一种灵芝生物碱类物质指纹图谱鉴定方法

摘要

本发明公开了一种灵芝生物碱类物质指纹图谱鉴定方法，取产地各不相同的已知标准品种样品干燥的灵芝子实体碎片5～10批次、每批次取相同质量的生药量分别制成供试品溶液，进行高效液相色谱分析，取各批次中高效液相色谱图的共有吸收峰为特征色谱峰，选择归一化峰面积大于1％的特征色谱峰作为指纹峰，得到灵芝生物碱类物质的标准指纹图谱；再取待测样品干燥的灵芝子实体碎片，以相同方法得到的待测样品灵芝生物碱类物质高效液相色谱图，待测样品灵芝生物碱类物质高效液相色谱图具有灵芝生物碱类物质的标准指纹图谱中所有的特征色谱锋，则待测样品为标准品种。运用本发明方法可对不同灵芝种属进行鉴别。

说明书

技术领域

本发明属于食用菌及中药材原材料生物碱类物质品质分析技术鉴定领域，具体涉及灵芝中的生物活性组分生物碱类物质的一种高效液相色谱指纹图谱的构建方法及分析鉴别方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma Lucidum)自古以来被誉为人类延年益寿的灵丹妙药，滋补益气的仙草。早在我国第一部本草学专著《神农本草经》中，就认为它具有益心气、安精魂、补肝益气、坚筋骨的作用。李时珍在《本草纲目》中也对灵芝的食疗保健作用作了高度评价：“赤芝又名丹芝，气味苦平，无毒。主治胸中结，益心气，补中，增智慧，不忘。久食轻身不老，延年神仙”。在近几十年来，科学家通过各种研究，已从多方面证明：灵芝具有很“灵”的祛病强身，扶正固本的保健作用。尤其对生物免疫与传统治疗肿瘤具有奇特的效果。

近年来大量的化学和药理分析表明：灵芝具体有抗肿瘤、减轻癌症或其他疾病引起的疼痛、增强免疫、延缓衰老、保肝解毒、治疗高血压、降血糖、镇咳平喘、抗辐射和抗过敏等多种作用。尤其在抗肿瘤方面，国内外许多著名的医疗研究机构经研究得出结论：灵芝对胃癌、肺癌、恶性淋巴瘤、肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、肠癌、食道癌、白血病等多种肿瘤疾病有十分显著的疗效。灵芝之所以具有如此显著的医疗保健效果，其中的活性物质中，灵芝生物碱类(如二萜类、三萜类、嘌啉碱、未知生物碱等)是灵芝中一种重要的基础药效成分，其功效主要包括：保肝；抗肿瘤；降血糖；抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性；抑制组胺释放；抑制血管紧张素转化酶；抑制胆固醇合成等作用。因此，灵芝生物碱类具有重要的医药保健价值，目前灵芝通过不同的加工方式已被开发成多种保健品，灵芝生物碱类物质是其中的一种产品。

目前国内灵芝种属有很多，如赤芝、黑芝、紫芝、韩芝、白芝等，其中以赤芝品种居多，由于灵芝栽培随气候条件、区域的差异、栽培方式、种属不同，灵芝中生物活性组分生物碱类物质有一定的差别，如何鉴别灵芝中所含的生物活性组分生物碱类物质，对灵芝的品质鉴别和科学评价具有价值杠杆的意义。目前，对不同灵芝种属、同品种不同区域、同品种不同栽培方法的生物活性组分生物碱类物质的鉴别及质量评价还没有建立一个科学的评判方法，也没有相关方面的方法报道。

发明内容

本发明的目的是为了建立灵芝原材料生物碱类物质的分析鉴别方法，对灵芝生物碱加工质量控制、原材料真伪鉴别及生物碱类物质的初步定性定量品质分析提供了一种有效的方法，从而对灵芝的原材料品质进行科学的评价。

本发明采用的技术方案是：

一种灵芝生物碱类物质指纹图谱鉴定方法，所述的方法包括以下步骤：

(a)标准指纹图谱的制取：取产地各不相同的已知标准品种样品干燥的灵芝子实体碎片5～10批次、每批次取相同质量的生药量分别进行如下试验：加入已知样品干燥的灵芝子实体碎片25～35倍质量的乙醇回流提取，过滤除去滤渣后得到已知样品提取液，已知样品提取液经减压蒸馏除去溶剂，得已知样品生物碱浸膏液，加甲醇定容得已知样品溶液，控制所述的已知样品溶液中生药量含量为2～7克/100毫升，已知样品溶液经0.45μm有机滤膜过滤，得已知样品供试品溶液，取已知样品供试品溶液进行高效液相色谱分析，得到已知样品灵芝生物碱类物质高效液相色谱图；所述高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以己腈、1vol％醋酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为254nm；取各批次中高效液相色谱图的共有吸收峰为特征色谱峰，图中选择归一化峰面积大于1％的特征色谱峰作为指纹峰，得到灵芝生物碱类物质的标准指纹图谱；

(b)待测样品高效液相色谱图制取：取待测样品干燥的灵芝子实体碎片，加入待测样品干燥的灵芝子实体碎片25～35倍质量的乙醇回流提取，过滤除去滤渣后得到待测样品提取液，待测样品提取液经减压蒸馏除去溶剂，得待测样品生物碱浸膏液，加甲醇定容得待测样品溶液，控制所述的待测样品溶液中生药量含量与步骤(a)中已知样品溶液的生药量含量相同，待测样品溶液经0.45μm有机滤膜过滤，得待测样品供试品溶液，取待测样品供试品溶液进行高效液相色谱分析，所述高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以己腈、1vol％醋酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为254nm，得到待测样品灵芝生物碱类物质高效液相色谱图；

(c)将步骤(b)得到的待测样品灵芝生物碱类物质高效液相色谱图与步骤(a)得到的灵芝生物碱类物质的标准指纹图谱中的特征色谱峰对照，待测样品灵芝生物碱类物质高效液相色谱图具有灵芝生物碱类物质的标准指纹图谱中所有的特征色谱锋，则待测样品为标准品种。

较为具体的，所述步骤(a)标准指纹图谱的制取中，每批次取相同质量生药量的已知标准品种样品干燥的灵芝子实体碎片制得已知样品灵芝生物碱类物质高效液相色谱图的操作包括以下步骤：

(1)称取已知样品干燥的灵芝子实体碎片，加入95wt％乙醇，所述95wt％乙醇和已知样品干燥的灵芝子实体碎片的质量比为25～35∶1，优选33∶1，在微沸回流状态下，提取1～2小时，过滤除去滤渣后，得已知样品提取液；

(2)已知样品提取液经减压蒸馏除去溶剂，得已知样品生物碱浸膏液，加甲醇定容得已知样品溶液，控制所述的已知样品溶液中生药量含量为2～7克/100毫升，已知样品溶液经0.45μm有机滤膜过滤，得已知样品供试品溶液；

(3)已知样品供试品溶液进行高效液相色谱分析，得已知样品灵芝生物碱类物质高效液相色谱图，所述色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以己腈、1vol％醋酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流动相流速为1mL/min，检测波长为254nm，进样量10μL，分析时间为40min，梯度洗脱程序为：0～8min，10vol％的1vol％醋酸水溶液和90vol％的乙腈；8～10min，15vol％的1vol％醋酸水溶液和85vol％的乙腈；10～15min，30vol％的1vol％醋酸水溶液和70vol％的乙腈；15～20min，40vol％的1vol％醋酸水溶液和60vol％的乙腈；20～30min，45vol％的1vol％醋酸水溶液和55vol％的乙腈；30～40min，50vol％的1vol％醋酸水溶液和50vol％的乙腈。

较为具体的，所述步骤(b)中待测样品高效液相色谱图制取的操作包括以下步骤：

(1)称取待测样品干燥的灵芝子实体碎片，加入95wt％乙醇，所述95wt％乙醇和待测样品干燥的灵芝子实体碎片的质量比为25～35∶1，优选33∶1，在微沸回流状态下，提取1～2小时，过滤除去滤渣后，得待测样品提取液；

(2)待测样品提取液经减压蒸馏除去溶剂，得待测样品生物碱浸膏液，加甲醇定容得待测样品溶液，控制所述的待测样品溶液中生药量含量与步骤(a)中已知样品溶液的生药量含量相同，待测样品溶液经0.45μm有机滤膜过滤，得待测样品供试品溶液；

(3)待测样品供试品溶液进行高效液相色谱分析，得高效液相色谱图，所述色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以己腈、1vol％醋酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流动相流速为1mL/min，检测波长为254nm，进样量10μL，分析时间为40min，梯度洗脱程序为：0～8min，10vol％的1vol％醋酸水溶液和90vol％的乙腈；8～10min，15vol％的1vol％醋酸水溶液和85vol％的乙腈；10～15min，30vol％的1vol％醋酸水溶液和70vol％的乙腈；15～20min，40vol％的1vol％醋酸水溶液和60vol％的乙腈；20～30min，45vol％的1vol％醋酸水溶液和55vol％的乙腈；30～40min，50vol％的1vol％醋酸水溶液和50vol％的乙腈。

本发明所述已知样品干燥的灵芝子实体碎片是将已知样品灵芝子实体切片、干燥、粉碎至40～80目得到。

本发明所述待测样品干燥的灵芝子实体碎片是将待测样品灵芝子实体切片、干燥、粉碎至40～80目得到。

本发明所述的在微沸回流状态下，提取1～2小时，过滤除去滤渣后，得已知样品提取液，优选为在微沸回流状态下，提取1小时，过滤除去滤渣后，得已知样品提取液；更优选为：采用微波辅助提取法，在功率为800W的微波条件下，微波辅助回流提取17min，过滤除去滤渣后，得已知样品提取液。

本发明所述的在微沸回流状态下，提取1～2小时，过滤除去滤渣后，得待测样品提取液，优选为在微沸回流状态下，提取1小时，过滤除去滤渣后，得待测样品提取液；更优选为：采用微波辅助提取法，在功率为800W的微波条件下，微波辅助回流提取17min，过滤除去滤渣后，得待测样品提取液。

本发明可以对不同灵芝种属、同品种不同产地、同品种不同栽培方式的生物活性组分生物碱类物质进行鉴别分析，可通过设定某一灵芝品种的生物碱色谱图为参照图谱，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统的匹配和峰面积计算，自动计算出不同产区赤灵芝样品中共有峰组成及样品的相似度，参照峰面积的大小和相似度的计算值，进行数据分析即可比较科学地判别不同产区赤灵芝所含生物碱的品质情况，从而初步鉴别不同类别的哪种品种更具有相似性和差异性，所含生物碱类的品质更好。

本发明优选以微波辅助回流提取法进行前处理，优化了生物碱提取方法，采用C18柱，以己腈、1vol％醋酸水溶液为流动相进行二元梯度洗脱对灵芝中生物碱类物质的指纹图谱分析鉴别具有快速、简便、稳定、直观、重现性好、针对性强、生物碱谱峰数目多、分离效果好及易于操作的优点。运用本发明方法对不同灵芝种属、同品种不同产地、同品种不同栽培方式的生物活性组分生物碱类物质的鉴别效果非常理想，对灵芝的生物活性组分生物碱类物质的品质鉴别首次提出了初步定性定量的科学依据。

说明书附图

附图1 1号品种赤灵芝样品中生物碱类物质的指纹图谱

附图2 9种不同产区赤灵芝样品的生物碱类物质色谱峰对照指图谱，取这9种高效液相色谱图的共有吸收峰为特征色谱峰，图中选择归一化峰面积大于1％的特征色谱峰作为指纹峰，得到赤灵芝生物碱类物质的标准指纹图谱。

附图3 5种不同种属赤芝、韩芝、紫芝、黑芝、野生灵芝生物碱类物质色谱峰对照指图谱，赤表示赤芝、韩表示韩芝、紫表示紫芝、黑表示黑芝、野表示野生灵芝。

具体实施方式：

下面以具体实施例对本发明进行进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1建立灵芝中生物碱类物质的指纹图谱

1.粉碎步骤：将1号品种赤灵芝样品实体切片、干燥、粉碎至40目左右，得灵芝干品。

2.提取步骤：称取5g灵芝干品，以料液比1∶33加入95wt％乙醇，在微沸回流状态下，采用800W功率，微波回流提取17min，过滤除去滤渣后，得提取液。

3.提取液经减压蒸馏除去溶剂，得生物碱浸膏液，加甲醇定容至100mL，得样品溶液，样品溶液中赤灵芝干品含量为5克/100毫升：样品溶液经0.45μm有机滤膜过滤，得供试品溶液；

4.供试品溶液进行高效液相色谱分析，得高效液相色谱图。色谱条件为：Waters1525高效液相色谱仪，二元泵，紫外检测器，Bress软件，十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱C₁₈(型号：Symmetry250×4.6mm I.D.5μm，美国Waters公司生产)，以己腈、水(含1％醋酸v/v)为流动相进行梯度洗脱，流动相流速为1mL/min，检测波长为254nm，进样量10μL，分析时间为40分钟，梯度洗脱程序为：0～8min，10vol％的1vol％醋酸水溶液和90vol％的乙腈；8～10min，15vol％的1vol％醋酸水溶液和85vol％的乙腈；10～15min，30vol％的1vol％醋酸水溶液和70vol％的乙腈；15～20min，40vol％的1vol％醋酸水溶液和60vol％的乙腈；20～30min，45vol％的1vol％醋酸水溶液和55v ol％的乙腈；30～40min，50vol％的1vol％醋酸水溶液和50vol％的乙腈。

5.指纹图谱构建：在高效液相色谱图中选择归一化峰面积大于1％的色谱峰作为指纹峰，最终选择了38个指纹峰(占总峰面积的90％以上)作为灵芝单峰生物碱类分析图谱，见图1，图中黑圆点所示即为指纹峰。这样可定性判别赤灵芝样品中存在灵芝生物碱的种类，同时根据归一化面积计算法，大致判别在相应的出峰保留时间段，哪种生物碱含量较高。

实施例2不同产区赤灵芝生物碱初步定性定量比较鉴别分析

采集9种不同产区赤灵芝样品进行生物碱类分析，实验条件和操作方法同实施例1，得到9种赤灵芝样品生物碱类分析图谱，然后采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选取一种产区赤灵芝样品作为参照谱峰(R)，并进行色谱峰多点校正的方法，对8个样品的色谱峰进行匹配并自动生成对照指图谱，见附图2，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统的匹配和峰面积计算，自动计算出不同产区赤灵芝样品中共有峰组成及样品的相似度，分别见表1、表2。

表1色谱峰峰面积及共有峰匹配分析数数据

  保留  时间  S1  S2  S3  S4  S5  S6  S7  S8  R  共有  峰数  1.492  0  469.427  0  0  203.16  0  257.59  217.35  143.44  4  2.158  259.08  229.414  206.24  228.47  0  0  0  0  115.40  4  2.333  201.45  332.056  0  0  0  0  0  224.21  94.716  3  2.664  1576.5  2298.32  0  1882.2  1056.3  926.53  1530.7  1086.3  1294.6  7  3.537  1052.3  865.414  260.47  631.50  268.89  218.51  438.23  311.83  505.90  8  3.750  292.33  342.329  380.33  365.44  271.29  319.38  204.65  387.19  320.37  8  12.639  248.16  200.184  0  0  222.18  0  0  0  83.817  3  12.979  443.71  229.103  207.50  281.01  277.57  323.54  357.94  340.33  307.59  8  14.292  229.89  0  0  0  233.11  0  230.23  204.45  112.21  4  16.29  455.87  0  214.41  0  0  238.14  224.23  226.07  169.84  5  16.717  454.61  0  0  0  318.90  0  214.28  0  123.47  3  17.461  357.81  202.328  325.69  0  0  317.27  221.19  367.69  224.00  6  17.828  561.75  245.117  392.43  243.89  0  388.3  262.60  430.23  315.54  7  18.158  542.31  241.559  541.21  313.94  205.68  639.38  489.51  642.99  452.07  8  19.2  328.47  251.271  272.29  0  398.67  247.59  0  296.24  224.31  6  19.386  569.96  212.4  276.72  0  0  204.98  257.51  294.50  227.01  6  19.902  1299.1  790.102  1360.3  558.44  510.30  1368.7  652.80  1456.8  999.60  8  20.156  784.99  391.413  713.78  323.32  366.75  692.95  526.62  794.47  574.28  8

  保留  时间  S1  S2  S3  S4  S5  S6  S7  S8  R  共有  峰数  20.513  0  273.604  220.21  0  349.19  237.25  202.39  240.45  162.86  5  20.767  713.02  345.269  694.81  286.20  0  440.49  274.63  493.03  405.93  7  20.945  330.86  220.211  276.75  0  211.94  261.02  282.13  312.76  236.96  7  21.193  460.36  438.747  812.60  213.17  0  757.63  399.18  399.18  502.82  7  21.725  0  0  0  281.22  0  410.55  362.09  2034.0  385.98  4  21.805  548.94  342.893  0  0  0  1172.3  0  0  258.02  3  21.864  978.85  786.401  1611.2  328.31  520.39  0  628.33  0  606.68  6  22.571  202.39  0  0  0  249.58  0  209.33  204.57  108.23  4  22.933  258.10  0  204.16  0  0  214.48  0  0  84.594  3  23.916  253.83  307.435  228.67  0  590.15  0  0  275.26  206.92  5  24.238  469.04  407.614  671.56  0  203.71  569.73  244.59  760.22  415.81  7  24.847  523.59  457.65  563.65  0  283.83  479.07  219.82  640.13  395.97  7  25.33  320.14  0  323.08  0  248.33  221.79  241.58  303.52  207.30  6  25.669  217.50  293.771  207.22  0  621.66  356.39  310.96  282.77  286.28  7  27.166  388.86  303.588  295.68  0  280.62  271.10  0  370.27  238.76  6  19293.  12530。  12615。  6172.  8537.  11277.  9462.1  14617.  113813

注：Sx为灵芝样品种类

表2色谱峰相似度计算值

  S1  S2  S3  S4  S5  S6  S7  S8  R  S1  1  0.812  0.765  0.745  0.698  0.841  0.831  0.721  0.934  S2  0.812  1  0.505  0.897  0.774  0.884  0.883  0.677  0.916  S3  0.765  0.505  1  0.364  0.495  0.579  0.654  0.565  0.731  S4  0.745  0.897  0.364  1  0.665  0.874  0.859  0.598  0.847  S5  0.698  0.774  0.495  0.665  1  0.804  0.649  0.551  0.792  S6  0.841  0.884  0.579  0.874  0.804  1  0.888  0.739  0.941  S7  0.831  0.883  0.654  0.859  0.649  0.888  1  0.797  0.944  S8  0.721  0.677  0.565  0.598  0.551  0.739  0.797  1  0.83  R  0.934  0.916  0.731  0.847  0.792  0.941  0.944  0.83  1

通过上述表1数据分析，按归一化峰面积大于1％计算，8种不同产区赤灵芝样品，最多的生物碱指纹图谱峰数可达42种，最少的仅为14种，这样可容易的分辨不同产区赤灵芝样品所含灵芝生物碱的种类的差异性。

另外，还可以很容易的辨别灵芝生物碱类物质的共有指纹图谱特征峰数，上述8个灵芝样品中，生物碱共有指纹图谱特征峰数为6个，分别在保留时间：3.537、3.750、12.979、18.158、19.902、20.156min。通过归一化面积积分法计算，也可容易鉴别，在同一保留时间段，或对共有特征峰，其保留时间段，各样品的峰面积相对对照峰峰面积大小，可判别各样品生物碱含量的大小，也可通过各样品的总峰面积的积分计算与对照品的总峰面积，判别各样品生物碱含量的大小。

此外，由上述表2数据分析，通过各样品的色谱峰相似度计算，可知S1，S2，S6，S7灵芝样品有更多的相似性，其相似度达到0.916以上，S3的差异性最大，这样对灵芝样品的原料质量控制，真伪鉴别具有科学意义的评价。

实施例3采用不同种属灵芝样品进行生物碱类定性分析

采集5种不同种属赤芝、韩芝、紫芝、黑芝、野生灵芝样品各进行生物碱类分析，取样量、实验条件和操作方法同实施例1，得到5种灵芝样品生物碱类分析图谱，然后采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选取赤灵芝样品作为参照谱峰，并进行色谱峰多点校正的方法，对5个样品的色谱峰进行匹配并自动生成对照指图谱，见附图3，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统的匹配和峰面积计算，野生灵芝、黑芝、韩芝均较赤芝和紫芝有更高的生物碱类物质含量。不同种属的灵芝生物碱类物质差异性较大，赤芝、韩芝和黑芝略为相似，相似度仅达0.806左右。只有赤芝指纹图谱与赤灵芝生物碱类物质的标准指纹图谱完全吻合。

这样对不同种属的灵芝中的生物碱类物质含量的高低可以很快地进行定性判别。