一种基于雄激素受体体外受体-配体结合效应的环境类雄激素的ELISA定量检测方法

摘要

本发明涉及一种基于雄激素受体体外受体-配体结合效应的环境类雄激素的ELISA定量检测方法。方法包括将雄激素受体与环境类雄激素结合后，雄激素受体二聚化变构，结合含有雄激素反应元件核心序列5′-GGAACAnnnTGTATC-3′的生物素标记的DNA探针，形成生物素DNA探针-雄激素受体-环境类雄激素复合物，并采用雄激素受体单克隆抗体对其吸附分离，再用链亲和素标记的辣根过氧化物酶进行ELISA检测，从而评估样本中类雄激素的效应和含量。本发明方法操作简便、快捷，灵敏度高，检测限可达pM级。可广泛用于食品、环境检测等领域。

说明书

技术领域

本发明涉及环境类雄激素检测方法，具体涉及一种基于雄激素受体体外受体-配体结合效应的环境类雄激素的ELISA定量检测方法。

技术背景

近年来，随着工业污染加剧，许多人造工业化学物质及农药的多种化学成分具有类激素或抗体内激素的作用，可能干扰人类及野生生物体内分泌正常功能，它们潜在的威胁包括导致人类和动物的多个系统如内分泌紊乱、生长发育异常、出生缺陷、生殖能力下降、肿瘤发生增加等问题，是当前毒理学研究热点之一。

环境类雄激素(environmental antiandrogen，EA)就是这样一类重要的环境内分泌干扰物质，他们可模拟体内天然的雄激素，与雄激素受体(androgenreceptor，AR)竞争性结合，阻止体内雄激素与AR的结合，充当AR拮抗剂，从而抑制雄激素活性，发挥类雄激素作用，动物胚胎期暴露可导致生殖器官发育不全或缺失(特别是副睾)、外生殖器畸形(尿道下裂)、隐睾、肛门与生殖器距离缩短等生殖毒性和畸形。目前报道的EA主要涉及一些非甾体药物如氟他胺(flutamide，FLU)、非那雄胺(finasteride，FIN)，农药中的杀虫剂、杀菌剂和除草剂及其代谢产物，如合成除虫菊酯类(pyrethroids)、DDT的代谢产物p，p′-DDE、甲氧滴滴涕(methoxychlor)、杀菌利(procymidone)、烯菌酮(vinclozolin，V)及其代谢产物M₁和M₂等。

传统的检测方法中多以GC和GC-MS法作为检测EA的标准方法。但由于EA通常以痕量混合物的形式存在，且化学性质差异很大，采用传统的萃取富集、高效液相色谱/质谱/气相色谱等方法分离出单一成分并测定含量，其分析手段复杂、操作繁琐、费时费力、设备昂贵、需要专门高级训练，并且很难达到所有痕量成分的完全解析。且环境中存在着大量化学物，截止到2009年11月24日，在化学文摘社(Chemical Abstracts Service，CAS)登记的化学物质达51 045 390种，面对如此多的化学物，传统的试验方法已无法满足需求，所以必须探索高通量筛选方法。1998年美国美国环保局(U.S.EPA)推出《环境内分泌干扰物筛检程序》，提出分层式筛选方法，包括分类(sorting)、优先权设定(prioritysetting)、第一级筛选(T₁S)及第二级检测(T₂S)四阶段其中包括T₁S阶段的3项体外和5项体内试验以及T₂S阶段的5项活体动物暴露实验。

但是如此完善的筛检程序，是以牺牲无数受试动物生命为代价的，并且需要耗费大量的人力物力和时间。因此，许多学者致力于探索更快速、便捷与完善的高通量环境激素测评体系，这些尝试包括无细胞(cell-free)和完整细胞(wholecell)受体结合试验、雄激素依赖细胞增殖试验、雄激素依赖基因转录活化试验、重组基因酵母测评体系、GFP-AR免疫细胞化学方法等。但是，由于这些方法本身的局限，如细胞培养的不稳定性、细胞不能精确定量等，使得这些方法通量低、周期长、系统误差较大，而且样品中的EA也可能被细胞降解，准确性、稳定性和灵敏度不理想。

已有的研究表明，AR是一种配体依赖型的反式转录调节蛋白，属于核受体超家族成员。AR基因一般由4个结构域组成：低保守的氨基端结构域(N-Terminusdomain，NTD)、高保守的DNA结合结构域(DNA binding domin，DBD)、铰链区(flexible hinge)以及高保守的羧基端配体结合结构域(ligand bindingdomain，LBD)，见附图1。其中DBD区能与靶基因上雄激素反应元件(androgenresponse element，ARE)特异结合；LBD区结合激素，AR一旦与雄激素结合，就会激活变构形成二聚体，然后与ARE特异性结合，刺激靶基因转录，从而表现出各种生理效应。ARE的核心序列为5’-GGAACAnnnTGTATC-3’(n为任意核苷酸)。

环境类雄激素EA就是以与内源雄激素如睾酮(Testosterone，T)及双氢睾酮(Dihydrotestosterone，DHT)类似的形式与AR结合，并和内源雄激素一样通过AR介导而产生相应的病理性效应。目前基于受体配体结合的筛选方法，既可以反映EA的结合量，又能综合反映EA的类雄激素样累加毒性当量(TEQ)，且易于实现高通量，是最近几年EA高通量筛选和监测的新方向。Gaido等(GaidoK W，etal.Toxicol Appl Pharmacol，1997，143(1)：205-212)采用重组酵母测评体系评价环境类雄激素诱导的酵母细胞内结合效应，但此方法检出在μM～nM水平，灵敏度和准确性尚不理想。

综上所述，对于环境中为数众多、增长迅速的化合物中的环境类雄激素来说，目前的环境污染物分析技术的进展还远远不能满足监测要求，发展快速、高通量、灵敏度高且重复性好的廉价筛选技术是一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种廉价、快速、高通量的基于雄激素受体体外受体-配体结合效应的环境类雄激素的ELISA定量检测方法。

本发明利用配体-受体生物学激活效应的高效、特异性，以及生物素-亲和素的放大效应和辣根过氧化酶催化底物显色的灵敏性，建立痕量环境类雄激素(EA)累加毒性当量(TEQ)的快速定量检测技术，实现痕量环境类雄激素TEQ的廉价、快速、高通量监测。

本发明的这一目的是通过以下的技术方案实现的：即痕量环境类雄激素(EA)作为配体与雄激素受体(AR)结合后，受体变构二聚化，识别并结合含有雄激素反应元件(ARE)核心序列5′-GGAACAnnnTGTATC-3′(n为任意核苷酸)的DNA双链探针，此DNA探针正链的5′端用生物素(Biotin)标记，形成生物素DNA探针-AR-EA复合物(Biotin-DNA AR-EA probe complex，也即BARC)，采用AR特异的单克隆抗体吸附并分离BARC，洗去未结合的DNA探针，然后针对结合的BARC中生物素标记的DNA采用链亲和素标记的辣根过氧化物酶进行ELISA检测，从而评估样本中EA的生物学效应。

因此，本发明涉及的一种基于雄激素受体体外受体-配体结合效应的环境类雄激素的ELISA定量检测方法，包括以下步骤：

(1)设计合成5’端用生物素标记的DNA探针正链，其全序列中含有雄激素反应元件核心序列5′-GGAACAnnnTGTATC-3′，其中n为任意核苷酸；

(2)合成步骤(1)所述探针的碱基互补连，等量加入(1)所述探针，在退火缓冲液中退火，形成5′端用生物素标记的DNA双链探针；

(3)将雄激素受体特异的鼠源性单克隆抗体McAb加入到羊抗鼠IgG包被的磁珠里，洗涤，得到McAb-磁珠固相载体；

(4)将含环境类雄激素的待检样品与雄激素受体在结合缓冲液中4℃振摇孵育1小时，然后37℃孵育30分钟，使环境类雄激素与雄激素受体结合，受体发生变构，暴露受体DNA结合结构域，形成雄激素受体-环境类雄激素复合物；

(5)向步骤(4)复合物中加入步骤(2)所述5′端用生物素标记的DNA双链探针，37℃反应10分钟，形成生物素DNA探针-雄激素受体-环境类雄激素复合物；

(6)将步骤(5)所得生物素DNA探针-雄激素受体-环境类雄激素复合物溶液中加入到步骤(3)所述的McAb-磁珠固相载体，形成雄激素受体-McAb-磁珠IgG复合物，用磁力架吸附收集此复合物，洗去未结合的探针；

(7)向步骤(6)所述的复合物中加入链亲和素标记的辣根过氧化物酶，37℃孵育0.5-1小时，使DNA探针上标记的生物素与链亲和素特异性结合，磁力架收集磁珠复合物，洗去未结合的酶；

(8)向步骤(7)磁珠复合物中加入辣根过氧化物酶的催化底物四甲基联苯胺和受氢体过氧化氢，37℃孵育10-30分钟，催化底物显色；

(9)向步骤(8)已显色的混合液中加入含有硫酸的终止液终止显色反应，磁力架吸附磁珠，收集上清；

(10)将步骤(9)收集的上清加入到聚苯乙烯酶标板，也即ELISA板，在ELISA检测仪上，于450nm处，测定各孔吸光度值，与以睾酮或双氢睾酮为标准品所作的标准曲线比对，确定待测样品中类雄激素物质的累计当量。

本技术的优点在于：(1)与传统的GC和GC-MS法相比，本技术没有鉴定复杂混合物的困难，由于模拟激素生物学过程，既可以反映EA的结合量，又能反映EA的综合类雄激素样TEQ活性；GC及GC-MS分析操作繁琐、技术要求高、成本昂贵、费时费力。(2)与基因转录活化、细胞增殖实验相比，本技术无长达2周的细胞培养周期，在1-2天内能出具结果、试验周期极短。(3)与现有受体配体结合检测技术相比，本技术通过AR的体外受体-配体结合效应并通过生物素-亲和素的放大效应，使得灵敏度提高高，达到甚至超过GC和GC-MS分析化学方法，检测达到pM级。(4)本发明技术操作简便、快捷，技术平台要求不高，普通实验室即可开展，可广泛用于食品、环境检测等领域。

附图说明

附图1为雄激素受体AR结构示意图；

附图2显示了各种雄激素/类雄激素与AR的结合剂量-效应曲线(结合能力)。

具体实施方式

下面的实施例意在说明实施本发明的现已知的一个最佳的实施方案，但是不应该认为本发明局限于这些实施例。

实施例1  设计合成能与AR特异性结合的生物素标记的DNA探针

设计合成5’端用生物素标记的DNA探针正链，其全序列中含有雄激素反应元件核心序列5′-GGAACAnnnTGTATC-3′，其中n为任意核苷酸，其全序列为：5′-Biotin-AGACCTACTCTGGAGGAACATATTGTATCGATTGTCCTTGACAGTAAACGGAACATATTGTATCAAATCTGTTGT-3′，核心序列周围的核苷酸可作调整，用SEQ No1表示；合成其互补链：5′-ACAACAGATTTGATACAATATGTTCCGTTTACTGTCAAGGACAATCGATACAATATGTTCCTCCAGAGTAGGTCT-3′，用SEQ No2表示；序列由上海生物工程有限公司标记和合成。

实施例2  设计合成能与AR特异性结合的生物素标记的DNA探针

设计合成5′端用生物素标记的DNA探针正链，其全序列中含有雄激素反应元件核心序列5′-GGAACAnnnTGTATC-3′，其中n为任意核苷酸，其全序列为：5′-Biotin-AGACCTACTCTGGAGGAACATATTGTATCGATTGTCCTTGACAGTAAACGGAACATATTGTATCAAATCTGTTGT-3′，核心序列周围的核苷酸可作调整，用SEQ No3表示；合成其互补链：5′-ACAACAGATTTGATACAATATGTTCCGTTTACTGTCAAGGACAATCGATACAATATGTTCCTCCAGAGTAGGTCT-3′，用SEQ No4表示；序列由上海生物工程有限公司标记和合成。

实施例3  将两条互补的单链退火形成DNA双链探针

用退火缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM NaCl，1mM EDTA，pH＝8.0)溶解实施例1所述SEQ No1和SEQ No2，使其终浓度为20～100umol/L。将二条链等摩尔混合，于94℃保温5分钟后、45℃保温5分钟，冷却至室温，-20℃保存备用。

实施例4  磁珠固相载体预处理及与AR单克隆抗体McAb结合

用300μL含5g/L牛血清白蛋白和1mg/ml鲑鱼精DNA的PBS预处理包被有二抗-羊抗鼠IgG的免疫磁株，于4℃在一个旋转平台上30转/分轻轻振摇6～12小时，以减少非特异性吸附。用磁力架收集磁珠，再用含有5g/L BSA冷的PBS洗涤磁珠3次，备用。然后将1∶300稀释的鼠源性AR单克隆抗体McAb与预处理的免疫磁珠于室温下轻微摇动1～3小时，形成磁珠-二抗-McAb固相载体。磁力架收集此固相载体，洗涤3次，备用。

实施例5  痕量EA与AR的体外特异结合体系

样品中EA与AR的结合在下列结合缓冲液体系和条件进行：50mMTris-HCl，1mM EDTA，500mM KCl，2mM二硫赤藓糖醇(DTT)，2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，5％甘油，结合缓冲液pH 7.6。采用100μL体系，4℃孵育数小时，移至37℃孵育30分钟。

实施例6  EA与AR的结合试验流程

终浓度为10nM的AR 50μL与50μL系列浓度的雄激素/类雄激素，如睾酮、双氢睾酮、氟他胺、烯菌酮等(终浓度从1.0×10^-14～1.0×10^-6M)，在实施例5所述结合缓冲液中4℃孵育1小时，移至37℃孵育30分钟，促进AR二聚体化变构，暴露受体DNA结合结构域，加入5ng实施例3所述的DNA双链探针孵育10分钟，形成生物素DNA探针-AR-EA复合物，也即BARC。不加雄激素作为空白对照，所有受试样本均做复孔。将此BARC加入实施例4所述的磁珠-二抗-McAb固相载体，轻轻混匀，室温，在一个旋转平台上30转/分轻摇1小时，即得BARC-McAb-磁珠IgG复合物，用磁力架吸附分离此复合物，去上清，洗去游离的探针。

实施例7  结合探针的亲和素放大ELISA检测

向实施例6收集的磁珠复合物中，加入链亲和素标记的辣根过氧化物酶，37℃孵育0.5～1小时，使DNA探针上标记的生物素与链亲和素特异性结合，形成复合物，向复合物中加入辣根过氧化物酶的催化底物四甲基联苯胺TMB和受氢体H₂O₂，37℃孵育10～30分钟，催化TMB显色，然后加入含有硫酸的终止液终止显色反应，磁力架收集已显色上清液。将此上清液加入到聚苯乙烯酶标板，也即ELISA板，将此ELISA板在ELISA检测仪上，于450nm处，测定各孔吸光度值，也即OD值，与以系列浓度双氢睾酮(DHT)或睾酮(T)为标准品所作的标准曲线比对，确定待测样品中类雄激素物质的相对含量及累计当量。系列标准品的浓度可分为：1×10^-12、1×10^-11、1×10^-10、1×10^-9、1×10^-8、1×10^-7、1×10^-6、1×10^-5M。

实施例8  观察不同雄激素/类雄激素与AR的结合能力及检测体系对痕量EA的检测能力

配制不同浓度的雄激素和类雄激素标准品，包括睾酮(T)、双氢睾酮(DHT)、羟基氟他胺(Hydroxyflutamide，OH-FLU)、孕激素(Progesterone，Pro)、p，p’-DDE等，在实施例6～7的结合体系中，观察不同雄激素/类雄激素与AR的结合能力，并测定测定检测体系的灵敏度(检测下限)和准确性(回收率)。结果显示，结合能力顺序为DHT≈T＞Pro＞OH-FLU＞p，p’-DDE，见附图2。以传统细胞增殖实验和GC/MS分析结果为对照方法，进行比较。本技术可在1-2天内出具定量结果，灵敏度可达pM级，以传统方法相比，本方法具有快速、高效、高通量以及准确性、灵敏度高的优点。

与本发明有关的核苷酸序列：

<110>中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120>一种基于雄激素受体体外受体-配体结合效应的环境类雄激素的ELISA定量检测方法

<160>4

<170>

<210>1

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>结合探针正链

<223>根据雄激素反应元件而设计，含有两个雄激素反应元件，其5′端用生物素标记，作为结合雄激素受体的特异序列。

<400>1

5′-Biotin-AGACCTACTCTGGAGGAACATATTGTATCGATTGTCCTTGACAGTAAACGGAACATATTGTATCAAATCTGTTGT-3′

<210>2

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>结合探针互补链

<223>为SEQ No1的互补链

<400>2

5′-ACAACAGATTTGATACAATATGTTCCGTTTACTGTCAAGGACAATCGATACAATATGTTCCTCCAGAGTAGGTCT-3′

<210>3

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>结合探针正链

<223>根据雄激素反应元件而设计，含有两个雄激素反应元件，其5′端用生物素标记，作为结合雄激素受体的特异序列。

<400>3

5′-Biotin-GGCACTACTCTGGAGGAACACGGTGTATCGATTGTCCTTGACAGTAAACGGAACACGGTGTATCACATCTGCCTA-3′

<210>4

<211>75

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>结合探针互补链

<223>为SEQ No3的互补链

<400>4

5′-TAGGCAGATGTGATACACCGTGTTCCGTTTACTGTCAAGGACAATCGATACAACCGGTTCCTCCAGAGTAGTGCC-3′