分别作用于hTERT和ATP6L的RNA干扰对肝癌细胞生长和转移的抑制作用

摘要

肿瘤细胞的两大特征是无限增殖和侵袭转移。端粒酶异常活跃是细胞永生化的重要原因，因此成为抑瘤靶点。肿瘤细胞的侵袭转移与细胞外基质的分解密切相关。侵袭性实体瘤细胞周围较正常细胞有较低的pH，这主要与肿瘤细胞膜上氢泵V-ATPase活性通常增高、促氢离子外排有关。酸性条件有利于蛋白水解酶激活和消化细胞外基质，从而利于细胞侵袭。本文用基于DNA质粒的RNAi干扰技术分别抑制高转移潜能的肝癌细胞株HCCLM3端粒酶亚基hTERT和V-ATPase的ATP6L亚基表达，以达到抑制肝癌细胞的生长和转移的目的。
　　 构建针对hTERT靶基因的siRNA表达质粒载体，转染HCCLM3。HCCLM3转染siRNA表达质粒载体后western blot显示hTERT被抑制；用TRAP和ELISA方法检测转染细胞的端粒酶活性，结果显示端粒酶活性降低。MTT方法绘制的细胞生长曲线显示hTERT.被抑制的转染细胞增殖减慢。
　　 构建针对ATP6L靶基因的siRNA表达质粒载体，转染HCCLM3，经G418筛选的转染细胞命名为si-A-M3。northern blot结果显示si-A-M3的ATP6L被抑制～60％。用pH敏感荧光染料BCECF/BCECF-AM结合实时荧光分光光度计方法分析细胞培养液pH和细胞内pH(pHi)的变化以分析si-A-M3的泌氢功能，结果为：①sj-A-M3培养液培养12小时后pHi的变化显示细胞泌氢较对照组减少；②si-A-M3内pH在NH4Cl诱导酸化后，去除NH4+后恢复速度明显减慢，且不能恢复到静息pHi；③用细胞内缓冲能力校正测得si-A-M3 pHi酸化后去除NH4+的即时排氢量明显降低。上述结果提示转染细胞的V-ATPase功能被抑制。分解细胞外基质的的蛋白水解酶受pH调节。V-ATPase功能被抑制的同时MMP-2/9受到影响。western blot结果显示si-A-M3的MMP-2表达降低，用ELISA方法和酶谱测定细胞培养上清液中MMP-2/9活性以及用FITC-标记的gelatin原位显示移植瘤细胞周围MMP-2/9活性，均发现si-A-M3的MMP-2/9活性下调。体外培养si-A-M3的侵袭实验显示si-A-M3的侵袭力明显下降；在小鼠[BalB/c(nu+/nu+)]肝原位移植瘤模型中发现si-A-M3组肝内转移率和肺转移率明显降低，si-A-M3组肝原位生长的肿瘤体积明显小于对照组。综合上述结果，HCCLM3细胞的ATP6L被抑制后，细胞侵袭转移和生长受抑制，与细胞的V-ATPase功能被抑制及其MMP-2表达和MMP-2/9活性被抑制有关。
　　 本文证实hTERT是抑制肿瘤生长的有效标靶，同时首次报道ATP6L的RNA干扰对是肿瘤转移和生长具有明显抑制作用。本文的结果为研究肿瘤发生和转移机制以及抑制肿瘤的生长和转移的治疗方法提供了参考。

目录

文摘

英文文摘

第一部分 RNAi的发展与应用

主要词条及内容

1.引言

2.RNAi的发展

3.RNAi的机制

4.RNAi在肿瘤转移研究中的应用

5.RNAi在其它领域的应用及发展前景

6.RNAi技术在哺乳动物系统中的应用

7.RNAi的应用实例

8.参考文献

第二部分 hTERT RNAi对肝癌细胞端粒酶的抑

主要词条及内容

1.引言

2.材料和方法

3.结果

4.讨论

5.参考文献

第三部分 ATP6L对肝癌细胞转移和生长的抑制

主要词条及内容

1.引言

2.材料和方法

3.结果

4.讨论

5.参考文献

在读期间发表的主要论文目

发表的综述手稿

发表的代表论文手稿

致谢