一种嗜热耐酸性β-葡萄糖苷酶产生菌及制备方法

摘要

本发明公开了一种嗜热耐酸性β-葡萄糖苷酶产生菌及制备方法，该菌株(CCTCC M209312)是从腐败玉米秸秆中分离得到的，其筛选方法为收集合适腐败的玉米秸秆，剪碎用无菌水稀释后经过纤维二糖的诱导富集培养，梯度浓度稀释涂筛选平板，挑透明圈大的菌落保存作为初筛，经过多次初筛；使用汽爆玉米秸秆粉诱导培养基培养后测定酶活力进行复筛，筛选得到的菌株发酵液离心后上清即可以作为液体酶制剂，亦可喷雾干燥得到固体酶制剂，可以适应多种酸性高热的工业条件。本发明从腐烂的玉米秸秆中通过生物技术筛选一种新的菌株，用汽爆秸秆粉等便宜培养基来生产具有嗜热耐酸性的β-葡萄糖苷酶，应用于纤维素降解系统、食品、纺织、造纸等相关的工业领域。

说明书

技术领域：

本发明涉及到一种嗜热耐酸性β-葡萄糖苷酶产生菌及制备方法，具体的说是提供了一种嗜热耐酸β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选、发酵生产方法和利用所生产的酶在工业过程中的实际应用，属于微生物发酵及其产物利用等相关领域。

背景技术：

β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。它广泛存在于自然界的许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉和细菌体内。它参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用。β-葡萄糖苷酶在生物技术应用和生物转化方面也有很重要的应用，在纤维素水解为还原糖的过程中，依靠内切纤维素酶、外切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶的协同作用，然而β-葡萄糖苷酶是此过程的限速酶，β-葡萄糖苷酶活力较低就会造成纤维二糖的大量积累，积累的纤维二糖对纤维素内切和外切酶有很强烈的抑制作用，所以β-葡萄糖苷酶其性质和酶活力的高低在纤维素水解的过程中决定着总体酶活力。已经报道的β-葡萄糖苷酶pI大多在酸性范围内，最适的pH值一般在3.5~5.5之间，以pH 4.5居多。很少在pH在3.5以下的。然而很多的生物应用过程中均需要在酸性环境中进行，比如酸处理后的汽爆秸秆粉，纺织和造纸工业以及工农业废料和残留物的处理等。对环境的要求很高，需要在耐酸和高温条件下进行反应。同时由于生产菌株和生产条件的限制，商业化的β-D-葡萄糖苷水解酶价格非常高，没有办法实现大规模的工业化使用，本发明的任务是找到一种能够以较便宜的原料来生产的嗜热耐酸性β-葡萄糖苷酶的优良菌株。

发明内容：

本发明目的是提供一株制备嗜热耐酸性β-葡萄糖苷酶产生菌，为一种新的菌株。

本发明公开了上述菌的制备方法及所用的培养基，

本发明公开了上述菌的发酵方法，

本发明公开的一种嗜热耐酸性β-葡萄糖苷酶产生菌，保藏号为：CCTCC M 209312，命名为Tolypocladium cylindrosporum syzx4，根据真菌的系统分类学和鉴定的进化树表明，菌株属于子囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina)，肉座菌目(Hypocreales)，穗霉属(Tolypocladium cylindrosporum)。

本发明所述嗜热耐酸性β-葡萄糖苷酶产生菌的制备方法，其特征是：

将玉米秸秆腐烂部分剪成小块在灭菌水中粉碎，得到的菌液接入含有纤维二糖为碳源的培养基中进行富集培养，培养条件为：50℃，120rpm，3～5d；富集培养后的菌液用灭菌水等比稀释后进行粗筛培养，30℃培养24h后，挑选黑色透明圈的单一菌落进行纯化后保存；采用复筛培养基发酵菌株，30℃，120rpm，培养5～8d，离心取上清，选择β-葡萄糖苷酶活力较大的菌株使用PDA斜面进行保存。

上述的制备方法，所用的富集培养基由蛋白胨2.5g/L、纤维二糖2.5g/L、(NH₄)₂SO₄1g/L、KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄0.2g/L组成。

上述的制备方法，所用的粗筛培养基由酵母粉2.5g/L、蛋白胨2.5g/L、纤维二糖0.25g/L、(NH₄)₂SO₄1g/L、KH₂PO₄0.5g/L、MgSO₄0.2g/L、琼脂15～20g/L、1g/L七叶苷、2.5g/L柠檬酸高铁铵组成。

上述的制备方法，所用的复筛培养基为：在Mandels营养盐溶液1L中加入汽爆玉米秸秆粉20g，豆饼粉5g。

本发明的嗜热耐酸性β-葡萄糖苷酶产生菌的发酵方法，将本发明的菌在发酵培养基中培养，培养条件为：120rpm，30℃，培养8d。所述的发酵培养基由汽爆秸秆粉25.72g/L、豆粕6.82g/L、KH₂PO₄1.90g/L、(NH₄)₂SO₄3.21g/L、(H₂N)₂CO 0.3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L、CaCl₂0.3g/L、FeSO₄·7H₂O 0.005g/L、MnSO₄·H₂O 0.0016g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.0014g/L、CoCl₂0.002g/L组成。

本发明公开的统计学方法对菌株产酶条件的优化的分析和结果为：

首先使用单因子设计对合适的工农业废料包括：碳源(麦麸、汽爆秸秆、未处理秸秆和麦秆)和氮源(玉米浆、酒糟、豆粕和豆饼粉)分别优化，将上述成分烘干后粉碎，过40目筛得到的细粉作为培养基成分，结果表明产酶活力较高的碳源为汽爆秸秆，氮源为豆粕；在此基础上采用Plackett-Burman设计法对影响产酶活力较大的因子进行研究，结果表明影响较大的因子及其顺序为：汽爆秸秆粉＞KH₂PO₄＞豆粕＝(NH₄)₂SO₄；使用RSM响应面分析法对各个成分进行进一步优化，通过SAS软件分析和Matlab7.0作图可以知道培养基的成分对产酶的影响不是简单的线性关系，平方项和交互项的作用都比较强。汽爆秸秆粉和(NH₄)₂SO₄对产酶的影响显著，另外汽爆秸秆粉、KH₂PO₄、豆粕和(NH₄)₂SO₄的平方项对酶活力的影响也都显著，汽爆秸秆粉和(NH₄)₂SO₄的协同交互作用对产酶活力的影响也很显著。经过统计学的分析得到最佳的产酶条件为：汽爆秸秆粉25.72g/L，豆粨6.82g/L，KH₂PO₄1.90g/L，(NH₄)₂SO₄3.21g/L，其它培养基成分保持不变，培养条件为：120rpm，30℃，培养8d，此时得到的酶活力为2.21U/mL。

本发明公开了β-葡萄糖苷酶制剂的制备方法为：

筛选得到的菌株Tolypocladium cylindrosporum syzx4(CCTCC M 209312)经发酵后，发酵液进行6000rpm下离心10min，分开上清和菌体，得到的澄清的上清液可以作为β-葡萄糖苷酶酶制剂，亦可以喷雾干燥做成粉末酶制剂。此β-葡萄糖苷酶酶制剂可以应用于纤维素降解系统、食品、纺织、造纸等相关的工业过程的β-葡萄糖苷酶活力补充应用。

本发明的积极效果在于：从腐烂的玉米秸秆中通过生物技术筛选一种新的菌株，用汽爆秸秆粉等便宜培养基来生产具有嗜热耐酸性的β-葡萄糖苷酶，应用于纤维素降解系统、食品、纺织、造纸等相关的工业领域。

附图说明

图1为本发明筛选菌株的黑色透明圈和对照菌株图片；

(1)菌株syzx 1；(2)菌株syzx 2；(3)菌株syzx 3；(4)菌株syzx4；(5)对照菌株，Aspergullus niger(CICC 40613)。

图2为汽爆秸秆粉(xl)浓度和(NH₄)₂SO₄(x4)浓度对β-葡萄糖苷酶活力(Y)影响的响应面和等高线图。

图3为pH值在2.0~5.8范围内对β-葡萄糖苷酶活力的影响表。

以pH 4.4酶活力为100％。

图4为反应温度在30~90℃对β-葡萄糖苷酶活力的影响表。

以60℃酶活力为100％

具体实施方式：

实施例1

菌株的筛选方法

收集多年堆积的腐败的玉米秸秆腐烂部分，用剪刀剪成小块，在100mL灭菌水中用玻璃珠打碎，将得到的菌液接入仅含有纤维二糖为碳源的培养基中进行50℃富集培养，富集培养基为：蛋白胨2.5g/L，纤维二糖2.5g/L，(NH₄)₂SO₄1g/L，KH₂PO₄0.5g/L，MgSO₄0.2g/L。培养条件为：50℃，120rpm，富集培养3~5d；把得到的菌液等比稀释10^-1~10^-6倍，取100μL在粗筛平板上涂板，粗筛培养基为：酵母粉2.5g/L，蛋白胨2.5g/L，纤维二糖0.25g/L，(NH₄)₂SO₄1g/L，KH₂PO₄0.5g/L，MgSO₄0.2g/L，琼脂15~20g/L，灭菌后加入过滤后的1g七叶苷，2.5g柠檬酸高铁铵溶液，30℃培养24h后把平板放入冰箱内显色1h，观察透明圈产生情况，挑选较大的黑色透明圈(图1)的单一菌落进行纯化后保存；复筛采用菌株产生苷酶活力的测定，复筛的原始培养基为：汽爆玉米秸秆粉20g/L，豆饼粉5g/L加上Mandels营养盐((NH₄)₂SO₄3.5g/L，KH₂PO₄2g/L，(H₂N)₂CO 0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，CaCl₂0.3g/L，FeSO₄·7H₂O0.005g/L，MnSO₄·H₂O 0.0016g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.0014g/L，CoCl₂0.002g/L)，30℃，120rpm，培养5~8d，离心取上清用标准方法pNPG法测定其β-葡萄糖苷酶活力，选择β-葡萄糖苷酶活力较大的菌株保存，可以多次比较反复筛选。得到合适的菌株使用PDA斜面进行保存。

试验例1

菌株发酵生产β-葡萄糖苷酶发酵

应用统计学的方法对实例1鉴定的菌株进行发酵条件的优化，对RSM拟合的模型进行统计分析，使用Matlab7.0做图，图2显示汽爆秸秆粉和(NH₄)₂SO₄的交互作用对产酶活力的影响，从图中可以看出汽爆秸秆粉的浓度和(NH₄)₂SO₄的浓度对发酵过程中β-葡萄糖苷酶活力影响显著，交互作用显著。统计学分析方法得到的最佳产酶条件为：所述的发酵培养基由汽爆秸秆粉25.72g/L、豆粕6.82g/L、KH₂PO₄1.90g/L、(NH₄)₂SO₄3.21g/L、(H₂N)₂CO 0.3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L、CaCl₂0.3g/L、FeSO₄·7H₂O 0.005g/L、MnSO₄·H₂O 0.0016g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.0014g/L、CoCl₂0.002g/L组成。在培养条件为：120rpm，30℃，培养8d，此时得到的酶活力为2.21U/mL。

试验例2

菌株Tolypocladium cylindrosporum syzx4(CCTCC M 209312)发酵液β-葡萄糖苷酶活力的测定

以试验例1得到的培养基和培养条件进行培养后，6000rpm离心10min，得到澄清的发酵上清液，作为粗酶液。以p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(pNPG)作为底物进行β-葡萄糖苷酶活力测定的底物。反应体系为1ml含有0.9ml 1mM的pNPG和0.1ml用柠檬酸缓冲液(100mM，pH 4.5)适当稀释的酶液，60℃反应30min。一个酶活力单位(U)的定义为每分钟从底物中释放1μmol p-nitrophenol多需要的酶的量。

经测定，发酵液离心后的酶活力达到了2.21U/mL。菌株的发酵液具有较强的β-葡萄糖苷酶活力。

试验例3

菌株生产β-葡萄糖苷酶性质的研究

对最佳发酵条件发酵离心得到的β-葡萄糖苷酶进行性质分析，探讨pH值从2.0~5.8(图3)和温度为30~90℃(图4)范围内酶活力的变化。

由图3可以看出，此酶在pH值酸性范围内比中性区域的活性更高，pH 2.6时活力最高，为标准方法测定的124％，提高了24％；在pH 2.0的环境下任然保留了较高的活性。图4中表明此酶在60℃时活力达到最高，70℃时保留了89.88％的活力，在30℃~70℃的范围内苷酶都很高保留了约90％的活力，结果表明分离得到的菌株产生的β-葡萄糖苷酶有较强的嗜热耐酸性能，可以适用于多种处理方法尤其是酸处理后的爆秸秆粉，纺织和造纸工业以及工农业废料和残留物的处理等多种工业化生产的应用。