慢病毒载体介导的基因转移及其用途

摘要

本发明为遗传和获得性增生性眼病提供了一种人基因疗法。该方法开发了慢病毒载体转导有丝分裂活跃和不活跃细胞的能力，因而可治疗眼病。

说明书

本申请是2001年12月18日提交的CN 01822491.1，题为“慢病毒载体介导的基因转移及其用途”的分案申请。

发明领域

本发明总体上涉及载体和基因治疗的分子生物学领域。更具体地，本发明涉及在人基因疗法中采用慢病毒载体治疗遗传和增生性眼病。

相关技术的描述

人失明的最常见原因之一是眼内细胞异常增殖。由于牵引力直接施加于视网膜表面，所以眼内细胞增殖通常导致视轴清晰度的丧失或视网膜与视网膜色素上皮(RPE)的分离。增生性视网膜脱离，不许其是否与增生性糖尿病性视网膜病(PDR)、早产儿视网膜病(ROP)、增生性玻璃体视网膜病(PVR)或新血管老年相关性黄斑退变(AMP)有关，如果不治疗最终导致永久性丧失视觉。

眼内新血管的异常增生一眼新血管形成是发展中国家中永久性失明的最常见原因。三种疾病与大多数的眼内新血管形成的所有病例有关：糖尿病、早产儿视网膜病和老年相关性黄斑退变。然而这三种临床病种是有差别的，且影响不同类型的患者，他们具有最终的共同途径，该途径涉及导致新血管形成的内皮细胞的失控性分裂，而新血管形成最终危及视网膜功能。在美国这些情况约占不可治疗失明的60％。

视网膜内血管内皮细胞的增生引发增生性糖尿病视网膜病。如果不治疗，这些内皮细胞继续分裂，最后形成纤维血管膜，此纤维血管沿着视网膜的内表面延伸，或者进入玻璃体腔。后玻璃表面的收缩造成在玻璃体-纤维血管粘附部位上的牵引，最终脱离视网膜。在糖尿病诊断的20年内，约50％I型糖尿病患者将发生增生性糖尿病性视网膜病，而10％2型糖尿病患者在类似时间范围内将出现增生性糖尿病性视网膜病。

血管通常是由两个过程中的一个产生的，即血管发生或血管生成。在血管发生期间，在胚胎发生时通过多能间充质祖细胞的成熟建立了毛细血管的原始网络。相反，血管生成指涉及原先存在的血管的重建过程。在血管生成中，从较老、建立的血管中发出新血管芽，并入侵周围组织。在视网膜中，一旦建立了正常的血管网络，此网络的重建大多在组织氧浓度的影响下一缺氧(氧少)刺激血管生成。此过程导致社会中数百万糖尿病人、早产儿或老年人失明。

因此，眼内疾病如老年相关性黄斑退变、增生性糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、青光眼和增生性玻璃体视网膜病的特征是异常增生或基因治疗可能有用的其它状态。但是，在哺乳动物细胞中进行高效基因转导是困难的。此外，用传统的载体如腺病毒载体、脂质体和基于树型化合物的试剂所见的结果是十分短暂的。将这些载体导入眼内而不引起强的炎性反应也是有问题的。

因此，先有技术的缺陷是缺乏在眼内转导终末分化或增殖的人细胞或衍生自眼的细胞的方法。

发明概要

本发明的目的是开发慢病毒载体和在遗传和增生性眼病的人基因疗法中使用这些载体的方法。描述了慢病毒载体对于转导人视网膜、角膜、血管内皮、增生性玻璃体视网膜细胞和视网膜色素上皮细胞的用途。

在本发明的一个实施例中，证明了通过慢病毒递送的组成型活化的(突变体或变体)视网膜母细胞瘤(CA-rb)基因，来抑制眼内细胞分裂的可能性。在体外测试了人眼细胞和在体内测试了两种模型的眼内增生性疾病(增生性玻璃体视网膜病和晶状体摘除术后后囊浑浊)。在许多不同类型的细胞中观察到体外细胞分裂的明显和历时长久的抑制作用。在体内观察到增生性玻璃体视网膜病和晶状体摘除术后后囊浑浊的严重性降低。

在本发明的另一实施例中，证明了在新血管生长(血管生成)或预编程性细胞死亡(凋亡)的发生和抑制中已知是重要的慢病毒介导的基因转换，可用于治疗病理性眼血管生成(如糖尿病性视网膜病或“湿性”老年相关性黄斑退变)或病理性细胞死亡(如“干性”老年相关性黄斑退变)。在家兔模型中证明了将这些基因置于两种分开的强启动子之一的控制下，已知在人视网膜、角膜和视网膜色素上皮细胞中有活性，并且抑制角膜的新血管形成。

此外，当携带已知在遗传性眼病的人患者中缺损的基因时，此载体系统可将这些基因转移到人眼细胞中。通过此系统转移这些基因形成了治疗这些眼病患者有效疗法的基础。

本发明涉及在需要这种治疗的患者(如眼病患者)中抑制眼内细胞增殖的方法。该方法包括的步骤是：给予所述患者含药理学上有效量的有抑制眼内细胞增殖的治疗性基因的慢病毒载体。

本发明还步及抑制眼病患者中眼内新血管形成的方法，该方法包括的步骤是：给予所述患者含药理学上有效量的有抑制眼内新血管形成的治疗性基因的慢病毒载体。

其它和进一步的方面，本发明的特点和优点将从本发明的以下优选实施例的描述中显而易见，这些实施例是为披露的目的而给出的。

附图简述

这样本发明的上述特点、优点和目的以及其它内容将变得清晰，而且可参考某些实施例，附图说明作出的简要概况来详细了解本发明更具体的描述。这些附图构成了说明书的一部分。但应指出的是，附图说明的是本发明的优选实施例，因此不认为限制了本发明的范围。

图1描述一种载体(由加州圣迭戈Salk研究所的Inder Verma博士提供)。HIV：人免疫缺损病毒，LTR：长末端重复序列，GAG：HIV GAG基因，POL：HIV逆转录酶，ENV：HIV包膜基因，rre：rev-反应元件，CMV：巨细胞病毒，VSV：水泡性口炎病毒，Poly A：聚腺苷酸化信号，特异性启动子：可将任何转录-增强启动子置于此处，以便调节治疗性基因表达的空间、瞬时或定量方面。治疗性基因：可将具有治疗潜力的任何基因置于此处，例子包括但不限于组成型活化的视网膜母细胞瘤基因或导致疾病的缺损基因。

图2显示下列人细胞系的体外转导：人视网膜色素上皮细胞(RPE)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、脉络膜成纤维细胞(CF)、人视网膜母细胞瘤(视网膜衍生的)细胞(Weri-Rb-1和Y79)。用含有标记基因(增强的绿色荧光蛋白基因)的慢病毒颗粒转导这些细胞系，并用荧光激活细胞分选法测定表达该标记基因的细胞组分。用较大数量的慢病毒颗粒[感染复数(MOI)]转导更多的细胞，记录剂量反应。

图3a显示慢病毒转导培养的视网膜色素上皮细胞。标记基因(eGFP)的表达产生绿色荧光细胞。图3B显示转导效率的荧光激活细胞分选分析。第一组中R2门外的的数据反映预转导没有荧光。第二组表明转导后转变为＞95％荧光。

图4说明人视网膜色素上皮细胞中有丝分裂活动和转导效率。用慢病毒或小鼠白血病病毒(MLV)载体转导了人视网膜色素上皮细胞。在接触载体时，用有丝分裂不活跃的细胞(汇合)或有丝分裂活跃的细胞(生长)。图4显示的这些结果表明，慢病毒载体转导非分裂的细胞的能力优于其它逆转录病毒载体。

图5描述人视网膜色素上皮细胞中的表达稳定性。使细胞与含eGFP的慢病毒载体接触，随后在连续培养中维持在至少120天。图5A描述在这些细胞中的eGFP表达稳定性及对慢病毒转导的细胞缺乏选择(转导的细胞组分在整个时间仍保持恒定)。图5B是对细胞的5个克隆群体进行Southern分析的结果。第1泳道含非转导亲代细胞系的基因组DNA。第2和第3泳道含与载体接触的细胞的DNA，但没有绿色(非转导)。第4和第5泳道含经转导的绿色细胞的DNA。细胞维持e-GFP阳性是基因组整合的结果。

图6说明人胎儿细胞转基因表达。当与人胎儿细胞中非慢病毒逆转录病毒载体(MND-eGFP)或无病毒载体(对照)相比时，此图描述用慢病毒载体获得了高效转导方式。

图7显示角膜转导。图7A是人角膜的图解。图7B表明用含e-GFP的慢病毒载体转导人角膜内皮。在角膜移植时取出人的角膜钮，与慢病毒颗粒接触。然后取下德斯密膜，并在室内光线(左)和在适合荧光检测的条件下(右)照相。图7C表明慢病毒介导的e-GFP基因转移到人角膜上皮细胞。亚图A是带有人工剥脱的上皮层的人角膜的光学显微摄影。荧光显微镜(亚图B)揭示有上皮荧光。

图8提供慢病毒基因转移一种基因的例子，该基因缺损导致人患病。在摘除视网膜母细胞瘤时，使手术切下正常人视网膜或视网膜色素上皮组织，接触缺乏治疗性基因(模拟)或含有人外周蛋白基因的慢病毒载体。当人遗传缺损时，已知此基因导致各种各样残疾表型。采用仅能识别转移的外周蛋白基因而设计的引物显示了逆转录酶辅助的聚合酶链反应(rt-PCR)的结果。清楚地显示了人外周蛋白在人视网膜和视网膜上皮中的表达。

图9显示慢病毒介导的CA-rb mRNA表达。显示了采用设计的只识别组成型活化形式的视网膜母细胞瘤基因的引物进行逆录酶辅助的聚合酶链反应(rt-PCR)的结果。第1泳道：标记，第2泳道：与从慢病毒-eGFP转导的细胞中分离的RNA的反应结果，第3泳道：与从慢病毒-CA-rb转导的细胞中分离的RNA的反应结果。反应产物具有预期的大小。

图10显示慢病毒组成型活化的视网膜母细胞瘤基因载体对人视网膜和脉络膜细胞分裂的抑制作用。使细胞接触渐减稀释度的单一慢病毒贮存液(1∶400稀释到1∶50稀释)和培养，与接触不含组成型活化的视网膜母细胞瘤基因的慢病毒载体的细胞比较。在整个时间清楚地看到对细胞分裂的抑制作用，此作用是剂量依赖的。

图11显示慢病毒CA-rb对人晶状体上皮细胞分裂的抑制作用。在白内障摘除时从人眼取出的细胞接触渐减稀释度的单一慢病毒贮存液(1∶400稀释到1∶50稀释)和培养，与接触不含组成型活化的视网膜母细胞瘤基因的慢病毒载体的细胞比较。在整个时间清楚地看到对细胞分裂的抑制作用，此作用是剂量依赖的。

图12显示慢病毒CA-rb对失明眼内细胞增殖的体内抑制作用。在三组家兔中诱发增生性玻璃体视网膜病。一组末治疗，一组用缺乏组成型活化的视网膜母细胞瘤基因的慢病毒载体治疗，最后一组用玻璃体内递送的慢病毒CA-rb治疗。注意到在前二组中增生性玻璃体视网膜病和视网膜脱离的频率高(＞90％)。在用组成型活化的视网膜母细胞瘤基因治疗的组中，发生视网膜剥脱的动物的百分率较低(26％)。这里显示两幅视网膜照片。左眼视网膜完全附着是用组成型活化的视网膜母细胞瘤基因治疗的。右眼视网膜完全脱离，系眼内玻璃体视网膜病性细胞增殖的后果，是用缺乏CA-26基因的慢病毒处理的。

图13显示慢病毒CA-rb对体内晶状体摘除术后后囊浑浊过程的抑制作用。3组兔子进行标准的晶状体乳化以除去天然晶状体。第1组(组1)接着不作任何处理，另2组用空的慢病毒构建物处理(无治疗性基因，组2)或在白内障伤口缝合时将慢病毒CA-rb(组3)递送入完整的晶状体囊袋中。逐次检查动物后囊浑浊的存在。对存在的浑浊作1-5标度分级，1代表无浑浊，5代表浑浊严重足以妨碍用间接双目检查用眼镜看见视网膜。组1和组2(末处理和空载体)之间没有获得统计学上不同的结果。此图显示慢病毒CA-rb对后囊浑浊的产生有显著的抑制作用。截止第28天，对照动物的平均浑浊评分为4.4，而用慢病毒CA-rb治疗的动物的平均浑浊评分为2.1。

图14显示慢病毒载体递送的内皮生长抑素-18/血管生长抑素融合基因的图谱。

图15显示携带内皮生长抑素/血管生长抑素融合基因的慢病毒载体PHR-CMV-Endo/Ang-ires-e GFP的图谱。

图16显示携带BIK基因的慢病毒载体PHR-CMV-BIK-ires-e GFP的图谱。

图17显示携带内皮生长抑素/Kringle融合基因的慢病毒载体PHR-CMV-Endo/Kringle-ires-eGFP的图谱。

图18显示携带KDR基因的慢病毒载体PHR-CMV-KDR-ires-eGFP的图谱。

图19显示携带P16基因的慢病毒载体PHR-CMV-P16-ires-eGFP的图谱。

图20显示携带P21基因的慢病毒载体PHR-CMV-P21-ires-eGFP的图谱。

图21显示携带Timpl基因的慢病毒载体PHR-CMV-Timpl-ires-eGFP的图谱。

图22显示携带血管生长抑素基因的慢病毒载体PHR-EF1/HTLV-Ang-ires-eGFP的图谱。

图23显示携带内皮生长抑素XV基因的慢病毒载体PHR-EF1/HTLV-EndoXV-ires e-GFP的图谱。

图24显示携带内皮生长抑素/血管生长抑素融合基因的慢病毒载体PHR-EF1/HTLV-EndoAng-ires-eGFP的图谱。

图25显示携带内皮生长抑素/Kringle融合基因的慢病毒载体PHR-EF1/HTLV-EndoKringle-ires-eGFP的图谱。

图26显示携带Kringle基因的慢病毒载体PHR-EF1/HTLV-Kringle1-5-ires-eGFP的图谱。

图27显示携带Mig/IP10融合基因的慢病毒载体PHR-EF1/HTLV-MigIP10-ires-eGFP的图谱。

图28显示携带Timp1基因的慢病毒载体PHR-EF1/HTLV-Timp1-ires-eGFP的图谱。

图29显示携带Timp4基因的慢病毒载体PHR-EF1/HTLV-Timp4-ires-eGFP的图谱。

图30显示携带P21基因的慢病毒载体PHR-EF1/HTLV-P21-ires-eGFP的图谱。

图31显示携带内皮生长抑素XVIII基因的慢病毒载体PHR-EF1/HTLV-EndoXVIII-ires-e GFP的图谱。

图32显示从x内皮生长抑素-18/血管生长抑素融合基因转导的人皮肤微血管内皮(hDMVE)细胞中分离的mRNA的RT-PCR。第1泳道：1000/100bp梯混合；第2-5泳道：从用1μl、5μl、10μl和20μl PHR’-eF1α/HTLV-Endo::Ang-IRES-eGFP病毒上清液(来自12孔平板的单一孔)转导的hDMVE细胞中分离的mRNA的RT-PCR；第6泳道：与20μl PBS温育的hDMVE细胞分离的mRNA的RT-PCR；第7泳道：阴性对照(水作为RT-PCR的模板；第8泳道：100bp梯。

图33显示eGFP存在于处理动物的角膜小袋中。图33A显示证明在小袋中存在e-GFP表达的荧光显微照片。图33B显示如图33A中所示的同一组织的非荧光显微照片。图33C显示未处理动物的经类似处理的组织的荧光显微照片。

图34显示用Mig/IP10慢病毒载体处理动物对新血管形成有抑制作用。图34A显示正常(未处理、未剌激的)角膜的照片。图34B显示用Mig/IP10慢病毒载体处理的动物的碱激发角膜照片。注意角膜内没有血管。图34C显示用没有治疗性抗血管生成基因的对照慢病毒载体处理的动物的碱激发角膜照片。注意血管侵入角膜内。图34D显示未处理动物的碱激发角膜照片。注意到血管侵入角膜内。

发明详述

慢病毒是其天然致病性在数月到数年才出现的慢病毒。此病毒属包括逆转录病毒，如人免疫缺陷病毒(HIV)。已知这些病毒感染和转导各种终未分化、有丝分裂活性或无活性的人细胞类型。它们的转导效率很高，即使在传统上对基因转移很顽固的细胞系，如人视网膜、角膜、小梁、晶状体、视网膜色素上皮、增生性玻璃体视网膜和血管内皮细胞也可采用比载体转导。

当用慢病毒感染时，病毒遗传物质本身整合到宿主基因组中。因此，病毒基因成为宿主细胞遗传物质的一个永久部分，基因表达在细胞终生是恒定。用慢病毒转导的每个细胞将遗传信息传送到其子代。在眼内疾病的基因疗法中慢病毒用作载体是可能的，因为在亲代病毒感染的天然条件下，此病毒是与炎性反应无关的一种眼内病原体。用此病毒的以前工作表明其已成功地用于神经细胞和视网膜细胞的转导(Naldini等，1996；Miyoshi等，1997)。

本发明提供一种新的慢病毒载体，此载体在两个克隆位点之间掺入IRES(内部核糖体进入位点)元件中。IRES元件允许mRNA-核糖体结合和蛋白质合成。此主链可容纳两种不同的可表达基因。在转导的细胞中产生单一信息，由于IRES元件，该信息在功能上是双顺反子性的，可驱动两种不同蛋白质的合成。将这两种基因置于强启动子如CMV或HTLV启动子的控制下。另外，本领域熟练技术人员不难采用已知在人视网膜、角膜或视网膜色素上皮细胞中有活性的其它启动子。用这种方式，可将以下讨论的每种潜在的治疗性基因连接于一标记基因(如增强的绿色荧光基因-eGFP基因)，这样经转导的细胞将同时被标记，并能表达感兴趣的治疗性基因。标记的细胞不难在体外分离和体内观察。对本领域熟练技术人员显而易见的是，除增强的绿色荧光蛋白基因外可将其它标记基因掺入慢病毒载体中。因为近年来遗传工程和克隆领域中的普通科学家的一般技术水平有显著提高，所以此领域中普通技术人员不难构建含有感兴趣的其它治疗性基因的慢病毒载体，除本文披露的那些以外。此外，本文披露的慢病毒载体系统可转移已知在遗传性眼病或其它疾病患者中缺乏的基因。通过此系统将这些基因转移到人眼细胞或其它组织构成了有效治疗各种疾病患者的基础。

本文详述的基本发现证明慢病毒载体可转移各种基因以改变异常的眼内增生，从而减少新生血管性病、视网膜剥离或白内障摘除术后后囊浑浊的发生率。许多治疗性基因可在临床上用于眼内细胞分裂的体内抑制。这些基因包括各种最近才鉴定的新血管生长(血管生成)或细胞凋亡过程的调节剂。据信通过慢病毒介导的基因转移，这些调节剂表达的遗传控制证明可用于治疗眼内新生血管性病，如老年相关性黄斑退变、早产儿视网膜病和增生性糖尿病性视网膜病。

本文披露的慢病毒载体可容易地应用于临床环境。

血管内皮细胞在血管发生和血管生成中起主要作用。这些细胞以有丝分裂(在细胞分裂或迁移方面变得活跃)对各种蛋白质细胞因子起反应。例如，血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管形成素-1(Ang1)和舒血管素是刺激内皮细胞分裂、迁移或细胞-细胞粘附的细胞因子，因此有利于血管生成的过程。内皮生长抑素，可溶性(decoy)VEGF受体(sflt)和血小板反应蛋白似乎是抑制血管生成的内源性蛋白质细胞因子。本发明证明通过慢病素载体递送的许多这些抑制性蛋白质可用于治疗眼内新血管形成。可掺入本发明慢病毒载体中的基因例子包括，但不限于以下基因：

金属蛋白酶的组织抑制剂

金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)代表一遍在蛋白质家族，它们是基质金属蛋白酶(MMPs)的天然抑制剂。基质金属蛋白酶是一组锌结合的内肽酶，它们参与结缔组织基质重建和胞外基质(ECM)的降解，这是肿瘤侵袭、血管生成和转移的必须步骤。在ECM内，MMPs各具有不同的底物特异性，且在其降解中是重要的因素。分析人乳房病理学中的MMPs表明，几种MMPs参与E-CM的降解：胶原酶(MMP1)降解纤维性间充质胶原；明胶酶(MMP2)主要降解IV型胶原；和溶基质素(MMP3)具有较广范围的作用(Bramball等，1996，1997)。TIMP家族有4个成员。TIMP-1和TIMP-2能抑制与MMP抑制作用有关的肿瘤生长、侵袭和转移。此外，TIMP-1和TIMP-2参与了血管生成的抑制。不像TIMP家族的其它成员，TIMP-3仅见于ECM中，并且可能作为终末分化标记起作用。最后，TIMP-4被认为在胞外基质止血中以组织特异性方式起作用(Gomez等，1997)。

TIMP-1

金属蛋白酶-1的组织抑制剂(TIMP-1)是一种23KD的蛋白质，它也称为金属蛋白酶抑制剂1、成纤维细胞胶源酶抑制剂、胶源酶抑制剂和和红细胞增强活性剂(EPA)。Docherty等(1985)描述了编码TIMP-1的基因。TIMP-1与金属蛋白酶(如胶原酶)的结合引起不可逆失活。已在转基因小鼠模型中研究了TIMP-1的作用：一种模型在肝中过度表达TIMP-1，另一模型表达导致可遗传产生肝细胞癌的病毒致癌基因猴病毒40/T抗原(Tag)。在双重转基因实验(TIMP-1系与TAg转基因系杂交)中，报导了肝TIMP-1的过度表达通过抑制生长和血管生成阻断TAg诱发的肝细胞癌的产生(Martin等，1996)。

TIMP-2

金属蛋白酶-2的组织抑制剂(TIMP-2)是一种24KD的蛋白质，它也称为金属蛋白酶抑制剂2。Stetler-stevenson等(1990)描述了编码TIMP-2的基因。在肿瘤侵袭中起关键作用的金属蛋白酶(MMP2)可与TIMP-2结合并受抑制。因此，TIMP-2可用来抑制癌转移(Musso等，1997)。当用编码人TIMP-2的质粒转染B16F10小鼠黑色素瘤细胞(一种高度侵袭性和转移性细胞系)和小鼠皮下注射时，TIMP-2过度表达抑制了体内肿瘤生长和新血管生成(Valente等，1998)。

TIMP-3

金属蛋白酶-3的组织抑制剂(TIMP-3)也称为金属蛋白酶抑制剂3。当乳腺癌和恶性黑色素瘤细胞系用TIMP-3质粒转染和裸鼠皮下注射时，观察到肿瘤生长的抑制(Anand-Apte等，1996)。但是，TIMP-3过度表达对体外两种肿瘤细胞系的生长无作用。因此，有人提出肿瘤细胞将TIMP-3释放到邻近的ECM，通过抑制ECM中汇集的生长因子的释放或通过抑制血管生成而抑制了肿瘤生长(Anand-Apte等，1996)。

TIMP-4

金属蛋白酶-4的组织抑制剂(TIMP-4)也称为金属蛋白酶抑制剂4。Greene等(1996)描述了TIMP-4基因和组织定位。生化研究表明TIMP-4结合人明胶酶a这与TIMP-2相似(Bigg等，1997)。Wang等(1997)研究了TIMP-4调节对人乳腺癌体内生长的作用。发现TIMP-4过度表达抑制体外细胞侵袭，和用TIMP-4肿瘤细胞转染子体内注射裸鼠后肿瘤生明显减少(Wang等，1997)。

内皮生长抑素、血管生长抑素、PEX、KRINGLE-5和融合基因

J.Folkman及其同事(Boehm等，1997)表明用内皮生长抑素+血管生长抑素蛋白质联合治疗Lewis肺癌小鼠导致肿瘤的完全消退及小鼠在余生中保持健康。仅在内皮生长抑素+血管生长抑素治疗的一个循环(25天)后得到此效果，而单用内皮生长抑素需要6个循环才导致肿瘤不活动。

D.Hanahan及其同事(Bergers等，1999)证明在胰岛癌小鼠模型中，内皮生长抑素+血管生长抑素联用有较好的抗肿瘤效果。内皮生长抑素+血管生长抑素联用导致肿瘤明显消退，而单用内皮生长抑素或血管生长抑素无效。

内皮生长抑素XVIII

O’Reilly等(1997)首先鉴定了由血管内皮细胞瘤产生的血管生成抑制剂：内皮生长抑素。内皮生长抑素是胶原XVIII的20KD C-末端片段，它特异性地抑制内皮细胞增殖和强力抑制血管生成和肿瘤生长。事实上，已表明在给与重组内皮生长抑素后，原发性肿瘤消退成为不活动的极小病灶(O’Reilly等，1997)。已报导内皮生长抑素是通过与生长因子信号传递有关的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合来抑制血管生成的(Zetter，1998)。

内皮生长抑素XV

最近，已证明胶原XV的C-末端片端(内皮生长抑素XV)像内皮生长抑素XVIII那样抑制血管生成，但具有一些功能差异Sasaki等，2000)。

血管生长抑素

包含前4个Kringle结构的纤溶酶原的内部片段：血管生长抑素是迄今描述的最强的内源性血管生成抑制剂之一。业已表明全身给与血管生长抑素有效地抑制了体内恶性神经胶质瘤的生长(Kirsch等，1998)。血管生长抑素与常规的放射治疗结合使肿瘤根除率提高，而不增加体内毒性作用(Mauceri等，1998)。其它研究证明血管生长抑素CDNA的逆转录病毒和腺病毒介导的基因转移，导致体外内皮细胞生长和体内血管生成的抑制。肿瘤诱发的血管生成的抑制产生了肿瘤细胞死亡的增加(Tanaka等，1998)。已表明将编码小鼠血管生长抑素的cDNA基因转移入鼠T241纤维肉瘤细胞中，能抑制体内原发性和转移性肿瘤生长(Cao等，1998)。

PEX

PEX是MMP-2的C-末端血色素结合蛋白结构域，它抑制MMP-2结合于整联蛋白αVβ3。Brooks等(1998)克隆并描述了血管生成和肿瘤生长所需的阻断细胞表面胶原溶解活性的整联蛋白αVβ3。

KRINGLE-5

已表明人纤溶酶原的Kringle-5结构域与血管生长抑素的4个Kringle具有高度序列同源性，它是内皮细胞增殖的特异性制剂。Kringle-5对碱性成纤维细胞生长因子刺激的毛细管内皮细胞增殖的抑制，似乎比血管生长抑素更强(Cao等，1997)。除了其抗增殖特性以外，Kringle-5还显示与血管生长抑素相似的抗迁移活性，此活性选择性地影响内皮细胞(Ji等，1998)。

血管抑制性融合基因

采用弹性蛋白肽基序(Val-PropGly-Val-Gly)作为接头可克隆新的血管抑制性融合基因。这些融合联合两种强的血管抑制基因以增加对肿瘤血管生成的抑制。由于这些分子通过不同的机制操作，所以它们的联合可产生协同作用。血管抑制融合蛋白的例子包括，但不限于内皮生长抑素18和血管生长抑素(endo/ang)的融合、内皮生长抑素18和纤溶酶原的Kringle-5基序(endo/k5)以及由r-干扰素和α-干扰素诱导蛋白10诱导的单核因子(MIG/IP10)。

趋化因子

趋化因子是能引发白细胞趋化性的低分子量促炎细胞因子。取决于所考虑的趋化因子，化学引诱对某些白细胞细胞类型是特异的。将趋化因子基因表达入肿瘤内可导致更有效的融集有抗肿瘤活性的白细胞。此外，除了它们的趋化作用外，一些趋化因子具有抗血生成活性：它们抑制饲养肿瘤的血管形成。由于这个原因，这些趋化因子在癌症治疗中是有用的。

MIG

r-干扰素诱导的单核因子Mig是与IP-10有关的CXC趋化因子，且由单核细胞产生。Mig是活化T细胞的化学引诱物，还具有强的血管抑制特性。肿瘤内注射Mig导致肿瘤坏死(Sgadari等，1997)。

IP-10

IP-10(α-干扰素诱导蛋白10)是CXC趋化因子家族的一员。IP-10不但主要由单核细胞，而且由T细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生。IP-10对淋巴样细胞如T细胞、单核细胞和NK细胞有趋化作用。IP-10还是强的血管生成抑制剂：它通过抑制内皮细胞分化来抑制新血管形成。由于它的趋化作用针对免疫细胞，所以IP-10被认为是增强抗肿瘤免疫应答的良好候选物。将IP-10基因转移入肿瘤细胞内降低了其致瘤性，并引发长期保护性免疫应答(Luster和Leder，1993)。还表明IP-10的血管抑制作用能介导肿瘤消退：表达IP-10的肿瘤细胞在体内坏死(Sgadari等，1996)。还表明IP-10介导导致肿瘤消退的IL-12的血管抑制作用(Tannenbaum等，1998)。

可溶性VEGF受体

FLT-1(fms-样酪氨酸激酶1受体)是VEGF的膜结合受体(VEGF受体1)。已表明FLT-1的可溶性片段(SFLT-1)通过其对VEGF的拮抗作用而具有血管抑制的特性。可溶性FLT-1不但通过与VEGF结合起作用，而且因为它结合和阻断膜结合FLT-1的外部结构域起作用(Kendall和Thomas 1993，Goldman等，1998)。SFLT-1的一个例子是人sFLT-1，它跨越FLT-1胞外部分的7个免疫球蛋白样结构域。

sFLK-1/KDR

sFLK-1或KDR(激酶插入结构域受体)是VEGF的膜结合受体(VEGF受体2)。已表明KDR的可溶性片段(SKDR)通过其对VEGF的拮抗作用而具有血管抑制特性，或许因为它能结合VEGF，而且因为它能结合和阻断膜膜结合KDR的外部结构域(Kendall和Thomas，1996，Millauer等，1994)。sKDR的一个例子是跨越KDR的胞外部分疫球蛋白样结构域的人sKDR。

细胞凋亡

术语“细胞凋亡”用来描述编程性细胞死亡或细胞自杀的过程。此过程是多细胞生物发育和健康的正常组成部分。细胞凋亡的异常调节涉及症到自身免疫的各种病理性障碍。

BIK

BIK是一种KD的160个氨基酸)强促胞凋亡蛋白，也称为BC1-2相互作用杀伤剂细胞凋亡诱导剂BK、BP4和BIP1。Bik由基因bik(或nbk)编码。Bik的功能是通过与各种细胞凋亡阻抑蛋白如Bc1-XL、BHRF1、Bc1-2或其腺病毒同系物E1B蛋白结合而加速编程性细胞死亡。在瞬时转染研究中，Bik以类似于Bc1-2家族、Bax和Bak的促细胞凋亡成员方式促进细胞死亡(Boyd等，1995)。

BAK

Bc1-2同系物Bak，是一种促细胞凋亡蛋白，如前述Bik那样它通过结合抗细胞凋亡家族成员包括Bc1-2和Bc1-XL和抑制它们的活性(而促进细胞凋亡，Chittenden等，1995)。

BAX

Bax是起细胞凋亡调节剂作用的21KD蛋白。Bax通过二聚化和拮抗细胞凋亡阻抑蛋白Bc1-2加速编程性细胞死亡。这些蛋白二聚体的比例被认为与细胞凋亡的起始有关。Kobayashi等(1998)研究了K562红白血病细胞中重组Bax表达的作用。将Bax载体转染入K562细胞中导致诱导细胞凋亡。此外，发现用Bax稳定转染的细胞对化疗剂ara-x、阿霉素和SN-38更敏感(Kobayashi等，1998)。

BAD

BAD蛋白(Bc1-2结合组分6、bad基因或bbc6或bc1218)是促进细胞死亡的小蛋白(168个氨基酸、18KD)。它成功地竞争与BC1-XL和Bc1-2的结合，从而影响这两种蛋白质与Bax异二聚化的水平。它可以逆转BC1-XL的死亡阻抑蛋白活性，但不能逆转BC1-2的这种活性。

BCL-2

B细胞白血病/淋巴瘤-2(BC1-2)是细胞死亡调节蛋白家族的原型成员。BC1-2主要见于线粒体中，通过干扰caspase的激活来阻断细胞凋亡。已表明将BC1-2基因转移入肿瘤细胞可增强它们的转移潜力(Miyake等，1999)。BC1-2基因转移可应用于骨髓移植，因为在受照射的受者中重建后，BC1-2可提高造血干细胞的存活(Innes等，1999)。BC1-2基因转移还可用于抗神经变性疾病，因为BC1-2在神经元中表达保护它们免受细胞凋亡(Saille等，1999)。

BLC-XS

BC1-XS(短同种型)是BC1-2和BC1-XL的显性失活阻抑蛋白。它已用于基因治疗实验go引发表达BC1-2和BC1-XL肿瘤的细胞凋亡。BC1-XS的表达减少了肿瘤大小(Ealovega等，1996)和使肿瘤细胞对化疗剂敏感(Sumatran等，1995)，这提示BC1-XL在表达BC1-2或BC1-XL的肿瘤中引发细胞死亡的作用(Dole等，1996)。

GAX

GAX是编码转录因子的同源框基因，它以P-21依赖方式抑制细胞增殖。当细胞受刺激而增殖时，GAX被下调。GAX过度表达导致促分裂原活化的细胞中BC1-2下调和BAX上调(Perlman等，1998)。因此，GAX可用来抑制某些肿瘤细胞的生长。此外，GAX在血管平滑肌细胞中过度表达能抑制它们的增殖(Perlman等，1999)。因此，GAX基因转移可限制血管损伤后的血管狭窄。

肿瘤抑制蛋白基因

肿瘤抑制基因的各种突变与不同类型的癌症相关。在这些情况时，曾设想采用野生型肿瘤抑制蛋白基因的体细胞基因疗法，作为抗癌治疗方法。P16、P21、P27和P53通过作用于依赖细胞周期蛋白的激酶而抑制细胞周期。

P16

P16，一种15KD的蛋白质(148个氨基酸)也称为CDK41、P16-INK4、P16-INK4A或多价肿瘤抑制蛋白1(MTS1)。P16由基因cdkn2a或cdkn2编码。P16与依赖细胞周期蛋白的激酶4和6形成异二聚体，从而阻止体内外它们与细胞周期蛋白d的相互作用。因此，P16起着正常细胞增殖的负调节剂作用。P16(cdkn2)突变与广范的组织中的肿瘤形成有关。Cdkn2a在大多数肿瘤细胞系和某些原发性肿瘤包括黑色素瘤和胆道、胰腺及胃肿瘤中纯合性地缺失、发生突变、或失活(Biden等，1997，Castellano等1997)。在间皮瘤肿瘤和其它细胞系中都观察到P16IKN4a基因表达的丧失。已表明在间皮瘤细胞中用表达的腺病毒进行P16INK4a的转导，导致细胞生长的减少和被转导细胞的死亡(Frizelle等，1998)。而且，将野生型P16通过腺病毒介导的基因转移导入不表达内源性P16/CDKN2基因的3种人神经胶质瘤细胞系(U251MG、U87MG和D54MG)中，导致细胞生长停滞于G0和G1期(Fueyo等，1996)。此外，将野生型P16-INK4a通过腺病毒介导的基因转移导入不表达这p16-INK4a的肺癌细胞系中抑制体了外和体内肿瘤的增殖(Jin等，1995)。因此，在肿瘤细胞中野生型P-16蛋白的重建有癌症治疗的用途。

P21

P21是一种18KD的蛋白质(164个氨基酸)，也称为依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂1(cdkn1)、黑色素瘤分化相关蛋白6(MDA-6)和CDK相互作用蛋白1。P21由基因CDKN1编码(Harper等，1993)，也称为CIP1和WAF1。P21可能是重要的中间物，通过此中间物P53介导了其充当对DNA损伤的应答中细胞增殖的抑制剂作用。P21可结合和抑制依赖细胞周期蛋白的激酶的活性，阻止关键的依赖细胞周期蛋白激酶底物的磷酸化和阻断细胞周期进展和细胞增殖。P21在所有成人组织中表达的。P21基因转移入肿瘤细胞中可用来抑制肿瘤生长。在两种人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系中进行重组腺病毒介导的P21转移导致剂量依赖性P21诱导和伴随细胞生长抑制，是由于G0/G1细胞周期停滞造成的。此外，在小鼠的NSCLC预建立的肿瘤中注射携带P21的腺病毒，降低了肿瘤生长和提高了动物的存活率(Joshi等，1998)，这些结果支持了癌症基因治疗中使用P21。

根据本发明，可采用本领域技术中的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这种技术在文献中有充分解释。参见，如Maniatis、Fritsch和Sambrook《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(1982)；《DNA克隆：实践方法》(DNA Cloning：A Practical Approach)，第1和第2卷(D.N Glover等，1985)；《寡核甘酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait等，1984)；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1985)；《转录和翻译》(Trans-cription and Translation)(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney编，1986)；《固定化细胞和酶》(Immobilized Cells and Enzymes)(IRLPress，1986)；B.Perbal《分子克隆的实用指南》(A Practical Guide to MolecularCloning)(1984)。

“载体”是一种复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，可附着另一DNA区段以产生所附着区段的复制。

“启动子序列”是一种DNA调节区域，能结合细胞中的RNA聚合酶，引发下游(3’方向)编码序列的转录。为了明确本发明的目的，通过转录起始位点启动子序列在其3’末端结合并向上游(5’方向)延伸直到包括以高于背景可检测水平起动转录所必需的最低数量的碱基或元件。启动子序列内发现有一个转录起始位点(用核酸酶S1作图便于确定)，以及蛋白质结合结构域(共有序列)负责与RNA聚合酶的结合，真核启动子经常但并非总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。各种启动子可用来驱动载体。

当这种DNA通常由病毒载体导入细胞内时，细胞就被外源或异源DNA所“转导”。转导的DNA可能(如在慢病毒载体的例子中)或不可能整合(共价连接)到细胞的基因组中。例如，在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，DNA可保留在附加型元件如质粒上。就真核细胞而言，稳定的转化细胞是转化的DNA整合入染色体中的细胞，这样它通过染色体复制被子代细胞所遗传。真核细胞建立由含转化的DNA的子代细胞群组成的细胞系或克隆的能力，证明了这种稳定性。“克隆”是单一细胞或共同祖先通过有丝分裂产生的一群细胞。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的原代细胞的一个克隆。

“治疗性基因”指赋与所需表型的一种基因。例如，组成型活化的视网膜母细胞瘤(Carb)基因，可用来防止眼内增生或通过外周蛋白基因的转移修复遗传缺损。

如本文所用，术语“标记基因”指连接于异源启动子或增强子元件的一种编码序列当此构建物导入组织或细胞时，其产物易于定量测定。常用的标记包括放射性元素、酶、蛋白质(如增强的绿色荧光蛋白)或暴露于紫外线时发荧光的化学品等。

本发明涉及通过慢病毒基因转移治疗遗传性或增生性失明症的新方法。因此，本发明包括携带编码有助于治疗这种疾病的基因的DNA序列的慢病毒载体。例子包括但不限于以上讨论的外周蛋白基因，组成型活化形式的rb基因和各种治疗性基因。

本发明涉及抑制眼病患者中眼内细胞增殖的方法，此方法包括给予所述患者药理学上有效量含有抑制眼内细胞增殖的治疗性基因的的慢病毒载体。采用本发明方法可治疗的眼病的代表性例子包括老年相关性黄斑退变、增生性糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、青光眼和增生性玻璃体视网膜病。该治疗性基因可能是组成型活化形式的视网膜母细胞瘤基因、P16基因或P21基因。优选地，在囊、玻璃体或视网膜下间隙内，以约10⁶-10⁹转导单位剂量给与该慢病毒载体。

本发明还涉及抑制眼病患者眼内新血管形成的方法，此方法包括给予所述患者含药理学上有效量的有抑制眼内新血管形成的治疗性基因的慢病毒载体的步骤。采用本发明方法可治疗的眼病的代表性例子包括老年相关性黄斑退变、增生性糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、青光眼和增生性玻璃体视网膜病。该治疗性基因可以是调节血管生成或细胞凋亡的基因。调节血管生成的基因通常包括编码金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4、内皮生长抑素、血管生长抑素、内皮生长抑素XVIII、内皮生长抑素XV、基质金属蛋白酶-2的C-末端血色素结合蛋白结构域、人纤溶酶原的Kringle5结构域、内皮生长抑素和血管生长抑素的融合蛋白、内皮生长抑素和人纤溶酶原Kringle5结构域的融合蛋白、r-干扰素诱导的单核因子(Mig)、α-干扰素诱导蛋白10(IP10)、Mig和IP10的融合蛋白、可溶性FLT-1(fms样酪氨酸激酶1受体)，和激酶插入结构域受体(KDR)的基因，而调节细胞凋亡的基因包括编码BC1-2、Bad、Bak、Bax、Bik、Bc1-X短同种型和Gax。优选在囊、玻璃体或视网膜下间隙间，以约10⁶-10⁹转导单位剂量给与此慢病毒载体。

以下给出的例子是为了说明本发明的各种实施例，不意味以任何方式限制本发明。

实施例1

细胞和组织

建立了人脉络膜成纤维细胞(HCF)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人胎儿视网膜色素上皮细胞(HRPE)的原代外植体，并置于促进或不促进有丝分裂活动的条件中。还培养了稳定的光感受器衍生的细胞(Y-79和Weri-Rb-1)。

在摘除视网膜母细胞瘤时得到的人视网膜和RPE，用来证明慢病毒载体转导这些有丝分裂无能细胞和诱导外源性人外周蛋白转基因表达的能力。在角膜移植手术时得到的人角膜，用来证明慢病毒载体转导这些具有标记基因增强的绿色荧光蛋白基因的有丝分裂无能细胞的能力。

实施例2

慢病毒载体

用水泡性口炎病毒(VSV)包膜伪装配了三种以质粒为基础的慢病毒载体系统，其含有绿色荧光蛋白(GFP)基因用作标记(图1)。如Naldini等所述产生了重组慢病毒。巨细胞病毒(CMV)立即早期基因启动子指导eGFP在质粒PHR’-CMV-eGFP中的表达。病毒的贮存物接以下方法产生。将人肾293T细胞(5X10⁶)接种于10cm平板上，次日用10μg pCMVΔR8.91(包装功能质粒)、10μg pHR²-CMV-eGFP(标记基因质粒)和2μg pMD.G(含VSV-G包膜的质粒)在D10生长培养基(含10％胎牛血清的高葡萄糖DMEM)和抗生素中用磷酸钙沉淀进行共转染。37℃、12-16小时后，移去培养基并加入新鲜的D10生长培养基。细胞再培养10小时。细胞中加入含10mM丁酸钠和20mM Hepes缓冲剂的新鲜D10培养基，细胞再培养12小时。用含20mM Hepes缓冲剂的新鲜D10培养基替换此培养基，12小时后收集含病毒的培养基。加入新鲜培养基，4天后每24小时收集上清液。收集后的病毒上清液立即贮存于-80℃。

上清液于室温超离心(19,000rpm，Bechman SW28转头)140分钟，浓缩病毒贮存物，将得到的病毒沉淀重悬于1-3ml磷酸缓冲盐溶液中。用293T细胞滴定等份的病毒贮存物，剩余的样品贮存于-80℃。

通过感染经植物凝集素刺激的人外周血单个核细胞来测定所有慢病毒载体上清液存在有复制能力的逆转录病毒(RCR)，随后用ELISA分析培养基的p24gag。在产生的任何病毒上清液中末检测到RCR。

实施例3

慢病毒载体转导

用上述慢病毒载体转染293T细胞产生含2X10⁶复制-缺损型慢病毒颗粒/毫升的上清液。细胞与病毒颗粒培养24小时，然后在用荧光激活细胞分选测定GFP表达之前，在正常培养基中恢复4天(图2-3)。

测定转导效率作为感染复数(MOI)范围1-1000的函数。许多人细胞系的体外转导结果证明MOI和转导效率之间为正相关，慢病毒颗粒的数量愈增加，转导的细胞愈多(图2)。

检测了慢病毒载体转导非分裂细胞的能力。用慢病毒或鼠白血病病毒载体转导了人视网膜色素上皮细胞。在接触载体时细胞是有丝分裂无能(汇合)或有丝分裂活跃的(生长)。图4所示结果表明，慢病毒载体转导非分裂细胞的能力优于其它逆转录病毒载体。与非慢病毒逆转病毒载体相比，慢病毒载体在转导人胎儿细胞中也是高度有效的(图6)。

为了测定eGFP转基因表达的持续时间，在120天中测试了慢病毒载体转导的细胞。对转导的细胞的克隆群体进行Southern印迹分析的结果表明，慢病毒-eGFP载体已整合入宿主基因组中(图5B)。整合的eGFP转基因的表达稳定120天以上，且对被转导细胞无选择性优点或抵抗(图5A)。

实施例4

原位角膜转导

在角膜移植手术时得到的人角膜纽状体用来证明慢病毒载体转导这些具有标记基因增强的绿色荧光蛋白基因的有丝分裂无能细胞的能力(图7)。在远离转导的角膜组织处剥下附着于德期密膜的内皮细胞，并用光学显微镜和荧光显微镜检查。角膜内皮为eGFP阳性，表明基因转移有效和获得表达(图7B)。还观察到在上皮层中原位转导和eGFP表达有效(图7C)。

总之，这些结果表明复制缺损型慢病毒载体能有效地将转基因转移到人角膜内皮细胞和上皮细胞中，并获得长期转基因表达。此载体可用于治疗角膜内皮或上皮疾患和移植前用于液体外修饰来供体角膜组织的遗传组成，以这样的方式永久地调节同种异体移植排斥的过程。

实施例5

眼增生性疾病的生长抑制基因治疗

人外周蛋白基因用作治疗性基因的一个实施例。已知人体内外周蛋白基因的遗传缺损可产生多种多样的残疾表型。使视网膜母细胞瘤摘除时手术切除的正常视网膜或视网膜色素上皮(RPE)组织接触缺乏治疗性基因或含有人外周蛋白基因的慢病毒载体。图8中的结果表明通过慢病毒载体外周蛋白基因被有效地转移到人视网膜组织中。

作为治疗性基因转移的另一实施例，采用了组成型活化形式的视网膜母细胞瘤基因(CA-rb)。本文披露的慢病毒载体介导了该组成型活化形式的视网膜母细胞瘤基因的有效转移(图9)。转移的CA-rb基因显示对人视网膜和脉络膜细胞(图10)和人晶状体上皮细胞(图11)的增值的剂量依赖性抑制作用。

慢病毒载体转移的组成型活化形式的视网膜母细胞瘤基因，还能抑制体内眼内细胞的增殖。在体内测试了两种模型的眼内增生性疾病(增生性玻璃体视网膜病和晶状体摘除术后后囊浑浊)。在3组家兔中诱发了增生性玻璃体视网膜病(图12)。一组末治疗，一组用缺乏CD-rb基因的慢病毒载体治疗，最后一组用玻璃体内递送的慢病毒CA-rb治疗。在前两组中注意到增生性玻璃体视网膜病和视网膜剥脱频率高(＞90％)，而在用CA-rb治疗的组中，视网膜剥脱的动物百分率明显较低(26％)。

图13显示的结果表明，体内慢病毒CA-rb对晶状体摘除术后后囊浑浊的过程有抑制作用。对3组家兔进行标准的晶状体乳化以摘除天然晶状体。第1组(组1)接着不作任何治疗，另2组用空的慢病毒构建物治疗(无治疗性基因，组2)或在白内障伤口缝合时将慢病毒CA-rb(组3)递送入完整的晶状体囊袋中。逐次检查动物后囊浑浊的存在。对存在的浑浊以1-5标度分级，1代表无浑浊，5代表浑浊严重足以妨碍用间接双目检查用眼镜看见视网膜。组1和组2(末处理和空载体)之间没有获得统计学上不同的结果，而观察到慢病毒CA-rb对后囊浑浊的产生有显著的抑制作下用。截止第28天，对照动物的平均浑浊评分为4.4，而用慢病毒CA-rb治疗的动物的平均浑浊得评为2.1。

实施例6

“双基因”慢病毒

构建了在两个克隆位点之间掺入IRES(内部核糖体进入位点)元件的一种新的慢病毒载体。IRES元件允许mRNA-核糖体结合和蛋白质合成。此主链可容纳两种不同的可表达基因。但在转导的细胞中产生单一信息，系IRES元件所致，所以该信息在功能上是双顺反子的，并可驱动两种不同蛋白质的合成。用这种方式，可将上述每种潜在的治疗性基因与一标记基因(如增强的绿色荧光基因-eGFP基因)连接，这样转导的细胞将同时被标记，并能表达感兴趣的治疗性基因。标记的细胞易于体外分离和体内观察。图15-31显示一些携带各种治疗性基因的慢病毒载体的基因图谱。因为近年来遗传工程和克隆领域中的普通科学家的总体技术水平有显著提高，所以此领域中普通技术人员能够不难地构建含有感兴趣的其它治疗性基因的慢病毒载体。

实施例7

抗新血管形成的基因治疗

使天然细胞(已知不表达治疗性基因的细胞)接触上述慢病毒载体24小时。接触2天后，从这些细胞中分离RNA，并用逆转录酶辅助的聚合酶链反应(RT-PCR)测试转基因的表达。图32显示从人皮肤微血管内皮细胞中分离的mRNA的内皮生长抑素-18/血管生长抑素融合基因的阳性RT-PCR产物。

证明了以上所示的体外慢病毒介导的基因转移后，然后检测其抑制体内新血管形成的能力。用以下方式诱发兔角膜组织中的新血管形成：

角膜基质内小袋的产生和浸有慢病毒的尼龙网的插入

用异氟醚(4升/分钟)和氧(2升/分钟)通过面罩麻醉家兔。将一滴丙美卡因置于大脑弯窿中用于局部麻醉。异氟醚减少到2.5升/分钟。将贝塔定(Betadine)置于大脑弯窿中30秒，用BBS(平衡盐溶液，Alcon公司)淋洗。将眼睑窥镜置于眼中。在12点钟2.8mm微角膜刀用来进入角膜间质。用Mcpherson钳将此间质内切口扩成5×5mm的间质袋，并用Iris扫描仪来回扫描。在两侧之一撑开12点钟切口，用Vannas剪刀作4.5mm开口。将浸有10μl慢病毒的4×4Amersham杂交尼龙网(Amersham Bioscientist RPN2519)插入事先形成的袋中。将一滴妥布霉素滴于角膜上。停止异氟醚，鼻给氧增加到4升/分钟。这样20分钟后家兔成功地解除全身麻醉，送回具有正常生活功能的笼内给家兔子每日两次皮下注射0.2cc丁丙诺啡(buprenex)(0.3mg/cc)2天，用于镇痛。家兔还接受一滴阿托品和一滴妥布霉素2天，用于术后睫状肌麻痹和抗生素治疗。术后第1天，每只家兔接受一滴局部丙美卡因麻醉，用0.12钳从角膜间质内袋中取出尼龙网。在两周后每天监测术后疼痛控制和护理。

碱诱发的新血管形成

最初手术后两周，使角膜接触浸有20μl1.0MNaOH的6mm Whatman#3滤纸圆片1分钟。所有角膜用BSS充分洗涤。家兔接受一滴阿托品和一滴妥布霉素2天，用于术后睫状肌麻醉和抗生素治疗。进行数字文件照相记录新血管反应。用裂缝灯检查测量新血管反应，在创伤后第1、3、5、7和10天记录钟点时间和血管的长度。通过如下所述的计算血管生长面积来定量测定新血管形成。

就评价角膜新血管形成的标准方法而言，设计了以下方案和公式来记录和比较碱灼伤后的新血管形成。新血管形成的面积的公式是这样得出的：计算以半径RT为边界的较大扇形面积，减去以被半径R2为边界的较小扇形面积。以半径RT为边界的较大扇形面积是钟点时间数除以12，并乘以πRT²。以半径R2为边界的较小扇形面积是钟点时间除以12，再乘以π(R2)²。两个扇形相减所得面积即是新血管形成的面积。

进行了共焦显微镜观察以记录增强的绿色荧光蛋白，包含在慢病毒双顺反子信息中的标记基因的表达。图33显示，证明在用慢病毒载体治疗的动物角膜小袋内存在eGFP的显微照相。

为了证明对新血管形成的抑制作用，如上述在动物中诱导新血管形成。用含Mig/IP10融合基因的慢病毒载体治疗后，观察到了抑制作用(图34)。如表1所示，在用Mig/IP10融合基因或用慢病毒转移的Kringle 1-5基因治疗的动物中，观察到新血管形成明显减少。

表1慢病毒基因转移后新血管形成的抑制

  基因  治疗动物的新血管形成  (mm)²  未治疗动物的新血管形成  (mm)²  Mig/IP10融合基因  57.0  132.2  Kringle 1-5  0.9  17.0

本用引用下列参考文献：

Naldini等；(1996)Science 272：263-267

Miyoshi等；(1997)Pro.Natl.Acad.Sci.USA 94：10319-10323。

本说明书中提及的任何专利和出版物表示与发明有关的领域内熟练技术人员的水平。此外，本文在相同程度上纳入这些专利和出版物作为参考，各单独的出版物是特别地和逐一指明有待纳入作为参考。

本领域熟练技术人员容易理解的是，本发明很适合实现目的和获得提及的结果和优点，以及本文原有的那些目的、结果和优点。本实施例与本文描述的方法、步骤、治疗、分子和特定化合物同时是优选实施例的代表，是示范性例子，不意味限制发明的范围。如权利要求范围限定的那样，在本发明的思路内，本领域熟练技术人员可对其中内容和其它用途作修改。