2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1,3-噻唑-4-酮在制备抗脑癌药物中的应用

摘要

本发明公开了化合物2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮在制备抗脑癌药物中的应用。所述化合物在抑制脑癌细胞增殖和引起凋亡中具有明显作用，为新型抗脑癌药物开发提供了新的前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种噻唑烷酮衍生物在制备抗脑癌药物中的应用，尤其涉及一种2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮在制备抗脑癌药物中的应用。

背景技术

脑癌是癌症中比较难治的一种，脑癌中神经胶质瘤占有的比例较大，神经胶质瘤简称胶质瘤，发生在神经的外胚层，起源于神经间质细胞。各种胶质瘤中，以星形胶质瘤最常见，其次为胶质母细胞瘤等，以星形胶质瘤为代表的小脑胶质瘤多见于儿童患者，自出现发病症状至就诊时间平均两年，恶性瘤体生长快，病程短，5年生存率低于5％，具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特点。

目前治疗脑癌的方法主要包括外科切除、放射治疗以及药物化疗，这些疗法对病人的寿命延长不到15个月。临床上使用最多的药物是替莫唑胺(TMZ)，其体外IC₅₀值为100μM，以前药的形式口服给药在体内降解为活性形式，通过对DNA的烷化作用实现抗癌效果，临床试验显示替莫唑胺联合放射治疗可将病人生存时间延长至14个月，两年的生存率达26.5％。

噻唑烷酮类化合物是一类重要的杂环类化合物。以往人们对它的研究主要集中于2、4、5位含有羰基的噻唑烷酮类化合物，研究发现此类化合物具有抗菌抗感染抗病毒抗炎症等多种生物效应，其中以4-噻唑烷酮在抗肿瘤方面的研究较为广泛。早期的研究报道，4-噻唑环核心结构的化合物具有明显的选择性杀死耐药性癌细胞尤其是肺癌细胞，并诱导细胞凋亡，而对正常细胞无抑制损伤作用。然而，尽管已有研究结果表明噻唑烷酮有广谱抗癌性，但在治疗脑癌方面的药理作用研究和应用，经权威机构检索查新，目前国内外尚未见报至。

因此，研究和开发抗胶质瘤等抗脑癌的噻唑烷酮衍生物药物具有极其重要的意义。

发明内容

针对目前临床对脑癌治疗需求，本发明的目的在于提供一个新型噻唑烷酮衍生物即2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮在制备抗脑癌药物中的应用。

本发明利用计算化学、组合化学、癌症生物学和药物化学方法，合成了一类4-噻唑烷酮类化合物的衍生物，运用神经胶质瘤细胞作为主要筛选模型，将所述化合物对人体多形型胶质瘤U87MG细胞进行体外高通量筛选，得到了一个能够特异性诱导多形型胶质瘤细胞凋亡和自噬且能有效治疗常见性脑癌的噻唑烷酮化合物2-苯醚基亚氨基-5-(2羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮。

本发明所述噻唑烷酮类化合物2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮的化学结构如通式(I)所示：

本发明所述2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮在制备抗脑癌神经胶质瘤药物中的应用；其中，所述脑癌是神经胶质瘤。

上述化合物能有效抑制脑癌细胞生长，引起细胞凋亡的浓度优选是20μM。

本发明的2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮在抑制脑癌细胞增殖和引起凋亡中具有明显作用，为新型抗脑癌药物开发提供了新的前景。

为了更好的理解本发明的实质及本发明所述化合物的作用，下面结合2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮的药理实验及结果，来进一步阐述其在抑制脑肿瘤细胞生长、引起细胞凋亡中的作用。

神经胶质瘤细胞的制备：以常规方法培养神经胶质瘤细胞，收集生长状态良好的且处于对数期的细胞，备用。

采用细胞生物学和分子生物学方法进行如下实验，以观察2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮对脑癌细胞的凋亡影响。

1.倒置显微镜观察细胞形态，即凋亡小体的形成

收集对数期脑癌细胞和正常细胞，各加入2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮，处理24h、48h、72h和96h，显微镜下观察脑癌细胞形态学变化和凋亡小体的形成，结果发现2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮处理24h后的细胞较对照组细胞可以发现凋亡小体的形成及明显的形态学变化(见图1)。

2.Annexin-V染色法检测化合物作用脑癌细胞对细胞凋亡诱导情况

收集对数期脑癌细胞，加入2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮，作用12h、24h、48h、72h后进行Annexin-V染色，用流式细胞术分析Annexin-V荧光强度，结果发现2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮对脑癌细胞U87MG的作用有浓度和时间依赖性(见图2)。

3.WTS-1方法检测细胞脱氢酶的活性，进行剂量效应分析

将脑癌细胞接种于96孔板中，经不同浓度(100、50、20、10、5、1、0.1、0.01μM)的2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮处理24h和48h后，分别用WST-1方法检测琥珀酸脱氢酶的活性，计算存活率。存活率％＝(实验组OD值/对照组OD值)×100％(以不含细胞的培养液为空白组)，实验结果表明2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮作用于UM7MG细胞，有效抑制生长的浓度IC₅₀为18.59μM(R²＝0.9771)，实验组细胞存活率较对照组显著降低且呈剂量依赖性(见图3)。

4.TUNEL染色标记凋亡影响

收集对数期脑癌细胞，分别用10、20μM的2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮作用24小时后，在0℃下用1％多聚甲醛固定25min，然后经PBS洗脱后70％的乙醇-20℃环境下保存过夜，再用PBS洗脱5min，加入5μlTdr孵育液，37℃孵育1h，SCC终止反应，用流式细胞术检测标记凋亡细胞，对下述三组细胞计数分析，分别计算其阳性率(图4)。

正常组细胞：7.38±1.29％

10μM组细胞：6.24±1.08％

20μM组细胞：3.27±0.42％

结果显示：2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮可引起细胞凋亡。

5.GFP-LC3方法检测细胞生长情况，以判断化合物对自噬的影响

将处于对数生长期的GFP标记U87MG细胞接种于96孔板中，经20μM的2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮作用48h后，用激光共聚焦显微镜观察GFP蛋白的变化，发现2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮作用细胞48h，较对照组荧光变为点状，说明自噬的发生(图5)。

上述实验数据经统计学处理，

实验数据以平均值±标准误差表示，经t检验，P＜0.05，表示有明显性差异。

通过上述实验及其结果，可以得到以下结论：

本发明所述的化合物2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮能选择性地杀死U87MG脑癌细胞，同时引起细胞凋亡和自噬，剂量效应关系研究，结果发现其具有明显的剂量依赖性，IC₅₀约为20μM，这与现在临床治疗脑癌的一线药物相比较，抗癌活性较强。实验结果预示2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮有望成为选择性诱导脑癌肿瘤细胞凋亡和自噬以及有效治疗顽固性脑癌的有潜力的抗癌药，具有很大的开发应用前景。

附图说明

图1本发明所述2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮作用细胞后在不同的时间诱导U87MG细胞形态变化情况(×200)。

其中：显示的细胞为U87MG细胞，药物化合物为2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮(横坐标表示作用时间，纵坐标表示不同浓度的2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮实验组)。

图2Annexin-V染色法检测2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮(compound 4)作用U87MG细胞引起的荧光相对变化情况。

横轴左至右顺序依次为：对照组、10μM12h，10μM24h，10μM48h，10μM72h，20μM12h，20μM24h，20μM48h，20μM72h。

图3WST-1检测活性化合物2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮作用于U87MG细胞的剂量效应分析。

图4TUNEL染色检测化合物2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮诱导细胞凋亡。

其中：

(a)TUNEL染色流式细胞术分析细胞凋亡阳性率；

(b)TUNEL染色后流式细胞术分析对照组细胞周期情况；

(c)化合物2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮(4#化合物)作用24h，TUNEL染色后流式细胞术分析细胞周期情况(4#化合物引起细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G₂/M期)。

图5GFP-LC3方法分析噻唑烷酮化合物诱导细胞发生自吞。

(a)电镜观察下细胞内出现自噬；

(b)化合物2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮(4#化合物)20μM作用U87MG-GFP-LC3细胞24小时。

具体实施方式

合成化合物表征使用的仪器：红外光谱，Nicolet380FTIR；LC/MS，Waters2795(Waters2996PDA监测器/MicromassZQ质量检测器，C₁₈柱，2.0μm×50mm)；NMR谱：Bruker400MHzNMR光谱仪(溶剂MeOD)；计算分子特性：TSAR软件Accelrys(SanDiego，CA)以及PipelinePilotSciTegic(SanDiego，CA)。

实施例1

2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮的制备

按HCl∶H₂O(1∶4)的比例配成盐酸溶液。称取11.4g(150mmol)硫氰酸铵溶于50ml盐酸溶液中，加入10.5ml(100mmol)4-苯氧基苯胺，搅拌条件下加热到85℃，混合物变澄清，反应12小时候后，TLC监测反应，反应结束后，将混合物冷却到室温，有黏稠的油状液体出现，用乙酸乙酯萃取，萃取液用10％盐酸溶液，氯化钠饱和溶液，水依次洗涤，萃取液减压蒸除溶剂，得到4-苯氧基苯硫脲。

将4-苯氧基苯硫脲1110mg(6.0mmol)，无水乙酸钠2479mg(30mmol)，加入到20ml乙醇中，搅拌条件下，加入氯代乙酸乙酯1.28ml(12mmol)，然后在60℃下加热6个小时，TLC检测反应，反应结束后冷却到室温，出现沉淀。将反应液过滤，固体用乙醇洗涤，得到部分粗产物，滤液减压蒸馏，然后用乙酸乙酯和水萃取，有机相合并得到更多的粗产物。粗产物在乙酸乙酯中重结晶，得到产物2-苯醚基亚氨基-1，3-噻唑-4-酮。

称取2-(4-苯氧基-苯基亚胺基)-1，3-噻唑-4-酮142.5mg(0.5mmol)溶于3ml乙醇中，加入邻羟基苯甲醛73.2mg(0.6mmol)，哌啶100μL，在平行合成仪上，60℃恒温振荡，反应24小时。反应通过TLC监测，反应完毕后冷却到室温，在反应过程中有大量沉淀生成，经过分析表征，沉淀即为产物2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮。过滤，用乙酸乙酯，乙醇，石油醚依次进行洗涤，若没有沉淀生成，将溶剂蒸干，按1∶2配比加入乙醇(乙酸乙酯)或者石油醚，振荡，则大部分出现沉淀，过滤，滤渣用大量乙酸乙酯，乙醇，石油醚依次进行洗涤。仍旧没有沉淀产生的通过硅胶柱层析进行分离，展开液由不同比例的乙酸乙酯和石油醚组成。

产物为黄色粉末，收率86.5％；¹HNMR(400MHz，DMSO)：δ(ppm)＝12.21(s，1H)，10.38(s，1H)，7.95(d，J＝40.0，1H)，7.79(dJ＝8.4，1H)，7.41(dd，J＝7.2，4.2，2H)，7.27(dt，J＝17.8，8.8，1H)，7.15(t，J＝7.5，1H)，7.12-7.00(m，5H)，7.00-6.84(m，2H)；ESI-MS：m/z389.1(M+1)。

实施例2

选择性抗癌活性分析

以常规方法采用两种细胞系(人体脑胶质瘤细胞U87MG，形态与人体正常细胞相似的HegG2细胞)对本发明合成的化合物进行抗癌活性筛选。

在37℃含5％CO₂的环境下，用DMEM培养基培养U87MG细胞，1640培养基培养HepG2细胞，收集对数期的U87MG和HepG2细胞，接种于96孔板中(2×10⁴个/孔)，孵育24h后加经不同浓度(100、50、20、10、5、1、0.1、0.01μM)的本发明化合物，作用24h后，每孔加入10μlWST-1，后继续孵育2h，通过酶联免疫法检测其吸光度的方法来检测细胞存活率，进行剂量效应关系研究，经SigmaPlot软件分析2-苯醚基亚氨基-5-(2羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮对脑癌细胞的半致死剂量(IC₅₀)值低于20μM，对HepG2则要高于100μM。

实施例3

2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮影响细胞增殖和细胞形态的时间效应关系

收集对数期的U87MG和HepG2细胞，接种于96孔板中，37℃含5％CO₂的环境下孵育24h后，以0、10、20μM的不同浓度加入本发明所述化合物2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮，分别在作用24h、72h和96h后观察化合物对U87MG细胞增殖和形态的影响(结果见图1)。结果看到作用时间越长，化合物对细胞的作用越强，2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮对U87MG的作用具有时间依赖性。

实施例4

2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮对脑癌细胞的凋亡诱导

抗癌药通常通过两导肿瘤细胞凋亡来发挥其作用。为了初步评价噻唑烷酮类化合物诱导肿瘤细胞凋亡的能力，用Annexin-V染色法和流式细胞术分析噻唑烷酮化合物作用于细胞后对细胞的凋亡两导情况。

将以浓度10μM、20μM化合物2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮与U87MG细胞37℃/5％CO₂的环境下共孵育，在12、24、48、72h分别取1ml细胞，1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，加入1ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，重复加入PBS、离心两次。再用胰酶消化，再用PBS洗涤，细胞重悬于200ul Binding Buffer，加入10ul Annexin V-FITC，轻轻混匀，避光室温反应15分钟。加入300ul Binding Buffer，在1小时内取样，用荧光染料Annexin-V染色，流式细胞术分析荧光强度，结果显示2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮对U87MG细胞作用有时间和浓度的依赖性(结果见图2)。

实施例5

TUNEL染色检测细胞凋亡

TUNEL染色用来检测和评价细胞的凋亡的程度，这种分析方法用末端转移酶标记DNA末端，通过流式细胞术检测凋亡情况下代表性的DNA片段，来分析凋亡的状况。

收集对数期脑癌细胞，10μM、20μM的2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮在37℃含5％CO₂的环境下作用24h，离心收集细胞，弃上清，在0℃下用1％多聚甲醛固定25min，然后经PBS洗脱，预冷的70％乙醇-4℃固定过夜，离心收集细胞，PBS洗脱5min，后，加入5μlTdr孵育液，37℃孵育1h，SCC终止反应，用流式细胞术检测标记凋亡细胞，结果显示，10、20μM的化合物作用细胞24h后，凋亡率分别为7.38±1.29％和6.24±1.08％，而正常对照细胞仅为3.27±0.42％(结果见图3)。

实施例6

2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮诱导肺癌细胞阻滞在G2/M期

取对数生长期的细胞，按1X10⁶/ml以1ml体积接种于6孔板内，5μM2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮U87MG细胞在37℃含5％CO₂的环境下作用12、24、48、96h，离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次，加入预冷70％乙醇，于4℃固定过夜，离心收集细胞，以1ml的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/ml溴化乙锭(PI)，100ug/ml RNase A，0.2％Triton X-100，4℃避光孵育30分钟。以标准程序用流式细胞仪检测，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

结果表明：化合物2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮能诱导脑癌细胞阻滞在G2/M期(结果见图4)。

实施例7

噻唑烷酮类化合物引起细胞自噬

将U87MG细胞用LZRS-GFP-LC3B-IRES-ZEO逆转录病毒进行转染，得到携带绿色荧光的U87-GFP-LC3细胞，将此细胞与2-苯醚基亚氨基-5-(2-羟基-苯甲基)-1，3-噻唑-4-酮在37℃含5％CO₂的条件下作用72h时后，用共聚焦显微镜观察分析，与对照组相比，实验组的细胞绿色荧光变为点状(结果见图5)。