麦芽糖酸作为食物产品中的抗氧化剂

摘要

麦芽糖酸在食物和饲料产品中具有抗氧化作用。可以使用酶催化方法，从食物产品中已经存在的淀粉或麦芽糖直接产生抗氧化剂。抗氧化剂生产可在食物产品的分离部分上进行，由此可将食物产品的分离部分加回至食品生产方法或者最终的食物产品中。或者，可以通过向方法中加入相关酶来产生抗氧化剂作为食品生产方法的整合的部分。

说明书

发明领域

本发明提供使用酶方法用直接由食物产品中已存在的淀粉或麦芽糖产生的抗氧化剂保存食品和饲料产品的方法。本发明还提供从淀粉或含淀粉产品产生麦芽糖酸(maltobionate)的方法。

发明背景

防止食品和饲料产品的氧化降解对于保持这些产品的质量非常重要。产品中的氧化过程能导致颜色、气味、芳香上的变化或者其它器官感觉上不可接受的变化。此外，氧化可以引起对必需氨基酸的损害，并导致维生素的损失。具体地，包含多不饱和脂肪酸的食物产品易于氧化，可能产生腐臭的食物产品。

当食品分子，例如脂肪酸，在自由基、痕量金属(如Fe和Cu)或反应性氧种类(reactive oxygen species)(如单线态氧(singlet oxygen)、过氧化物或过氧化氢)存在的情况下与氧组合时会发生氧化反应。使用抗氧化剂可以抑制这些反应。通常使用的抗氧化剂的实例是丁基羟基苯甲醚(BHA)和丁基羟基甲苯(BHT)，其通常在富含脂肪和油的食品中使用，以及亚硫酸盐，其主要用作抗氧化剂，以防止或减少水果和蔬菜变色(discoloration)。然而，BHA和BHT当在以高浓度使用时容易产生肿瘤，并且因此可能对人类的健康是不安全的，并且已知亚硫酸盐会破坏维生素B。由于这些原因，通常优选生物或天然抗氧化剂，如生育酚(维生素E)、L-抗坏血酸、柠檬酸、蛋白黑素(melanoidin)、类黄酮和五倍子酸。也已经使用螯合剂，如EDTA、铁载体(siderohore)(来自微生物的铁螯合剂)、柠檬酸和乳糖酸解决与氧化有关的问题，由于它们具有防止痕量金属引起氧化的能力。

美国专利3,899,604披露了使用剧臭假单胞菌(Pseudomonas gravlolens)菌种，通过发酵氧化由麦芽糖产生麦芽糖酸，和麦芽糖酸作为食品添加剂的用途；麦芽糖酸略有酸味，还对包含麦芽糖酸的食物产品的粘度有贡献。此外，麦芽糖酸可以增强某些食物产品的天然气味和味道(增香剂)，如美国专利No.3,829,583所述。然而，未指示麦芽糖酸有助于食品中的抗氧化作用。

欧洲专利No.0 384 534 B1披露了使用洋葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)菌株，通过发酵氧化由麦芽糖产生麦芽糖酸。

氧化不仅是在长时间保存过程中的问题，而且在生产过程中也能引起产物的不期望的变化，特别是当生产过程中存在氧时。因此，在食品的生产过程中提供天然抗氧化剂的方法是理想的。

发明概述

本发明提供通过酶方法由食品或饲料中存在的淀粉或麦芽糖产生麦芽糖酸，从而阻止食品和饲料产品中的氧化反应的方法。

发明详述

根据本发明，通过麦芽糖酸可以在食品和饲料产品的制造过程中防止或阻止食品和饲料产品中的氧化反应。就我们所知，这是首次在产生过程中和产生后使用麦芽糖酸作为食品或饲料中的抗氧化剂。

此外，本发明提供由食品或饲料产品的淀粉组分产生麦芽糖酸的方法，麦芽糖酸在其中起抗氧化剂作用。因此，本发明的抗氧化剂可以直接由产品中的组分产生，从而提供100％天然抗氧化剂并省略单独制造和抗氧化剂添加步骤。

定义

术语“辅助物(adjunct)”应理解为谷物(grist)的一部分，所述谷物不是大麦麦芽。辅助物可以包含任何富含淀粉的植物材料，例如未发芽的(unmalted)谷物，如大麦、稻、玉米、小麦、黑麦、高粱和可容易发酵的糖和/或糖浆。

如本文所使用的，术语“自食品或饲料产生方法分离的部分”应理解为分离的部分，其基本包含分离出所述部分的方法的一部分中通常使用的所有成分。优选地，与其分离出所述部分的方法的一部分中通常存在的淀粉量相比，所述部分包含的淀粉量增加。所述部分可以在生产方法过程中的任何步骤获得，并且也可以是终产物。在期望淀粉量增加的情况中，可以向分离的部分加入额外量的方法的含淀粉成分或纯淀粉。

如本文所使用的，术语“谷物”应理解为含淀粉或糖的材料，其为啤酒生产的基础，例如大麦麦芽和辅助物。

本文中使用的术语“分离的酶”指具有所述酶活性的多肽，其中所述多肽至少20％纯，优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，最优选至少90％纯，并且甚至最优选至少95％纯，如通过SDS-PAGE确定的。

术语“麦芽”应理解为任何发芽的谷类谷物，特别是大麦。

本文使用的术语“麦芽糖酸”涉及麦芽糖酸(CAS Reg.No.534-42-9；4-O-α-D-吡喃葡萄糖基-D-葡糖酸)或其盐。合适的盐包括，但不限于，麦芽糖酸钠、麦芽糖酸钙、麦芽糖酸铵和麦芽糖酸钾。

术语“醪液”应理解为含淀粉浆料，其中包含浸于水中的谷物。

术语“纯麦芽糖”应理解为组合物，其仅包含麦芽糖、水、无机盐并可能包含缓冲剂，如无机盐(例如磷酸盐、碳酸盐、氢氧化物盐，等)，有机盐(例如磷酸柠檬酸盐(citrate phosphate)、乙酸钠，等)，和其它有机缓冲液(例如HEPES、Tris，等)。

术语“弱”碱和相对的“强”碱指碱解离的能力。在本上下文中，弱碱定义为pKb值为至少3.5的碱(对于双质子碱如CO₃^2-，此pKb值指第一步的数值)。

术语“麦芽汁”应理解为在糖化过程中提取谷粉后留下的未发酵液体。

酶

麦芽糖酸可以通过麦芽糖氧化而产生。氧化可以使用溴化物进行，但是在食品生产方法中这是不理想的。

在本发明中，麦芽糖到麦芽糖酸的转化是酶反应的结果，其中对于麦芽糖具有底物特异性的氧化还原酶催化转化。氧化还原酶是催化电子从一个分子转移至另一个分子的酶。脱氢酶和氧化酶属于氧化还原酶的酶类。通常，脱氢酶需要存在辅因子，例如NAD/NADP或黄素辅酶，如FAD或FMN，这对于氧化酶也可能如此。除非另外指明，下文和说明书全文所述的酶为分离的酶，必要时具有辅因子。

适用于本发明的氧化还原酶的一个类别是氧化酶，其催化涉及分子氧(O₂)作为电子受体的氧化/还原反应。在这些反应中，氧还原成水(H₂O)或过氧化氢(H₂O₂)。具体地，糖氧化酶催化麦芽糖转化为麦芽糖-δ-内酯，后者立即在水中分解形成麦芽糖酸。所述方法产生过氧化氢。净反应方案可描述为：

麦芽糖+O₂+H₂O→麦芽糖酸+H₂O₂(方程式1)

已知很多能将麦芽糖转化成麦芽糖酸的合适的糖氧化酶，并且技术人员可以得到这些酶。这些糖氧化酶的实例是醛糖氧化酶、纤维二糖氧化酶(EC1.1.99.18)、吡喃糖氧化酶(EC 1.1.3.10)，和己糖氧化酶(EC 1.1.3.5)。通过研究EC 1.1.3._、EC 1.2.3._、EC 1.4.3._和EC 1.5.3._或根据国际生物化学与分子生物学联合会(International Union of Biochemicstry and Molecular Biology)(IUBMB)命名委员会的推荐的相似酶类，本领域技术人员可容易地识别有用的糖氧化酶的其它实例。

优选的糖氧化酶是微生物糖氧化酶，特别是分离的糖氧化酶。

己糖氧化酶(EC 1.1.3.5)是能氧化几种糖的糖氧化酶，所述糖包括葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、纤维二糖和乳糖。属于己糖氧化酶类的酶是本发明中优选的酶。己糖氧化酶由几种海洋藻类物种天然产生。这些物种可在例如杉藻科(family Gigartinaceae)中发现，其属于杉藻目(order Gigartinales)。产生己糖氧化酶的属于杉藻科的藻类物种的实例是皱波角叉菜(Chondrus crispus)和红藻(Iridophycus flacci)。包括物种Euthora cristata的海萝目(order Cryptomeniales)的藻类物种也是适用于本发明的己糖氧化酶的可能来源。具体地，适用于本发明的己糖氧化酶例如提取自红藻(Iridophycus flaccidum)(Bean和Hassid，1956，J Biol Chem 218：425-436)或皱波角叉菜，或者如WO96/40935所述提取自Euthora cristata，WO96/40935进一步描述了从皱波角叉菜克隆并重组表达己糖氧化酶，如WO96/40935中SEQ ID NO：30和31所示。

纤维二糖氧化酶(EC 1.1.99.18)是能氧化几种糖的糖氧化酶，所述糖包括纤维二糖、可溶纤维低聚糖、乳糖、木二糖和麦芽糖。属于纤维二糖氧化酶类的酶也是本发明中优选的酶。纤维二糖氧化酶是由多种木材降解真菌产生的胞外酶，如白腐真菌黄孢原毛平革菌(Phanerochaete Chrysosporium)、褐腐真菌粉孢革菌(Coniophora Puteana)和软腐真菌如丛梗孢属菌种(Monilia sp.)、纤维素分解毛壳菌(Chaetomium cellulolyticum)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)(嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophila))、齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)和特异腐质霉(Schou等，1998，Biochemical Journal 330：565-571)。

其它合适的糖氧化酶可以源自，例如有丝分裂孢子核菌纲(Pyrenomycetes)如枝顶孢霉属(Acremonium)，具体地，以ATCC 34717保藏的点枝顶孢霉(A.strictum)或点枝顶孢霉T1(Lin等，1991，Biochimica et Biophysica Acta 1118：41-47)；或以IFO 31197保藏的A.potronii。在优选的方面，糖氧化酶获得自(Lin等，1991，Biochimica et Biophysica Acta 1118：41-47)以及JP5084074中披露的来源。

在另一个优选的实施方案中，糖氧化酶是获得自真菌的糖氧化酶，所述真菌属于微结节菌属(Microdochium)，更优选其中所述真菌是雪霉叶枯菌(Microdochium nivale)，并且甚至最优选其中所述真菌是以CBS 100236保藏的雪霉叶枯菌。在WO 99/31990中详细描述了分离自CBS 100236的氧化酶(WO 99/31990的SEQ ID NO：1和2通过提述并入本文)。

先前已经描述了通过在包含麦芽糖的底物上生长的假单胞菌属细菌的发酵而产生麦芽糖酸(US 2,496,297、US 3,862,005、US 3,899,604和EP384534)。本发明也可使用脱氢酶。这些脱氢酶系统可以分离自假单胞菌属，具体地分离自卵状假单胞菌(P.ovalis)、灰白色假单胞菌(P.schuylkilliensis)、剧臭假单胞菌(P.graveolens)(例如以IFO 3460保藏)、莓实假单胞菌(P.fragi)、碘假单胞菌(P.iodinum)、P.amyloderamosa(例如以ATCC 21262保藏)或洋葱假单胞菌(例如以CBS 659.88或CBS 658.88保藏)。

使用的氧化酶/脱氢酶的量通常将取决于特定的要求和特定的酶。氧化酶加入的量优选足以在特定时间内产生麦芽糖到麦芽糖酸的期望程度的转化。通常，约1至约10000OXU每kg底物的氧化酶加入是足够的，特别是约5至约5000OXU每kg底物，并且更特别地约5至约500OXU每kg底物。调整麦芽糖到麦芽糖酸的转化所需的特定酶的量是技术人员的公知常识。

在文献中，氧化酶单位(OXU)通常定义为在特定条件下氧化一微摩尔麦芽糖的酶量。然而，在本文提供的实例中，OXU定义为一mg纯氧化酶-相对于酶标准物测定。

在本发明的另一个方面，通过两个酶催化的反应产生麦芽糖酸。第一个反应使用淀粉酶，由食品或饲料生产过程中存在的淀粉组分形成麦芽糖。第二个反应如上述方面所述，将麦芽糖氧化成麦芽糖酸。这两个反应能同时或顺序进行。在优选的实施方案中，淀粉酶反应首先进行，然后是麦芽糖到麦芽糖酸的反应。

淀粉酶能水解淀粉形成寡糖作为主要产物，具体为麦芽糖，这是技术人员公知的方法。淀粉酶可以源自细菌或真菌，具体来自曲霉属(Aspergillus)的菌株，优选黑曲霉(A.niger)或米曲霉(A.oryzae)的菌株，或者源自芽孢杆菌属(Bacillus)的菌株。一些实例是α-淀粉酶，例如来自解淀粉芽孢杆菌，和淀粉葡糖苷酶，例如来自黑曲霉。商业产品包括BAN和AMG(Novo Nordisk A/S，Denmark的产品)，Grindamyl A 1000或A 5000(可由Grindsted Products，Denmark获得)和淀粉酶H和淀粉酶P(Gist-Brocades，The Netherlands的产品)。可以类似地使用β-淀粉酶或导致麦芽糖形成的其它淀粉降解酶。

在本发明的另一个方面，加入过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)以防止限制由糖氧化酶驱动的反应，并消除终产物中不期望的H₂O₂。过氧化氢酶是催化下述反应的酶：2H₂O₂→O₂+2H₂O(方程式2)。

如上所述，糖氧化酶依赖于氧，但是产生过氧化氢。向本发明的方法加入过氧化氢酶的优势是与氧一起提供糖氧化酶，并且同时去除具有强氧化性的过氧化氢。如果作为食品或饲料产生方法的整合的部分而产生麦芽糖酸，这就是特别恰当的。

技术人员已知很多合适的过氧化氢酶，例如，商业上可得到的过氧化氢酶，来自Novozymes A/S的

生产

通过发酵，例如使用生长在含麦芽糖底物上的假单胞菌属的细菌来产生麦芽糖酸是本领域公知的(US 2,496,297、US 3,862,005、US 3,899,604和EP384534)。此外，WO 99/31990描述了使用糖氧化酶将纯麦芽糖氧化成麦芽糖酸。

本发明的一个方面涉及麦芽糖酸的产生，通过加工食品或饲料生产中天然存在的淀粉和/或麦芽糖，在与实际的食品或饲料生产分开的反应中进行。用于产生麦芽糖酸的方法包括下述步骤：

i)获得可用于饲料或食品产生方法中的含淀粉和/或麦芽糖底物；

ii)通过酶反应将淀粉转化成麦芽糖；和

iii)通过酶反应将麦芽糖转化成麦芽糖酸。

可以纯化含淀粉部分，从而在转化成麦芽糖之前富集淀粉含量。步骤ii)中的酶反应优选由淀粉酶催化。如果步骤i)中的底物包含麦芽糖，则可以省略步骤ii)。步骤iii)中的酶反应由氧化还原酶/脱氢酶，优选由上述糖氧化酶之一，甚至更优选由上述己糖氧化酶之一，并且最优选由可获得自以CBS 100236保藏的雪霉叶枯菌的糖氧化酶催化。步骤ii)和步骤iii)可以作为一个步骤或者作为两步骤方法进行，其中可以向反应混合物一起加入淀粉酶和糖氧化酶，或者使淀粉酶在向反应混合物加入糖氧化酶之前以单独的步骤作用于淀粉。所述方法导致淀粉/麦芽糖几乎完全转化成麦芽糖酸，底物中优选80％，更优选85％，更优选90％，甚至更优选95％，最优选99％，并且甚至最优选100％淀粉和/或麦芽糖转化成麦芽糖酸。可以将麦芽糖酸以期望的量加回食品或饲料产品中。任选地，如果纯度不足的话，可以纯化在上述方法中获得的麦芽糖酸。

本方法的优势是使用的组分为食品或饲料生产中总要使用的那些组分，因此麦芽糖酸并未源自任何添加剂。优选地，获得自食品或饲料产品的包含淀粉和/或麦芽糖的部分包含5％-60％，更优选10％-40％，甚至更优选15％-30％，甚至更优选20％-25％的淀粉和/或麦芽糖。所述方法的另一个优势是来自食品或饲料产品的其它组分不会使方法复杂化。

由于食品或饲料产品中其它组分而使方法复杂的因素可以是例如由于糖氧化酶可能需要向反应混合物中加入氧而形成泡沫，这能在包含蛋白质的反应混合物中产生泡沫。

使用淀粉酶将淀粉转化成麦芽糖的条件通常在本领域中已知。需要时，技术人员如下所述能选择与麦芽糖转化成麦芽糖酸的条件相容的条件。

包含淀粉和/或麦芽糖的底物可以例如获得自食品或饲料产生方法，在所述方法中使用例如竹芋、大麦、木薯、玉米、玉蜀黍、小米、燕麦、马铃薯、稻、黑麦、西米、大豆、高粱、甘薯和/或小麦。天然存在淀粉和/或麦芽糖的食品产生方法是例如啤酒酿造、一些白酒或烈酒的生产、软饮料生产、烘培、炸薯片(chips)或小吃食品生产。具体地，在啤酒酿造方法中，麦芽糖天然存在，因为糖化(mashing)方法产生麦芽糖用于发酵。具体地，麦芽汁含有高麦芽糖含量。本发明的方法所使用的包含淀粉和/或麦芽糖的底物可以是如上所述包含纯淀粉的原材料，优选通过例如研磨或碾磨而粉碎并悬浮于液体中的原材料。或者，可以是获得自食品或饲料产生方法的部分，如醪液、麦芽汁、小吃食品、炸薯条和用于制备软饮料的制备物。优选地，本发明的方法所使用的包含淀粉和/或麦芽糖的底物不构成纯麦芽糖。

用于产生麦芽糖酸的方法必须在允许糖氧化酶将麦芽糖转化成麦芽糖酸的条件下进行。这些条件包括，但不限于，温度、pH、氧、糖氧化酶的量和性质，其它添加剂例如过氧化氢酶和反应/温育时间。

合适的温育时间应允许一定程度的麦芽糖到感兴趣的麦芽糖酸的转化。通常，合适的温育时间选自1/2小时到3天的范围，优选地，2小时到48小时，更优选从5小时到24小时，最优选从8小时到18小时。

氧是本方法中的重要因素，因为麦芽糖到麦芽糖酸的转化消耗氧(参见上面的等式1)。因此，如果在酶反应方法中监控氧，通常可观察到氧量的初始下降，例如如果恒量供气时，当酶反应终止时，氧量将回到大约初始水平。当氧回到初始水平的大于90％时，酶反应已经停止或者至少显著减慢，说明所有底物(例如淀粉、糊精和/或麦芽糖)已被处理成为麦芽糖酸。因此，合适的温育时间可优选至少持续直至生产批次中氧水平回到初始水平的大于90％，特别是如果期望麦芽糖的最大转化时。或者，能通过需要保持pH恒定所需的碱量来监控反应。当需要维持pH所需的碱量下降时，表明反应已经停止或至少显著减慢。然而，酶反应的下降可不仅仅由于底物的耗尽。酶随时间的稳定性也是可能影响反应的参数。因此，如果酶随时间降解，这也可能引起反应减慢。在这种情况下，底物的加入不会导致氧和pH重新下降。

合适的氧来源包括大气空气(约20％氧)、富氧的大气空气(氧含量＞20％)和纯氧。在高于1大气压的压力下运行方法可增加氧的溶解度，并且在适当时候可为优选的。可以向方法供氧，例如在温育方法中连续将空气混合入反应混合物。

提供O₂的另一个选择是通过在存在过氧化氢酶的情况下加入H₂O₂(参见上面的方程式2)。或者，可以使用由糖氧化酶天然产生的H₂O₂。当使用固定化酶进行方法时，使用H₂O₂作为氧来源可为特别优选，在这种情况下氧的加入更困难，或者例如在包含蛋白质的反应混合物中，由于通过将空气混合入反应中来加入氧而导致形成泡沫是一个问题。可以在任何合适的时间例如与糖氧化酶一起加入过氧化氢酶，或者在反应方法中加入，这时O₂水平下降，优选在温育开始时(时间＝0)加入过氧化氢酶。与糖氧化酶一起加入过氧化氢酶的优势是氧需求可以显著降低(达到50％)。因此，供氧，例如以空气形式供氧，可以显著降低。实际上，通过与H₂O₂一起加入足量的过氧化氢酶可能完全省略供氧。额外加入的H₂O₂可以源自任何商业来源。

因此，本发明的优选实施方案是通过加入过氧化氢酶获得麦芽糖氧化成麦芽糖酸所需的基本上所有的氧，所述过氧化氢酶通过转化可用的H₂O₂而产生所需的氧。如果H₂O₂的量限制了方法，则可以加入额外的H₂O₂。

在本上下文中，使用表述“基本上所有的氧”描述酶反应充分作用所需的氧供应，并且特别地，不需要在方法过程中主动地加入额外的氧。

在优选的实施方案中，加入过氧化氢酶的量与无过氧化氢酶的相似方法相比降低了H₂O₂浓度。更优选地，向如本文所述方法中加入的过氧化氢酶量是与可比的对照方法相比足以获得H₂O₂量的至少25％、50％、75％、85％或95％降低，所述对照方法中唯一可比的差异是未加入过氧化氢酶；甚至更优选地，向如本文所述的方法加入的过氧化氢酶量是与可比的对照方法相比足以获得H₂O₂量的100％降低，所述对照方法中唯一可比的差异是未加入过氧化氢酶。优选地，加入的过氧化氢酶量还可改进麦芽糖到麦芽糖酸的转化程度。

温育温度通常依赖于使用的糖氧化酶，并且通常根据糖氧化酶的最适反应温度而选择。然而，因为氧溶解度随着温度的增加而下降，所以要考虑其它因素来获得最优方法。技术人员知道如何相对于例如酶活性和氧溶解度平衡最适温度。通常，合适的温度为约0℃至约99℃的范围中，更优选5℃至90℃的范围中，甚至更优选在15℃至85℃的范围中，最优选在25℃至80℃的范围中，甚至最优选在30℃至60℃的范围中。

最适pH可以依赖于使用的糖氧化酶而变化。然而，来自雪霉叶枯菌的糖氧化酶的动力学分析(Nordkvist等，2007，Biotechnol Bioeng 97：694-707)表明，使用强碱(NaOH)可以影响糖氧化酶的稳定性。此外，WO 97/004082描述了当方法在稳定的pH进行时，使用糖氧化酶可以获得增加的乳糖醛酸的产量(yield)。因此，为了增加本方法的麦芽糖酸产量，可为理想的是在麦芽糖转化成麦芽糖酸的过程中(上文的步骤iii)，通过加入足够的碱将pH维持在稳定水平。在特定的实施方案中，通过加入碱，将稳定的pH水平维持在约3.0至约9.0的范围中。可使用任何碱将pH维持在指定的范围内。原则上，本方法可以使用能中和所产生的酸的任何物质。技术人员了解多种能用于本发明的方法中的碱，例如强碱如Ca(OH)₂、KOH、NaOH和Mg(OH)₂。在优选的实施方案中，使用弱碱或碳酸盐将pH维持在稳定水平。弱碱的实例包括，但不限于，CaCO₃、Na₂CO₃、K₂CO₃、(NH₄)₂CO₃和NH₄OH。目前，优选的弱碱是NH₄OH和Na₂CO₃。

对于感兴趣的特定方法，优选的稳定pH依赖于很多因素，如技术人员所理解的。例如，如果食物产品是啤酒，麦芽汁的生产pH已知为约5.0至5.7，优选约5.1至5.3。因此，优选将pH维持在约5.3的稳定水平，如pH 5.0至5.6。对于其它食品/饲料产品，优选的pH范围可为pH 3.0至4.0的范围中，例如对于果汁或软饮料如可乐；或者在4.0至5.0的范围中，例如啤酒或蛋黄酱或沙律汁；或者在5.6至6.5的范围中，例如肉制品；或在从6.6至7.5的范围中，例如乳和蛋产品。

应了解的是，在进行的酶转化之后或其结束时，还可以将根据本发明的麦芽糖酸产品或包含麦芽糖酸的组合物的pH调至优选的pH水平。例如当已经实现麦芽糖的95％的期望转化时，可以使pH下降至期望水平。

在本上下文中，“稳定pH水平”可广义地理解为通过加入碱，在方法过程中将pH控制和维持在特定范围内，或者接近/处于特定值。在酶方法过程中pH的控制和调整/维持是标准步骤，其能以非常高的精确度进行。因此，稳定的pH可为维持在恒定水平的数值，变动小于1.5pH单位，优选小于1.0pH单位，更优选小于0.5pH单位，更优选小于0.3pH单位，甚至更优选小于0.2或0.1pH单位。由此可对于根据本发明的特定酶方法确定最优范围，并且可以在这个范围内以所述精确度控制和维持pH。在本发明的方法中，合适的特定pH范围或特定的pH值选自约pH 3至约pH 9的范围内。

优选从酶反应开始如本文所述将pH维持在稳定的pH水平。换句话说，在向包含麦芽糖的产品加入氧化酶后立即加入碱，以维持如本文所述的稳定的pH。

特别地，如果期望麦芽糖的最大转化，则将pH维持在如本文所述的稳定水平一段时间，其至少持续至反应混合物的氧水平回到初始水平的多于90％，或者用于保持pH恒定的碱量与期望的转化程度相对应。

优选地，将pH维持在如本文所述的稳定的pH水平一段时间，30分钟到3天，优选2小时到48小时，更优选5小时到24小时，最优选8小时到18小时。

在本发明的特定实施方案中，麦芽糖到麦芽糖酸的转化在获得自糖化方法的麦芽汁批料上进行。包含麦芽糖酸的麦芽汁可以用作系列麦芽汁批料的成分用于啤酒生产。

在本发明的另一个特定实施方案中，淀粉到麦芽糖到麦芽糖酸的转化在糖化方法之前在醪液批料上进行。方法可以包括将淀粉酶与糖氧化酶一起加入。包含麦芽糖酸的醪液可以用作系列糖化方法中的成分。

本发明的特定方面涉及在将麦芽糖到麦芽糖酸的酶转化中获得增加的产量和/或减少的反应时间的方法。方法由下述步骤定义：

i)向包含麦芽糖的底物加入糖氧化酶；

ii)在允许糖氧化酶将麦芽糖转化成麦芽糖酸的条件下温育底物；和

iii)通过加入碱，在步骤ii)的过程中将pH维持在约3.0至约9.0的范围中。

在这个特定的方面，用于麦芽糖酸生产的底物可以构成纯麦芽糖。优选地，通过使用例如如上所述的淀粉酶的酶反应，将例如来自饲料或食品产生方法的淀粉转化成麦芽糖而获得底物。

明显地，本发明公开的方法本身可用于麦芽糖酸的工业生产。然而，这些方法还可以形成用于生产食品或饲料产品的制造方法的一部分，此时在生产过程中天然存在麦芽糖。

本发明的另一个方面涉及通过加工天然存在于方法中的淀粉和/或麦芽糖而在食品或饲料产生方法中直接(原位)产生麦芽糖酸。因此，在这个方面，麦芽糖酸是在食品或饲料产生过程中如此形成，而不是在如上所述的单独反应中形成。用于产生麦芽糖酸的方法(其中所述方法整合入饲料或食品产生方法中)包括以下步骤：

i)向食品或饲料产生方法中加入氧化还原酶或脱氢酶，优选糖氧化酶；

ii)在允许麦芽糖到麦芽糖酸的酶转化的条件下保持所述方法；

iii)继续进行食品或饲料产生方法。

可以通过淀粉降解反应进行步骤i)中的酶反应，例如由淀粉酶催化，所述淀粉酶可为内源提供的(例如来自已经存在于方法中的麦芽)，或者外源提供的(例如通过在步骤i)的酶之前与步骤i)的酶一起加入)。允许进行酶转化的糖氧化酶和条件基本上与上述相同。然而，对于最适温度，应该考虑到反应在食品/饲料产生方法中进行。因此，这样的方法的优势为，糖氧化酶能在最适温度进行。

在食品或饲料产生方法过程中直接产生麦芽糖酸的优势是一旦将方法优化，将不再需要为产生麦芽糖酸而进行的单独产生步骤。

在本发明的特定实施方案中，在啤酒生产的子方法，如糖化方法或发酵方法过程中，通过向该子方法加入糖氧化酶和可能的过氧化氢酶而产生麦芽糖酸。麦芽糖到麦芽糖酸的转化可以在糖化前，或者在糖化方法过程中或在发酵前烹煮麦芽汁后，或者甚至在发酵过程中在醪液(谷物+流体)中进行。然而，后者需要食品准用的(food approved)酶。然而，麦芽汁中麦芽糖的存在是将麦芽汁发酵成为啤酒所需要的。因此，麦芽糖到麦芽糖酸的转化必须经过优化，使得麦芽糖仅部分转化成麦芽糖酸。优选地，麦芽汁包含高达2％麦芽糖，更优选高达5％麦芽糖，并且最优选高达10％麦芽糖。

糖化方法在温度上通常采用受控的逐步增加，其中每个步骤相对于其他更偏好一种酶作用，最后降解蛋白质、细胞壁和淀粉。糖化温度曲线(profile)通常在本领域中已知。在本发明中，麦芽糖到麦芽糖酸的转化优选与55℃-66℃的糖化(淀粉降解)步骤相关发生。在优选的实施方案中，糖氧化酶在这个温度范围有活性。或者，糖化方法可以在较低的温度保持足够长的时间，以允许淀粉转化成麦芽糖，再转化成麦芽糖酸，在所述温度糖氧化酶有活性。在这个步骤可以外源加入淀粉酶，促进淀粉转化成麦芽糖。

在本发明的另一个实施方案中，在啤酒发酵后产生麦芽糖酸。在这种情况下，需要的麦芽糖的量必须与糖氧化酶和可能的过氧化氢酶一起提供，因为在发酵过程中所有可用的麦芽糖都已被同化。

在本发明的另一个实施方案中，食物产品是特征为具有高淀粉含量，即＞25％，更优选高于50％，和高脂质含量，即＞10％，更优选高于15％的小吃食品。淀粉酶、糖氧化酶和可能的过氧化氢酶可以与常规成分一起加入小吃食品中，所述常规成分例如蛋白质，如乳品或乳粉、麸质(gluten)和大豆；蛋类(完整的蛋、蛋黄或蛋白)；油酥(shortening)如粒状脂肪或油；还原剂如L-半胱氨酸；糖；盐如氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙。直接在小吃食品中产生麦芽糖酸可以在一定程度上取代常规的抗氧化剂如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾、偶氮二甲酰胺(azodicarbonamide)(ADA)或过硫酸铵。或者，方法可以按照本发明的第一方面进行，其中向来自小吃食品生产的淀粉材料的批料中加入淀粉酶、糖氧化酶和可能的过氧化氢酶。在这种情况下，可以确保该批料中麦芽糖到麦芽糖酸的高转化率并且该批料的一部分可以加回至小吃食品产生中。

麦芽糖酸纯化：

任选地，可能以任何合适的方式纯化麦芽糖酸，以获得具有期望程度的麦芽糖酸纯度的麦芽糖酸产品或包含具有期望程度的麦芽糖酸纯度的麦芽糖酸的组合物。

技术人员知道如何进行麦芽糖酸的纯化，并且依赖于感兴趣的特定需要，可以获得包含至少70％麦芽糖酸，至少80％，至少90％麦芽糖酸或甚至至少95％或至少99％麦芽糖酸的组合物。

用于纯化麦芽糖酸的合适方法包括过滤、离子交换、浓缩和干燥。

包含麦芽糖酸的组合物可以用于食物产品例如食物添加剂或食物成分的生产，特别是作为食物产品中的抗氧化剂。

麦芽糖酸在食品和饲料产品中的用途

本发明还涉及麦芽糖酸作为食品或饲料产品中抗氧化剂，特别是作为螯合剂的用途。

在本发明的一个方面，以有效量向食品或饲料产品中加入麦芽糖酸。技术人员能鉴定在食品或饲料产品中获得抗氧化作用所需的麦芽糖酸的量。

还可以如上文所述在生产方法过程中提供麦芽糖酸。在生产方法不天然包含淀粉或麦芽糖的情况中，可以在方法的过程中加入麦芽糖酸。或者，可以向最终的食品或饲料产品加入麦芽糖酸。

在本发明中，向食品或饲料产品加入麦芽糖酸的目的是其抗氧化作用，而不是对食物产品粘度的影响，也不是其增强某些食物产品的天然气味和味道的能力(增香剂)。

实施例

实施例1

麦芽糖酸的产生

通过由糖氧化酶(M.Nivale CBS 100236，如WO99/31990中所述)和过氧化氢酶(Catazyme 25L，Novozymes，Denmark)催化的氧化从麦芽糖产生麦芽糖酸钠。酶剂量为：糖氧化酶400mg酶蛋白质/kg麦芽糖和，过氧化氢酶6g/kg麦芽糖。将麦芽糖以10％的浓度在38℃溶解。使用包含3L溶液的搅拌反应器进行反应。在反应过程中，以1L/分钟加入大气空气，并且通过连续加入1M Na₂CO₃溶液而将pH恒定保持在6.4。总反应时间为17小时。在反应过程中，基本上所有的麦芽糖都转化成麦芽糖酸。

实施例2

通过铁还原抗氧化力(FRAP)测定法测量麦芽糖酸的抗氧化作用

简言之，FRAP测定法如下起作用：将Fe³⁺-三吡啶基三嗪(TPTZ)复合物在低pH还原成Fe²⁺-TPTZ。亚铁(Fe2⁺)形式为蓝色，并且能在593nm通过分光光度计测量。方法用已知浓度的Fe2⁺溶液校准。吸光度越高意味着抗氧化状态越高。

对于FRAP测定法，由下述组分制备作用试剂：

乙酸盐缓冲液：3.1g CH3COONa·3H2O和16mL浓CH3COOH于约800mL水溶液中。核对pH为3.6。否则用NaOH/CH3COOH调整。加水至1L。

TPTZ溶液：10mmol/L 2，4，6-三(2-吡啶基)-s-三嗪(TPTZ)于40mmol/L HCl中。

Fe(III)溶液：20mM Fe(III)CL₃·6H2O。

作用试剂(每天制备)：50mL乙酸盐缓冲液+5.0mL TPTZ溶液+5.0mLFe(III)溶液。

通过向2mL深色eppendorf小瓶中的1.5mL作用试剂加入50μL样品/标准/空白，然后在热混合仪中在37℃温育30分钟而进行测定。样品由不同浓度的麦芽糖酸组成，标准包含Fe2+和抗坏血酸，并且空白是水样品。一式三份进行测定。立即读取593nm处的吸光度，吸光度越高则抗氧化状态越高(↑Abs→抗氧化剂↑)。结果示于表1中。

表1：FRAP中麦芽糖酸钠(g/L)在593nm处的吸光度(Abs)

麦芽糖酸通过还原Fe(III)而表现出抗氧化能力，并且因此由于亚铁-三吡啶基三嗪复合物而使吸光度改变。测定显示清晰的抗氧化剂剂量响应作用。

实施例3

糖氧化酶和/或过氧化氢酶在啤酒麦芽汁中的抗氧化作用

在53℃在250g水中由经过充分修饰的大麦麦芽50g产生啤酒麦芽汁。使用以下温度谱将大麦麦芽制成醪液：52℃30分钟，以1℃/分钟增加进行11分钟，63℃30分钟，以1℃/分钟增加进行9分钟，72℃30分钟，以1℃/分钟增加进行6分钟，78℃15分钟，然后冷却至20℃。

通过向麦芽汁加入糖氧化酶和/或过氧化氢酶而进行一系列实验，并与对照样品比较。在糖化步骤之前加入酶。根据以LOXU测量的活性配入糖氧化酶，其中一LOXU对应于1mg酶蛋白。根据以CIU测量的活性配入的过氧化氢酶。1CIU是在pH＝7.0和T＝25℃每分钟分解1微摩尔H₂O₂的酶量。

为了测量糖氧化酶和/或过氧化氢酶的抗氧化能力，向所有样品加入1mMFe²⁺。使用二甲酚橙复合物测定法(XO-测定法)间接测量氧化。在这个测定法中，麦芽汁中的过氧化氢将二甲酚橙复合物中的Fe²⁺氧化成Fe³⁺，其与二甲酚橙形成有色复合物。可以通过分光光度计测量氧化的复合物，吸光度越低则抗氧化状态越高(↓Abs→抗氧化剂↑)。

由下述组分制备XO作用试剂：

A：2.5mM六水合硫酸亚铁铵，1.0mM二甲酚橙四钠盐(XO)于1250mMH₂SO₄中。

B：4.89mM丁基化的羟基甲苯(BHT)于甲醇中。

XO作用试剂：将1份A和9份B混合。如果保存在深色瓶中可在冰箱中稳定1个月。

通过向900μl XO作用试剂中加入100μl样品而开始测定。在室温搅拌温育30分钟。在20℃以14000rpm将每个样品离心10分钟。在560nm用分光光度计测来上清液的吸收。

由于有色XO复合物及Fe2+氧化成Fe3+的增加，所有样品中的吸光度都增加。具有50LOXU的麦芽汁样品与对照相比防止氧化的形成(对照的吸光度＝0.410，而对于50LOXU则为0.257)。当剂量为一半即25LOXU时作用不良(吸光度＝0.421)，然而可通过与600CIU过氧化氢酶组合而改善(吸光度＝0.308)。1200CIU的过氧化氢酶也可防止形成有色复合物(吸光度＝0.264)，并且作用是剂量依赖型的，因为600CIU与对照几乎没有不同(吸光度＝0.439)。