从金钗石斛中提取纯化石斛碱的方法

摘要

本发明主要涉及一种从金钗石斛中提取纯化石斛碱的方法，该方法先用酸性乙醇提取，然后将提取物通过阳离子交换树脂富集纯化，再用有机溶剂萃取，最后采用HPLC分离制备；通过本发明方法可得到石斛碱含量不低于90％的稳定提取物，并且将提取物进一步经HPLC制备，可得到纯度≥95％的石斛碱；与以往的工艺相比，本发明的方法具有选择性高，反应条件温和，工艺简单，生产周期短，石斛碱收率和纯度高的特点；采用HPLC进行分离制备，可减少石斛碱的损失，并可获得结构类似的相关物质，具有较强的实用价值，为开发利用金钗石斛植物资源提供了新的途径。

说明书

技术领域

本发明属于中药提取物的制备，主要涉及一种从金钗石斛中提取纯化石斛碱的方法。

技术背景

石斛具有抗衰老、抗肿瘤、降低血糖，治疗胃肠道疾病和治疗白内障的作用，石斛的药用成分主要是石斛碱及多糖类物质，对11种石斛的总生物碱进行含量测定，发现凡性状鉴别时具苦味的生物碱含量较高，其中金钗石斛总生物碱含量达0.41％～0.64％，远较其他种石斛高，其中主要为石斛碱、石斛次碱、6-羟基石斛等。其主要成分石斛碱则具有止痛、解热作用，可降低心率、血压，减慢呼吸，使血糖中度升高，具有强壮作用并可解巴比妥中毒。

石斛碱，1932年首次从中药材金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl)中分离得到，其化学结构式为C16H25NO2，分子量为263，熔点134-136℃，易溶于乙醚、氯仿，难溶于乙醇、水。目前，石斛碱的提取主要是按照文献(T.Okamoto，etal.The structure ofdendrobine.Chem.Pharm.Bull.1964，12(4)：506-512；Y.Inubushi，et a1.Isolution andCharacterization of Alkaloids of the Chinese Drug“Chi-shi-hu”.Chem.Pharm.Bull.1964，12(10)：1175-1180)中的方法进行，但该方法得到的石斛碱质量不够稳定，含的杂质较多，回收率低，不适合于工业化生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种从金钗石斛中提取纯化得到质量稳定的高纯度石斛碱的方法。通过本发明方法可得到石斛碱含量不低于80％的稳定提取物，并且将提取物进一步经HPLC制备，可得到纯度≥95％的石斛碱。与以往的工艺相比，本发明的方法具有选择性高，反应条件温和，工艺简单，生产周期短，石斛碱收率和纯度高的特点，具有较强的实用价值，为开发利用金钗石斛植物资源提供了新的途径。

本发明是这样构成的：从金钗石斛中提取纯化石斛碱的方法由下列步骤实现：

(1)提取：金钗石斛茎粗粉加入酸性有机溶剂提取；

(2)过柱：将步骤(1)所得提取液用离子交换树脂进行吸附和洗脱；

(3)萃取：将步骤(2)所得洗脱液调节pH，先后用氯仿和乙醚萃取，得石斛碱粗提物；

(4)HPLC制备：将石斛碱粗提物进行HPLC分离制备。

具体方法是由下列步骤实现的：

(1)提取：金钗石斛茎粗粉按W/V＝1∶3～15的料液比加入酸性有机溶剂，加热提取1～5次，每次1～6小时，过滤，弃滤渣；

(2)过柱：将步骤(1)所得提取液浓缩成浸膏，用酸水溶解，通过经预处理的阳离子交换树脂，洗脱至无生物碱反应为止；

(3)萃取：将步骤(2)所得洗脱液浓缩至无醇味为止，加碱调节pH，用等体积氯仿萃取，萃取液浓缩成浸膏后，用酸水复溶，调节pH，再用乙醚萃取，浓缩干燥后得石斛碱粗提物；

(4)HPLC制备：将石斛碱粗提物溶解后进行HPLC分离制备。

更加确定的方法是由下列步骤实现：

(1)提取：金钗石斛茎粗粉按W/V＝1∶8～12的料液比加入酸性有机溶剂，于微沸状态下提取3次，每次2～4小时，过滤，弃滤渣；

(2)过柱：将步骤(1)所得提取液浓缩成浸膏，用酸水溶解，过经过预处理的阳离子交换树脂，先用蒸馏水洗脱水溶性杂质，再用碱性乙醇洗脱，至无生物碱反应为止；

(3)萃取：将步骤(2)所得碱性乙醇洗脱液浓缩至无醇味为止，加碱调节pH，用等体积氯仿萃取3-4次；浓缩萃取液，冷冻干燥可得金钗石斛生物总碱；将所得金钗石斛生物总碱用酸水复溶后，加碱调节pH，用等体积乙醚萃取至乙醚无色为止，浓缩、冷冻干燥可得石斛碱含量不低于80％的提取物；

(4)HPLC制备：将石斛碱粗提物用3倍量甲醇溶解，然后进行HPLC分离制备可得石斛碱含量不低于95％的提取物。

在本方法的步骤(1)中金钗石斛茎粗粉与酸性有机溶剂料液比为W/V＝1∶10；酸为盐酸、硫酸，有机溶剂为乙醇，pH为4；提取时间为2小时。

步骤(2)中酸水pH为4，酸为盐酸、硫酸；阳离子交换树脂为731型强酸性阳离子交换树脂；碱为氨水，调碱性乙醇pH＝10，乙醇浓度为80％。

步骤(3)碱为氨水，调pH至10；酸为盐酸、硫酸，调pH至4。

步骤(4)制备条件为，柱填料为C₁₈ODS柱，检测波长为223nm，流动相为甲醇∶水＝80∶20；柱温为35℃，流速为1ml/min，收集保留时间2.4±0.1分钟组分。

挥干流动相后即得含量≥95％的石斛碱。

与现有技术相比本发明方法具有以下特点：

(1)由于金钗石斛中生物碱为弱碱，用酸性乙醇浸提，这时不论生物碱是以盐的形式存在或以碱的形式存在，一般都可以被浸出。而且由于稀醇能浸透植物组织内部，故提取效率较高。

(2)提取物采用HPLC分离前，先用阳离子交换树脂预处理，可除掉大部分杂质，避免干扰，使上样量得到很大提高，并减少对色谱柱的污染。

(3)与传统方法相比较，HPLC制备大大简化物质的分离纯化步骤，快速、高效，适合工业化生产中定性定量分析。

本发明所得的稳定提取物石斛碱(纯度≥95％)可以作为提取和其他制剂含量测定的对照品。

申请人进行了一系列实验，对提取方法进行了研究。经过检验，本发明方法提取率高，工业大生产切实可行。

实验例：纯度检查

高效液相色谱参数：色谱柱：C₁₈ODS柱；流动相：甲醇∶水＝70∶30(图1、图2)，甲醇∶水＝90∶10(图3)；温度：35℃；流速：1ml/min；检测波长：223nm。

采用高效液相色谱法，以面积归一化法计算，本发明方法可得到石斛碱含量不低于80％的稳定提取物，并且将提取物进一步经HPLC制备，可得到纯度≥95％的石斛碱。

附图说明

图1为分离所得石斛碱的纯度检查图谱；

图2为石斛碱粗提物高效液相纯度检查图谱；

图3为HPLC分离所得石斛碱纯度检查图谱；

图4为制备石斛碱的工艺流程图。

具体实施方式

本发明的实施例1：

取金钗石斛茎，用药材干重10倍的pH＝3的酸性乙醇在微沸状态下提取2小时，浸提3次，提取液浓缩成浸膏，加氨水调节pH＝10，用等体积氯仿萃取3-4次，浓缩萃取液，冷冻干燥可得金钗石斛生物总碱，含量为68.4％。将所得金钗石斛生物总碱用pH＝4的酸水复溶后，加氨水调节pH＝10，用等体积乙醚萃取至乙醚无色为止，浓缩、冷冻干燥，即得石斛碱，石斛碱含量66.1％。

本发明的实施例2：

取金钗石斛茎，用药材干重10倍的pH＝3的酸性乙醇在微沸状态下提取2小时，浸提3次，提取液浓缩成浸膏，用pH＝4的酸水溶解，过经过预处理的阳离子交换树脂，先用蒸馏水洗脱水溶性杂质，再用70％碱性乙醇洗脱，洗脱液浓缩至无醇味，加氨水调节pH＝10，用等体积氯仿萃取3 4次，浓缩萃取液，冷冻干燥可得金钗石斛生物总碱，含量为81.0％。将所得金钗石斛生物总碱用pH＝4的酸水复溶后，加氨水调节pH＝10，用等体积乙醚萃取至乙醚无色为止，浓缩、冷冻干燥，即得石斛碱，石斛碱含量82.7％。

本发明的实施例3：

取金钗石斛茎，用药材干重10倍的pH＝3的酸性乙醇在微沸状态下提取2小时，浸提3次，提取液浓缩成浸膏，用pH＝4的酸水溶解，过经过预处理的阳离子交换树脂，先用蒸馏水洗脱水溶性杂质，再用70％碱性乙醇洗脱，洗脱液浓缩至不含乙醇为止，加氨水调节pH＝10，用等体积氯仿萃取3 4次，浓缩萃取液，冷冻干燥可得金钗石斛生物总碱，含量为85.3％。将所得金钗石斛生物总碱用pH＝4的酸水复溶后，加氨水调节pH＝10，用等体积乙醚萃取至乙醚无色为止，浓缩、冷冻干燥，即得石斛碱粗提物。再用3倍量甲醇溶解，然后进行HPLC分离纯化，收集保留时间2.7±0.1分钟组分，挥干流动相后，即得含量为95.5％的石斛碱。

本发明的实施例4：

取金钗石斛茎粗粉按W/V＝1∶6的料液比加入酸性有机溶剂，加热提取1次，每次1小时，过滤，弃滤渣；所得提取液浓缩成浸膏，用酸水溶解，通过经预处理的阳离子交换树脂，洗脱至无生物碱反应为止；所得碱性乙醇洗脱液浓缩至无醇味为止，加碱调节pH，用等体积氯仿或乙醚萃取，得石斛碱粗提物；将石斛碱粗提物溶解后进行HPLC分离制备。

本发明的实施例5：

取金钗石斛茎粗粉按W/V＝1∶14的料液比加入酸性有机溶剂，加热提取5次，每次6小时，过滤，弃滤渣；所得提取液浓缩成浸膏，用酸水溶解，通过经预处理的阳离子交换树脂，洗脱至无生物碱反应为止；所得碱性乙醇洗脱液浓缩至无醇味为止，加碱调节pH，用等体积氯仿或乙醚萃取，得石斛碱粗提物；将石斛碱粗提物溶解后进行HPLC分离制备。

本发明的实施例6：

取金钗石斛茎粗粉按W/V＝1∶8的料液比加入酸性有机溶剂，于微沸状态下提取3次，每次2小时，过滤，弃滤渣；所得提取液浓缩成浸膏，用酸水溶解，过经过预处理的阳离子交换树脂，先用蒸馏水洗脱水溶性杂质，再用碱性乙醇洗脱，至无生物碱反应为止；所得碱性乙醇洗脱液浓缩至无醇味为止，加碱调节pH，用等体积氯仿萃取3次；浓缩萃取液，冷冻干燥可得金钗石斛生物总碱；将所得金钗石斛生物总碱用酸水复溶后，加碱调节pH，用等体积乙醚萃取至乙醚无色为止，浓缩、冷冻干燥可得石斛碱含量不低于80％的提取物；HPLC制备：将石斛碱粗提物用3倍量甲醇溶解，然后进行HPLC分离制备可得石斛碱含量不低于95％的提取物。

本发明的实施例7：

取金钗石斛茎粗粉按W/V＝1∶12的料液比加入酸性有机溶剂，于微沸状态下提取3次，每次4小时，过滤，弃滤渣；所得提取液浓缩成浸膏，用酸水溶解，过经过预处理的阳离子交换树脂，先用蒸馏水洗脱水溶性杂质，再用碱性乙醇洗脱，至无生物碱反应为止；所得碱性乙醇洗脱液浓缩至无醇味为止，加碱调节pH，用等体积氯仿萃取4次；浓缩萃取液，冷冻干燥可得金钗石斛生物总碱；将所得金钗石斛生物总碱用酸水复溶后，加碱调节pH，用等体积乙醚萃取至乙醚无色为止，浓缩、冷冻干燥可得石斛碱含量不低于80％的提取物；HPLC制备：将石斛碱粗提物用3倍量甲醇溶解，然后进行HPLC分离制备可得石斛碱含量不低于95％的提取物。