溶解的cDNA溶液中，立即用振荡器振荡混匀。用Monoreactive Cy5 Dye标记肿瘤组织cDNA(激光激发后显红色荧光)，用MonoreactiveCy3Dye标记癌旁组织cDNA(激光激发后显绿色荧光)。

3.室温下于暗处放置1小时，每20分钟柔和振荡混匀一次。使染料与氨基修饰过的dUTP充分结合，从而标记cDNA。

(3)使用Qiagen公司的QIAquick PCR Purification试剂盒进行cDNA纯化：

1.在探针标记混合液中加入2.5μl 3M醋酸钠溶液，62.5μl冰预冷的100％乙醇，振荡混匀，-20℃放置1小时，使标记后的cDNA沉淀。

2.4℃以14000转/分的速度离心15分钟，使沉淀离心至管底。

3.吸去上清液，用800μl 70％的乙醇洗涤沉淀。

4.37℃孵育4-6分钟，使沉淀干燥。

5.用80μl TE缓冲液将沉淀重新溶解，将Cy5标记的肝癌组织cDNA和相对应的Cy3标记的癌旁组织cDNA溶液混合于同一个离心管中，混合均匀。

6.加入550μl的PB缓冲液，混合均匀。

7.将溶液移至纯化过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟。

8.弃滤过液，在纯化过滤离心柱中加入750μl的PE缓冲液(使用前在6ml溶液中加入24ml乙醇，混合均匀)，室温下放置5分钟，以13000转/分的速度离心1分钟。

9.弃滤过液，以13000转/分的速度离心1分钟去除残留乙醇。

10.在纯化过滤离心柱中加入50μl的EB洗脱液，室温放置5分钟，以13000转/分的速度离心5分钟洗脱回收纯化后的cDNA。

(4)用Microcon YM-30离心柱对cDNA进行纯化：

1.在Microcon YM-30离心柱中加入400μl TE缓冲液(pH 7.4)，以9000转/分的速度离心1分钟，洗涤离心柱。

2.将洗脱回收cDNA溶液加入YM-30离心柱中，以9000转/分的速度离心8分钟，至液体剩余体积为20μl。

3.加入400μl TE缓冲液(pH 7.4)，以9000转/分的速度离心8分钟洗涤cDNA，重复3次。

4.最后一次洗涤后离心至剩余液体体积小于15μl，将离心柱倒置于新的离心管中，以9000转/分的速度离心5分钟，回收经纯化的cDNA。

5.加入TE缓冲液(pH 7.4)使体积为17μl。

第四步：将基因芯片浸入预杂交液进行预杂交：

1.按照下列比例配制终浓度为5X SSC、0.1％SDS及i％BSA的预杂交缓冲液：

2.将预杂交液倒入预杂交槽中，于42℃水浴箱内预热10分钟。

3.将微阵列芯片浸入预杂交液中预杂交1小时以上。

4.用双蒸水洗涤微阵列芯片2分钟。

5.将微阵列芯片转移至异丙醇液中洗涤2分钟。

6.于700rpm离心洗涤过的芯片5分钟，使芯片干燥。

7.将芯片置芯片盒内保存(注意芯片干燥后放置时间不能超过1小时)。

将基因芯片浸入预杂交液中进行预杂交1小时，用双蒸水洗涤后以转速700rpm离心5分钟，使基因芯片干燥；

第五步：基因芯片杂交：

1.按以下比例配制新鲜2X F-杂交缓冲液：去离子甲酰胺250μl+20X SSC 250μl+10％SDS10μl。

2.震荡摇匀后保存在42℃加热器内。

3.将1μl Human COT-1DNA(10μg/μl)、1μl poly A(8μg/μl)及1μl yeast tRNA(4μg/μl)加入纯化后的cDNA溶液中，最终杂交样品体积为20μl。

4.震荡混匀、短暂离心。

5.将杂交样品置100℃加热器中变性2分钟，迅速置冰上冷却1分钟，短暂离心后置于42℃加热器内5分钟。

6.加入20μl的2X F-杂交缓冲液至杂交样品中，混合均匀，最后总体积为40μl。

7.将杂交样品小心加入微阵列芯片及其盖玻片之间的空间内，注意勿产生气泡。

8.将芯片放置杂交槽内，杂交槽内两端各加入20μl双蒸水(保持杂交槽内的湿度)。

9.盖严密封杂交槽，将杂交槽放入42℃水浴箱内孵育过夜(12-16小时)。

第六步：杂交后芯片的洗涤和扫描分析：

1.将杂交芯片浸入1X SSC及0.1％SDS洗涤液中，小心使盖玻片从芯片上滑落，洗涤芯片2分钟。

2.在1X SSC洗涤液中洗涤2分钟。

3.在0.2X SSC洗涤液中洗涤2分钟。

4.在0.2X SSC洗涤液中洗涤1分钟。

5.在0.05X SSC洗涤液中洗涤30秒。

6.于700rpm离心芯片5分钟，使芯片干燥。

7.尽快用GenePix 4000A扫描仪扫描芯片并进行芯片图像的分析处理。

各浓度洗涤液的配置方法列表：

用BRB-TOOLS软件对这146个基因的表达情况进行分析，并根据预测公式P＝∑_iw_ix_i-0.166532计算，结果P＜-0.055761，预测为低风险组。患者随访至今无复发转移情况。

实施例2

患者朱某，男，44岁，因患原发性肝癌于2002年12月30日于我院进行根治性手术切除治疗，术后我们收集患者手术标本，使用实施例1制成的基因芯片按下述方法进行检测：

第一步：对患者切除的肝癌组织和癌旁组织采用TRIzol法进行总RNA抽提：

1.取100毫克组织，加入1ml TRIzol试剂(GIBCO公司生产)，组织的体积不应超过加入TRIzol体积的10％。使用匀浆器充分匀浆。

2.将匀浆液在室温下孵育5分钟，使核蛋白复合体充分裂解。

3.按1∶0.2(TRIzol∶氯仿)的体积比加入氯仿，盖严，用手剧烈摇晃15秒钟，室温下孵育3分钟。

4.于12000×g、4℃条件下离心15分钟，离心后混合液分成三层，分别为底层红色的酚-氯仿相，中间相和无色的上层水相。RNA只存在于上层水相中，水相的体积约为加入TRIzol体积的60％。

5.将水相移入一个干净的离心管中，按照每1ml TRIzol加入0.5ml的比例加入异丙醇，混匀，15-30℃静置10分钟。

6.于12000×g、4℃条件下离心10分钟，RNA沉淀形成胶状物沉在管底管壁。

7.RNA洗涤：倒掉上清液，按照1ml TRIzol加入1ml的比例加入75％乙醇，振荡混匀。

8.于7500×g、4℃条件下离心5分钟，弃上清液，用移液器吸干试管内残留酒精，室温下自然干燥RNA沉淀10分钟，注意不要让RNA完全干燥，因RNA完全干燥后很难溶解。

9.用DEPC处理过的水重新溶解RNA。

10.用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度：取1μl RNA溶液用199μl TE缓冲液(pH7.4)稀释，用Nanodrop分光光度计检测RNA浓度及纯度。

当证实RNA样品纯度良好时进入下一步。

第二步：采用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳对组织标本总RNA样品进行质量检测：

1.甲醛变性琼脂糖凝胶的制备(1％琼脂糖，100ml)：

5.电泳缓冲液的制备：用DEPC处理过的水将10X MOPS缓冲液稀释成1X MOPS缓冲液。

6.按下列组成配制电泳样品，65℃孵育5分钟，冰上冷却。

7.加2μl 10X RNA加样缓冲液、0.1μl EB，电压100V条件下电泳约30分钟，紫外线凝胶分析仪下观测，拍照。当检测证实RNA没有降解时，进入下一步；

第三步：将肝癌组织和癌旁组织RNA逆转录制成cDNA，纯化洗涤采用双荧光间接标记法分别对肝癌组织cDNA和癌旁组织cDNA进行标记，用Monoreactive Cy5 Dye标记肿瘤组织cDNA，用Monoreactive Cy3 Dye标记癌旁组织cDNA；分别用Microcon YM-30离心柱对cDNA进行纯化；

(1)肝癌组织和癌旁组织RNA逆转录制成cDNA：

1.取组织总RNA 40μg，加入2μl Oligo dT 20-mer(2μg/μl)，加入DEPC处理过的水到总体积为25μl，混合均匀。

2.65℃孵育5分钟，室温下放置超过3分钟，使样品混合液冷却至室温。

3.按以下比例配制逆转录所需20X dNTP混合液：10mM dATP，10mM dGTP，10mM dCTP，4mM dTTP，6mM aminoally-dUTP(氨基修饰的dUTP，可以和N-羟琥珀酰亚胺活化的荧光染料进行偶联反应)。

4.按以下列表准备逆转录反应混合液，混合均匀。

5.将RNA样品混合液与逆转录反应混合液混合。

6.加入2μl逆转录酶(Superscript II，200U/μl)，充分混匀(注意防止气泡形成)。

7.42℃孵育60分钟。

8.70℃孵育5分钟，使逆转录酶失去活性。

9.加入2μl RNA酶H(2U/μl)，37℃孵育30分钟，降解残余RNA。

10.加入0.5μl 0.5M EDTA终止反应，加入10μl Quickclean enzyme remove resin，振荡器剧烈振摇1分钟，以13000转/分的速度离心1分钟。

11.将上清液移至0.65μm过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟。

12.收集滤过液，加入5.5μl 3M醋酸钠溶液，137.5μl冰预冷的100％乙醇，振荡混匀，-20℃放置1小时，使cDNA沉淀。

13.4℃以14000转/分的速度离心15分钟。

14.弃上清，用500μl 70％的乙醇洗涤沉淀两次。

15.37℃孵育6分钟，使沉淀干燥。

16.用20μl 0.1M NaHCO₃溶液重新溶解cDNA。

(2)cDNA的间接标记：

1.用10μl去离子蒸馏水将Monoreactive Cy3 Dye和Monoreactive Cy5 Dye完全溶解，混匀后短暂离心，备用。

2.取2ul染料溶液加入用NaHCO₃溶解的cDNA溶液中，立即用振荡器振荡混匀。用Monoreactive Cy5 Dye标记肿瘤组织cDNA(激光激发后显红色荧光)，用Monoreactive Cy3Dye标记癌旁组织cDNA(激光激发后显绿色荧光)。

3.室温下于暗处放置1小时，每20分钟柔和振荡混匀一次。使染料与氨基修饰过的dUTP充分结合，从而标记cDNA。

(3)使用Qiagen公司的QIAquick PCR Purification试剂盒进行cDNA纯化：

1.在探针标记混合液中加入2.5μl 3M醋酸钠溶液，62.5μl冰预冷的100％乙醇，振荡混匀，-20℃放置1小时，使标记后的cDNA沉淀。

2.4℃以14000转/分的速度离心15分钟，使沉淀离心至管底。

3.吸去上清液，用800μl 70％的乙醇洗涤沉淀。

4.37℃孵育4-6分钟，使沉淀干燥。

5.用80μl TE缓冲液将沉淀重新溶解，将Cy5标记的肝癌组织eDNA和相对应的Cy3标记的癌旁组织cDNA溶液混合于同一个离心管中，混合均匀。

6.加入550μl的PB缓冲液，混合均匀。

7.将溶液移至纯化过滤离心柱中，以13000转/分的速度离心1分钟。

8.弃滤过液，在纯化过滤离心柱中加入750μl的PE缓冲液(使用前在6ml溶液中加入24ml乙醇，混合均匀)，室温下放置5分钟，以13000转/分的速度离心1分钟。

9.弃滤过液，以13000转/分的速度离心1分钟去除残留乙醇。

10.在纯化过滤离心柱中加入50μl的EB洗脱液，室温放置5分钟，以13000转/分的速度离心5分钟洗脱回收纯化后的cDNA。

(4)用Microcon YM-30离心柱对cDNA进行纯化：

1.在Microcon YM-30离心柱中加入400μl TE缓冲液(pH 7.4)，以9000转/分的速度离心1分钟，洗涤离心柱。

2.将洗脱回收cDNA溶液加入YM-30离心柱中，以9000转/分的速度离心10分钟，至液体剩余体积为40μl。

3.加入400μl TE缓冲液(pH 7.4)，以9000转/分的速度离心10分钟洗涤cDNA，重复4次。

4.最后一次洗涤后离心至剩余液体体积小于15μl，将离心柱倒置于新的离心管中，以9000转/分的速度离心5分钟，回收经纯化的cDNA。

5.加入TE缓冲液(pH 7.4)使体积为17μl。

第四步：将基因芯片浸入预杂交液进行预杂交：

1.按照下列比例配制终浓度为5X SSC、0.1％SDS及1％BSA的预杂交缓冲液：

2.将预杂交液倒入预杂交槽中，于42℃水浴箱内预热10分钟。

3.将微阵列芯片浸入预杂交液中预杂交1小时以上。

4.用双蒸水洗涤微阵列芯片2分钟。

5.将微阵列芯片转移至异丙醇液中洗涤2分钟。

6.于700rpm离心洗涤过的芯片5分钟，使芯片干燥。

7.将芯片置芯片盒内保存(注意芯片干燥后放置时间不能超过1小时)。

将基因芯片浸入预杂交液中进行预杂交3小时，用双蒸水洗涤后以转速700rpm离心5分钟，使基因芯片干燥；

第五步：基因芯片杂交：

1.按以下比例配制新鲜2X F-杂交缓冲液：去离子甲酰胺250μl+20X SSC 250μl+10％SDS10μl。

2.震荡摇匀后保存在42℃加热器内。

3.将1μl Human COT-1DNA(10μg/μl)、1μl poly A(10μg/μl)及1μl yeast tRNA(4μg/μl)加入纯化后的cDNA溶液中，最终杂交样品体积为20μl。

4.震荡混匀、短暂离心。

5.将杂交样品置100℃加热器中变性2分钟，迅速置冰上冷却1分钟，短暂离心后置于42℃加热器内5分钟。

6.加入20μl的2X F-杂交缓冲液至杂交样品中，混合均匀，最后总体积为40μl。

7.将杂交样品小心加入微阵列芯片及其盖玻片之间的空间内，注意勿产生气泡。

8.将芯片放置杂交槽内，杂交槽内两端各加入20μl双蒸水(保持杂交槽内的湿度)。

9.盖严密封杂交槽，将杂交槽放入42℃水浴箱内孵育过夜(12-16小时)。

第六步：杂交后芯片的洗涤和扫描分析：

1.将杂交芯片浸入1X SSC及0.1％SDS洗涤液中，小心使盖玻片从芯片上滑落，洗涤芯片2分钟。

2.在1X SSC洗涤液中洗涤2分钟。

3.在0.2X SSC洗涤液中洗涤2分钟。

4.在0.2X SSC洗涤液中洗涤1分钟。

5.在0.05X SSC洗涤液中洗涤30秒。

6.于700rpm离心芯片5分钟，使芯片干燥。

7.尽快用GenePix 4000A扫描仪扫描芯片并进行芯片图像的分析处理。

各浓度洗涤液的配置方法列表：

用BRB-TOOLS软件对这146个基因的表达情况进行分析，并根据预测公式P＝∑_iw_ix_i-0.166532计算，结果P＞-0.055761，预测为高风险组。术后患者于2003年3月出现肝内复发，2003年12月死亡。

序列表

<110>复旦大学附属中山医院

<120>用于预测肝癌转移与复发风险的基因芯片及其制作和使用方法

<160>146

<210>1

<211>60

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>1

actttgccag ctgtgtggag gatggatttg agggagacaa gactggaggc agtagtccag 60

<210>2

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>2

caagggagac gaggatacca aagacgattc agaggagacg gtgcccaacc ccttcagcca 60

actcactgac                                                        70

<210>3

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>3

cacagcctct ggttaaatcc ctcccctcct gcttggcaac ttcagctagc tagatatatc 60

catggtccag                                                        70

<210>4

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>4

aactgtgtgg tgctgaagcc atcggagatt agcaagaacg tcgagaagat cctggccgag 60

gtgctgcccc                                                        70

<210>5

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>5

ggaaccaaaa tggagtcact tatgccaaac tctaataaaa tggagtcggg gggccacata 60

gaagccctca                                                        70

<210>6

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>6

tacaagacct ctcgcatagc tacattctga ggcaaacgac agactcttaa tcagtaaatg 60

ttcactggc                                                         69

<210>7

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>7

ttggctttta ttccctgcct ttgcagaact gatgtcaccc cagatgtcct tccctcccta 60

ataactgta                                                         69

<210>8

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>8

tcccatttga caaggtacca ggaggaaatt ttttaaggga tcaactgtat cacagtgccc 60

actctggac                                                         69

<210>9

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>9

tggagagagg ctgcctttct ggttccatct ccttgggtgt gaggatagaa tttcgaacac 60

caagagtcaa                                                        70

<210>10

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>10

ctgaaacagc ttcttctggc tcataaagat tgccctgtaa ccgccatgca gaagaaatct 60

ggctatcata                                                        70

<210>11

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>11

accacctgct cactggtcaa aacctacaca gctgtttcct cacgtccatc actggctctc 60

taattccact                                                        70

<210>12

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>12

taatatacct tcagtcaact ttaccaagaa gtcctggatt tccaagatcc gcgtctgaaa 60

gtgcagtac                                                         69

<210>13

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>13

cagcagctgg cgcctcagtc cccatctgac tcatgtctct tctcatctgg ttcagaactt 60

agaagggcg                                                         69

<210>14

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>14

cagcatgtct accagaaaaa tggtttgaaa attctgccat gaggacatct attccacagc 60

tagaaaactt                                                        70

<210>15

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>15

agggccctgg gatggagcca acctgggtat tcacaacagg cctgacttga tactaagtga 60

ttagttttc                                                         69

<210>16

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>16

tacatcccat tccttcctag tgagaagctg gaaagaacca gctctgtctc tccatccaca 60

gcagagccg                                                         69

<210>17

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>17

acacagtgtg aataaagtgc tgcggagcaa gaggaggccg ttgattcact tcacgctttc 60

agcgaatga                                                         69

<210>18

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>18

tgctgcctgt aaatatttgt ttaatcccca gttcgcctgg agccctccgc cttcacattc 60

ccctgggga                                                         69

<210>19

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>19

cccactgtag aggacggtga gccgcagctg catcaacctc cttttacctt tagataggtg 60

aatttttaca                                                        70

<210>20

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>20

cacaccctgc tgatcaaagt ggaaaatgaa gacccactcg tacccgacgt ctcctacggc 60

cccagctcca                                                        70

<210>21

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>21

taaaggcagt cttgagacag gaaagagtga gcttgtaccc tttccagatc cacagcattg 60

cactgtcaa                                                         69

<210>22

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>22

aagagaggct cacaaacaag taacttgtga gaattctcca aagtctccta aagtgactgg 60

aacagcttc                                                         69

<210>23

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>23

atgcccggtc ggtgaagctc cgaccagggg agcactttgt ggaggatgtc actgacacac 60

tcaaacgctt                                                        70

<210>24

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>24

accctcctat gtgcacccaa gatcccaagg cggggcagtt actctcagag ctatttacaa 60

accgaaagga                                                        70

<210>25

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>25

catgtgtgtt tagtatctga atttgaaact catctggtgg aaaccaagtt tcaggggaca 60

tgagttttcc                                                        70

<210>26

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>26

tccacaaggt gcgtggaaag agctggacag aaattatctc aactacggtg aggaaggagc 60

cccagggaa                                                         69

<210>27

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>27

ctctcctcgt ctaggtttct ttacctccag ggatcagctg tgtgtgtgtg acctccctac 60

cgggctatc                                                         69

<210>28

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>28

ttaacaattc ttttccctgt gcttcttatg taagaatcct cctgtggcct ctgcttgtac 60

agaactggg                                                         69

<210>29

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>29

aatgccaaac tagttggcca gtctattatt gcttatctcc agaagaaggg ctatcctgaa 60

gtggcactgc                                                        70

<210>30

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>30

tgctacgcag ccatgtttgg gcctaaaggc tttgggcggg gcggagccga gagccacact 60

ttcaagtaa                                                         69

<210>31

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>31

gcccctcgtg ctaccaacac ttaccctgtg tttaaaaaga tcttgtacca agccaacggc 60

gttcctggc                                                         69

<210>32

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>32

tcatcctggg cctgttcggc ctcctgctgt tgctcacctg cctctgtgga actgcctggc 60

tctgttgcag                                                        70

<210>33

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>33

acctgctcca cctccagccc tggcgtgtac gcccgtgtca ccaagctcat accttgggtg 60

cagaagatcc                                                        70

<210>34

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>34

tcatgctgct ttctgcgatg tgcgtgtctg ttagaatagg ctctctaccc agctagaaca 60

ccttccagac                                                        70

<210>35

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>35

gcgatggagc agtctcctgc cctctcccct gtcctgatgg cactctgttg tattttctta 60

ctgaagttca                                                        70

<210>36

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>36

cactggtgat gttctcggtc gagtctatgc tgtcttgtca aagagagaag gtcgggtact 60

tcaagaaga                                                         69

<210>37

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>37

catgatgacg atcttttgtc ttcttctgaa gaggagtgca aggataggga acgccccatg 60

tacggccgg                                                         69

<210>38

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>38

ccatcgacaa ggctggctac acggaaaaga tcgttattgg catggatgtt gctgcctcag 60

agttttatcg                                                        70

<210>39

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>39

aaccaactca tgaggatcga ggaggctctt ggggacaagg caatctttgc tggacgcaag 60

ttccgtaac                                                         69

<210>40

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>40

ctttttgctg ccataaatgc ctcatgtgtg gtctggaagt gctgtgagga tgggacactg 60

gagttgact                                                         69

<210>41

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>41

cctcagagag agccaaaaat acagaagagg cggagagcgc ccctccaacc aggctgttat 60

tcccctgga                                                         69

<210>42

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>42

ccttaagagc tacagctaga gaaaccttca cggggtggag agaggattct aaggcttttc 60

tagcgtgac                                                         69

<210>43

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>43

ggcggcggtt cctgtttccg tttcttcctc tccgttcggt cgggagtagc atcctccact 60

cagccaccct                                                        70

<210>44

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>44

gcgcggcgct ttcctccgcc cggggtgggg cccctacaga ctccgtattt tattttttta 60

aataaaaaa                                                         69

<210>45

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>45

ccaattcagg atattgccct gccatccatg aaaactgttc tggcaccaaa agtaatgaca 60

aatgttaag                                                         69

<210>46

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>46

atggtgtgcc aaagacagtt tccagaaaat ccggaggcag cacttagact tgggttatct 60

tcccttgact                                                        70

<210>47

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>47

aggagcacta cggcgggact gccaccttct acctctctca agcagccgat ggagccaagg 60

tgctgtgct                                                         69

<210>48

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>48

gacgaactgg ctacagtacc atgcctctca gcccgtgtgt ataatatgaa gaccaaatga 60

tagaactgt                                                         69

<210>49

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>49

agtgctgcct cctgaccacg ctgttggacg gactaaatac gtccaccaag aactgttaaa 60

ccacaaaaat                                                        70

<210>50

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>50

aacagatcgc tctgaaatta gcctactgcc ttcagacatt gacaggtata agaagagatt 60

tcataagtt                                                         69

<210>51

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>51

gaccctccag ggtactaatg gggctctgtt ctgagatgga caaattcagt gttggaaata 60

catgttgta                                                         69

<210>52

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>52

ggaacgattc caagttacga agctctgtcc attccaagaa aagattcgga gacagtattt 60

aagcacaaat                                                        70

<210>53

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>53

tccagctcag cttctctact ctgggcaagg attactctgt ggaaggtatg agtgattctc 60

tgttgaacttv                                                       70

<210>54

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>54

accatcgcta acgacgactg tgagctgtgt gtgaacgttg cgtgtaccgg ctgcctctga 60

gatagccct                                                         69

<210>55

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>55

agagctctgg gatacctgca acatcggagt gccgtggtac gaccgcgagg ccaacgacgc 60

tgtcctcttt                                                        70

<210>56

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>56

ggtctaaata aatggagaga tgcgagttgg aaagctcgat aatactgtta agatggcagt 60

tctccccca                                                         69

<210>57

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>57

ctgctcagta ccaacaccag tttgccaccc aatcctacat tgggtcttcc cgaggctcaa 60

caatttacac                                                        70

<210>58

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>58

agaaggcaat acaaactgtt accgagctcc tatggagtgt caagaatcat ggaagtaaac 60

atctgagaa                                                         69

<210>59

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>59

agagtacccc agtcgcccca ctgagtttgc cttctatccg ggatatccgg gaacctacca 60

cgctatggc                                                         69

<210>60

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>60

agcatcttct gtttcctggt gagtgattcc tgctactttg gatggccatg acgggctgga 60

gctgccttgt                                                        70

<210>61

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>61

ctgtccaatc aggtaggctg ggcctgaact agccaatcag atcaactctg tcttgggcgt 60

ttgaactca                                                         69

<210>62

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>62

tgcattgcct gcggtcaagg ccagcaaggt ggagtggatg cctcagaacg gacgagataa 60

tgtgaacta                                                         69

<210>63

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>63

ctgccacacc agtcacatga cctgatcact agcctgtcat ccttggtctt tgtatcttcc 60

atatttggaa                                                        70

<210>64

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>64

gagatgtatg attcaaacat agatgactgg attcctgttc cagaattgag aactaaccgt 60

tgtaatgcag                                                        70

<210>65

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>65

gcacttgaaa gagtccccat gcacttggag tccatgagcc aatgggatat gcaaagacgc 60

ttaaacatt                                                         69

<210>66

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>66

aggtctgagt tgttacccca agcgccctgg cccccacatg gtgatgttga catcactggc 60

atggtggttg                                                        70

<210>67

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>67

tttgtcctgg atgacctccg ccgctattct gtggacctac gctacacagt ctttcagacc 60

acaggctccg                                                        70

<210>68

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>68

aaaagcaagt acaagatcct ggatgccacg gatcaggaaa gcctggagct gaagccaacc 60

tcccgagcag                                                        70

<210>69

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>69

gttctgcatt aacccctgcc tcatgtctgt aacatgtgac agtaattcca gctcggtccc 60

tccaggcaa                                                         69

<210>70

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>70

cgggggtggg agggccattt tgtcactttg cctcagttga gcatctagga agtattaaaa 60

ctgtgaagc                                                         69

<210>71

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>71

gcataatagt tgatgccaaa ggagatggtg acgtcccttc cactgtagtt gctgtcacaa 60

ccttgacgt                                                         69

<210>72

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>72

tctggtagaa aggcctaacc cattacacca gaagaccatg ggtgaagtct agatggggag 60

gagaagtgag                                                        70

<210>73

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapians)

<400>73

ctcagaggct atagctggga acccgactgt gaaagtatgt gatatctgaa cacatactag 60

aaagctctg                                                         69

<210>74

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>74

aagggctata ccagtgactt gaactatgat tcagaacctg tgcccccacc tcccacaccc 60

cgaagccaa                                                         69

<210>75

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>75

tgccagagct ctcctacaga gatgtggtgc aattgctgaa caaaccccga ttttgttgtt 60

gttcctcct                                                         69

<210>76

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>76

cctgggtctg acccgagatc taatctctgt gctctgtgta ttggcgacga gcagggtgag 60

aataagtgc                                                         69

<210>77

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>77

ctttctggat cccacagtgt atgggagccc ctgactcctc acgtgcctga tctgtgccct 60

tggtcccag                                                         69

<210>78

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>78

gagcctccaa ctgctctttc aacggaccag ggcctggtgc agtggctaca ggaactgaat 60

gtggattca                                                         69

<210>79

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>79

ctgtggcagg ccattcccag cgtccccgac tgtgaccact tgctcagtgt gcctctcacc 60

tgcctcagtt                                                        70

<210>80

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>80

actctttact gggttaccag gttcatacat tgctgaggac ctgacaggac aacctagggg 60

cagggctggg                                                        70

<210>81

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>81

tcgacgccat cgcggagatt gggaaccagc tgtatttgtt caaggatggg aagtactggc 60

gattctctg                                                         69

<210>82

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>82

caggcaatat tggaaggtaa tttcacctga gtctcaggga accacgaagg gatatggcaa 60

tgagtagagc                                                        70

<210>83

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>83

cccaaattct ccttatccac cattcacata cgactgacgg ccaaaggatt gcttcgaaac 60

cttcgacttc                                                        70

<210>84

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>84

cccggaggcg gtgggcctgg ttaaataagg cagggtttat atgcactttc ttccgatctg 60

tacctgagag                                                        70

<210>85

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>85

agtatatctt gaagcagcag caggaggagg ctgagaagcc tttacaggtg gccgctgtag 60

acagcagtgt                                                        70

<210>86

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>86

ccgctgtctc tggaagtaaa agagccttgt ctgaccttaa tgcaagcagt ctgtttgaac 60

ccctgtaggc                                                        70

<210>87

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>87

cgagaagagc atcagtgatg tcacgtttgg agcaggggtc agttacatcg ggacaccacg 60

gactccgtc                                                         69

<210>88

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>88

atgccttccg gctgagtcct gctccttcca aaacacttat ggacaactat gaggtctctg 60

ggggtacag                                                         69

<210>89

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>89

agtacagtct gtcagccaga ataaaagcta cttggccgta aggctaaaag accaagatct 60

gagagattc                                                         69

<210>90

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>90

agccatgatt agacgttgac tgcatctccc tgatagacca atcagctgtg tcgcacttaa 60

actggagaag                                                        70

<210>91

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>91

aggattatat tcaaaagttc gatctcgata tagtttcata caggctcttg tcagacgtat 60

ccgtggcctc                                                        70

<210>92

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>92

acgtttagca tctggtgaaa ttacacagga tgacttcctt gttgttgtgc atcaaattcg 60

acagctattt                                                        70

<210>93

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>93

caaagccatt tttgagaaca cgctgagcac ctacccaaag cgcacagatg tctggtcggt 60

ctatatcga                                                         69

<210>94

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>94

gctctgtcaa cagactcaat agaaagactc ccagtgtata acaaagctgc ctggaagcat 60

tacaacacca                                                        70

<210>95

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>95

tgaatttagc ctctgaaccc caggaggtcc tgcacatagg aagcgcccac aaccgaagtg 60

ccatgccct                                                         69

<210>96

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>96

tgatttcaaa gggatgtcct cagtgtctga catctttcac tacaagtatt tctaacagtt 60

gcaaggaca                                                         69

<210>97

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>97

acactgcccc accccgagaa ccctcagctc tcaaaggtca ctcctgggag tttcttcttc 60

ccaatggaa                                                         69

<210>98

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>98

ctgcttcggt gtgattcttg gagcaaatac ccggccagac ttggatctcc gagaccccat 60

ctgtgatga                                                         69

<210>99

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>99

ttctagtgtt tttgccgaag attaccgctg gcctactgtg aagggagatg acctgtgatt 60

agactgggcg                                                        70

<210>100

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>100

acattttgcc aaaaagggcc actgtcgata tgaggacctc tgtgccttct accatccagg 60

cgtcaatgga                                                        70

<210>101

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>101

tgtagcacga ataggggtgt ggttcatggc gtgttgaccc agcagagcac tccctcccac 60

taacttgtt                                                         69

<210>102

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>102

tctgtcctgg ctctgcacct ggtatatggg tcatggacca gatggggctt tccctttgta 60

gccatccaa                                                         69

<210>103

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>103

ggcagaaata gtgaagtacc cggaagaaga aaatcaacat accacctcta ctcagagtag 60

aatctgttca                                                        70

<210>104

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>104

cccatccaca gttgtcagtt gtgaagaggg gccagatgac accctaaagc aggctgatcg 60

ggcaatggga                                                        70

<210>105

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>105

ggaccaggaa gcatcaccca ggagatttgg cgcccacttc cacctcttct ctcagttttg 60

gacaagtga                                                         69

<210>106

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>106

attaagccct aaggtcctaa ggcatctatc tgtgctaggt taaatggttg gcccccaaag 60

atagacagg                                                         69

<210>107

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>107

gaatgcagtg tactgttgtg gagtcttccc gctatctagt tccaaaattt catcacccca 60

aatggaaatc                                                        70

<210>108

<211>69

<212>DNA    

<213>人(H.sapiens)

<400>108

cagaaagtat taaggcttta ggtagatgca actggcgaac cttggagagg gaatgctgat 60

tgtcttgac                                                         69

<210>109

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>109

gaagctgttc ggcctccttt ctagcccgct ttccagcctc gcaaggttct tctctcacct 60

tctccggcga                                                        70

<210>110

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>110

ggaggagttg ctgtgggcac ttgtgcggat atggcaattc acccatttgg ttctatgatt 60

attgggagca                                                        70

<210>111

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>111

ttgtctccag ctctgcatat gtctggccag ggggcttcta ggaagtaggt ttcatctatc 60

aaatgtctc                                                         69

<210>112

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>112

actctggagt tgaggtgcga gttacaccaa ccaggacaga aatcattatc ttagccacca 60

gaacacaga                                                         69

<210>113

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>113

aaagagcgga ccttctcctt ctgtggcacc atcgagtaca tggcccccga aatcatccgt 60

agcaagacgg                                                        70

<210>114

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>114

agggaggaat accgaggctt cacacaggac ttcaaggaga aggacggcta caaacccgac 60

gttaagatc                                                         69

<210>115

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>115

tcattctgct ctctcttggc acccgaccct tggcagcatg taccacacag ccaagctgag 60

actgtggcaa                                                        70

<210>116

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>116

tttctttcaa taaaagtggc ggtggtggag acatccacca gggcttccag tctcttctca 60

ccgaagtgaa                                                        70

<210>117

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>117

aatgtgttaa gagactgaaa ataccagcca tcagaaactg gcctttctgc caataaagtt 60

gcatggtaaa                                                        70

<210>118

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>118

gatgcctcac tactagatgc agtgctggga ccttcctctt ttggagctgt cccatgtaca 60

gtggaccca                                                         69

<210>119

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>119

ccagtgttac gttttcacat tgtctgtctc ccaccctcac tgatcacgcc tgccccagag 60

cagtgtgtg                                                         69

<210>120

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>120

gctccggatt taagccattt aagggtggac ctccgcgacg attctgaaaa tgagctctct 60

gccaaggtt                                                         69

<210>121

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>121

tggagatctt tgctaaagtt gaacaatccc ggtactgtac catatcagtc ctttgtgggt 60

agtaggtag                                                         69

<210>122

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>122

tgtgctatag attttgagat ctccggagat tttgctagtg gcgattttca tgaatggact 60

gatgatgag                                                         69

<210>123

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>123

tgatagtgtg gtttatggac tgaggtcaaa atctaagaag tttcgcagac ctgacatcca 60

gtaccctga                                                         69

<210>124

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>124

gacagtcgac agggaccgcc ctcttgtcag gacaactgcc tgctgctagg gtctgttgcc 60

aaggtcaac                                                         69

<210>125

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>125

ggccctcctg cctctgtcat ggcctcatca gtttcctggg gttcttgctg ctgttggtca 60

ccttccccat                                                        70

<210>126

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>126

gggtgggctg ggctgaggcc attgccgcca ctatctgtgt aataaaatcc gtgagcacga 60

ggtgggacgt                                                        70

<210>127

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>127

tagtatcttg agattcacct ggtctggaat tatgtcatag gctactatgc atcagaatca 60

catggaggg                                                         69

<210>128

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>128

ttttcaaaac gaactgactc agttcagcag accaccagta ccagactcag aattgtgata 60

gaggagcat                                                         69

<210>129

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>129

gtgcaatgct ggcctgtggt ggtctgtgta atgctttaac ttgtatggag gaggccaggc 60

tcagagctg                                                         69

<210>130

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>130

agaatttgga gggctaaaca actgggactc tggagagtct gtgtcctaat aatgcctgct 60

ttggagcact                                                        70

<210>131

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>131

ctgcactgtt tctctctgca gacctagggg aaaactgcag gtggaagtgc ttttctacta 60

aggcctctt                                                         69

<210>132

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>132

agctgctggt ggatcagata tacgagaacg ccatgattgc tgctggactt gttgacgacc 60

ctagggcca                                                         69

<210>133

<211>60

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>133

atccaattct cacacacctg tgagaccccc aagtacttct agtactggca gtcgaggcag 60

<210>134

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>134

gggcatgtgt ttcatcggga agaggaattt tgaacatttc cttcttcagt atctgcagcc 60

tcgacctgg                                                         69

<210>135

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>135

agatctgggc gattctgagc catgccattt ttaccttatg tctgctagaa agtgttgtag 60

ttgattgacc                                                        70

<210>136

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>136

actgacgtag cactggaatt cccaagaccc actctgccta atgttgttta tgtaggagga 60

atcctaacc                                                         69

<210>137

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>137

cacgaggatt cctgtggcat caggtgctgc tgtacctggt gtaggagcct aatcattgaa 60

ccattgtgt                                                         69

<210>138

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>138

catcgatata caaaactctc ttaccgggta gtttttcctt tagaacttcg tctgtttaac 60

acttcaggtg                                                        70

<210>139

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>139

ttatgcctgc aattaggcat tggtcagggg tgaatggctc ttttcacaga gagtagccaa 60

ccagagacc                                                         69

<210>140

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>140

tgaatgtacc cctcagcctt ctcagcattt ccttatccca agactagtgt gctttctgct 60

acactgcta                                                         69

<210>141

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>141

ccttagactg ccaggcacag agtcgggtcg ggatttgtca gccaagcctc ggctccagct 60

ccgcaatctc                                                        70

<210>142

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>142

ttctgtttac gtaacctgct tagtattgac actctctacc aagagggtct tcctaagaag 60

agtgctgtc                                                         69

<210>143

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>143

ctcctctctg gtgggtggtg gcatttaagg ttcaaaccag ccagaagtgc tggtgctgtt 60

taaaaagtc                                                         69

<210>144

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>144

gctcccaacc tggagcctcc actcccagaa gaggaaaagg agggcagcga cctgagacca 60

gtggtcatcg                                                        70

<210>145

<211>70

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>145

tattatccta tgtgggagca caggaaagag ccctggacca tagaaagcca agtacgagta 60

gcaagaaaac                                                        70

<210>146

<211>69

<212>DNA

<213>人(H.sapiens)

<400>146

gggagcgcgt gcagggaggg gcttgatctc cacattttct caggagtagt tcgggcatcc 60

ccatatctt                                                         69