一种具有延时保存效果的供心保存液及其制备方法

摘要

本发明公开了一种具有延时保存效果的供心保存液及其制备方法，氯化钠4.68g；氯化钾1.86g；氯化镁0.57g；氯化钙0.01g；葡萄糖2.18g；甘露醇0.91g；胰岛素10μg；PEG-20 10g；速尿50mg；PGE1 5μg；组氨酸11.52g；双蒸水为余量；制备方法为将800ml双蒸水加入大于1000ml容器中，再依次加入氯化钠4.68g、氯化钾1.86g、氯化镁0.57g、氯化钙0.01g，搅拌至颜色变清晰；再加入组氨酸11.52g、葡萄糖2.18g、甘露醇0.91g、PEG-20 10g，搅拌至颜色变清晰；然后加入胰岛素10μg、速尿50mg、PGE1 5μg，搅拌至颜色变清晰；将溶液的pH调至7.65，渗透压调至310～315mOsm/L，双蒸水定容至1000ml，放置4℃低温保存。本发明的优点：具有良好较长时间(10小时)供心保存效果；含微量钙离子可避免“钙反常”现象；预防细胞内酸中毒并促进能量再生；预防低温下心肌血管挛缩。

说明书

【技术领域】

本发明涉及器官保存液领域，具体地说，是一种具有延时保存效果的供心保存液及其制备方法。

【背景技术】

心脏移植供体心脏的保护效果直接影响移植的存活率，对移植后的远期效果也有重要的影响。目前，供心停搏灌注后低温下保存仍然是最主要的临床应用方法。但有效保存时间较少超过4～6小时。探索有效的保存液是改善单纯低温保存效果的关键。

心脏移植中的心肌保存液目的在于防止低温条件下的细胞发生肿胀，预防细胞内酸中毒，减少间质的水分，减少氧自由基的生成及损害，为细胞产生能量提供基质，促进再灌注早期高能磷酸盐的产生。保存液的组成主要包括离子成分，胶体，非渗透性物质，缓冲对，能量代谢物质及一些添加物。常用的供心保存液有Stanford液、UW液、Thomas液(这三种保存液组成见附表)等。

保存液中的离子成分主要是K⁺，Na⁺，Mg²⁺，C^a+，Cl^-等。保存液一般分为两种：细胞内液型保存液Na⁺浓度小于70mmol/L，K⁺浓度在30～125mmol/L之间。Stanford液和UW液属于这一类。细胞外液型保存液一般Na⁺浓度大于或等于70mmol/L，K⁺浓度在5～30mmol/L之间。Thomas液属于这一类。保存液中的离子成分主要是通过降低跨膜K⁺梯度导致心肌细胞膜快速去极化使心脏的电和机械活动的终止，减少心肌能量的消耗。但是研究表明高钾会损伤血管内皮依赖舒张功能，引起冠脉痉挛，影响心肌灌注和损伤心肌。高钾还导致细胞外的钙内流增加，使心室壁的紧张度增加，导致心肌挛缩，加速高能磷酸键的消耗。另外Stanford液和UW液中不含钙离子，无钙主要防止钙超载引起的细胞损害和线粒体损害。而研究发现无钙灌注停跳的心脏，再灌注后却出现细胞浆内钙过多积聚，过多钙心肌处于强直收缩状态，这一现象称为“钙反常”。

保存液中所含胶体和非渗透性物质能产生渗透压，可对抗Na+的内流趋势，减轻细胞水肿。UW液中含有大量大分子物质如羟乙基淀粉，乳糖醛酸、棉子糖等，可以有效的维持细胞外的渗透压，达到防止细胞水肿的目的。但这些大分子物质增加了保存液的黏度，会影响保存液的灌注效果，损伤内皮细胞。有人研究发现，当保护液渗透压高于359mOsm/L或低于277mOsm/L，心功能恢复率大大降低。可见保存液的渗透压只有在适当的范围内才能达到对心肌保护的要求。

糖酵解是心肌在无氧情况下唯一的能量来源，pH下降及其它代谢产物积聚抑制糖酵解过程，因此保存液中良好的缓冲系统对预防细胞内酸中毒促进能量的再生有重要的作用。UW液中的组氨酸-盐酸缓冲系统，有较强的缓冲能力，且组氨酸为有效的非渗透性因子，可防止内皮细胞肿胀。并且UW液中的胰岛素成分，促进了能量物质的代谢。

临床上常用的三种供心保存液Stanford液、UW液、Thomas液在保存效果方面各有利弊，但大多有效保存时间很少超过4～6小时，需要研制有效保时间、保存效果更好的供心保存液。

中国专利公开号CN1748499公开了肺保存液，将乌司他丁运用于器官保存方面，用于减少器官移植中的缺血再灌注损伤、延长器官移植的保存时间，减少保存期的损伤，降低移植后原发性无功能的发生率，减少保存损伤而导致的排斥反应，从而从总体上改善器官移植的近期和远期效果。中国专利公开号CN1633848公开了一种肾脏保存液，该保存液具有高渗、酸碱度稳定、能有效防止缺血再灌注损伤等优点，能够有效保存肾脏达72小时。中国专利公开号CN1176738公开了一种配制新的多器官保存液的方法及其制品，通过加入了低分子右旋糖酐-40、蔗糖和钙离子拮抗剂，去掉了原来某些添加成分，并将pH值调至偏碱性。中国专利公开号CN1742574公开了器官保存液及其制法和应用，该保存液含有可溶性TNF受体及可溶性IL-1受体或者表达所述受体的载体。目前，未见具有延时保存效果的供心保存液及其制备方法的报道。

【发明内容】

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有延时保存效果的供心保存液及其制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种具有延时保存效果的供心保存液，在1000ml器官保存液中，组分分别为，

氯化钠  4.68g；    氯化钾  1.86g；    氯化镁  0.57g；

氯化钙  0.01g；    葡萄糖  2.18g；    甘露醇  0.91g；

胰岛素  10μg；    PEG-20  10g；      速尿    50mg；

PGE1    5μg；     组氨酸  11.52g；   双蒸水  余量；

所述的PEG-20是聚乙二醇；所述的PGE1是指前列腺素E1；

一种具有延时保存效果的供心保存液的制备方法，包含具体步骤如下，

按照1000ml配置量的具体步骤如下，

(1)将800ml双蒸水加入大于1000ml容器中，再依次加入氯化钠4.68g、氯化钾1.86g、氯化镁0.57g、氯化钙0.01g，搅拌至颜色变清晰；再加入组氨酸11.52g、葡萄糖2.18g、甘露醇0.91g、PEG-2010g，搅拌至颜色变清晰；然后加入胰岛素10μg、速尿50mg、PGE15μg，搅拌至颜色变清晰；

(2)将溶液的pH调至7.65，渗透压调至310～315mOsm/L，双蒸水定容至1000ml，放置4℃低温保存用。

本发明一种具有延时保存效果的供心保存液及其制备方法的积极效果是：

①低钾(25mmol/L)既可使心脏快速停搏又对心肌无明显损害，而Stanford液和UW液中的高钾会造成心肌和冠脉血管的损伤；

②含微量钙离子(0.1mmol/L)可避免“钙反常”现象；

③保留了UW液中具有较强缓冲能力的L-组氨酸，能预防细胞内酸中毒并可促进能量的再生；

④添加的聚乙二醇(PEG-20)作为高分子胶体物质预防心肌间质水肿，PEG-20被研究发现限制接近50％巨噬细胞流入，并且可以自发的绑定在细胞或组织表面，通过阻止与其他物质的接触达到立体性的稳定表面作用；这种“免疫掩饰”的优点是直接改良了供体组织的内在免疫原性，有利于减少移植排斥反应的损伤作用；聚乙二醇被认为是能用于保存液中的一种很好的高分子胶体物质；

⑤前列腺素E1(PGE1)是内源性活性物质，具有扩张血管、抑制白细胞和血小板聚集、保护血管内皮细胞、增强红细胞变形能力等作用，PGE1本身尚具有膜稳定作用，能阻止细胞内外离子的异常分布，避免钙超负荷，保证线粒体合成ATP功能，可预防低温下心肌血管挛缩；

⑥我们前期研究在灌注液中加入速尿则可有效地减轻组织水肿获得良好的保存效果。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种具有延时保存效果的供心保存液及其制备方法的具体实施方式。

实施例1

供心保存液(SH液)的制备(以配制1000ml为例)：

原材料的准备：氯化钠4.68g；氯化钾1.86g；氯化镁0.57g；氯化钙0.01g；葡萄糖2.18g；甘露醇0.91g；胰岛素10μg；PEG-2010g；速尿50mg；PGE15μg；组氨酸11.52g；足量双蒸水。

制备过程具体步骤如下：

将800ml双蒸水加入＞1000ml容器中，再依次加入氯化钠4.68g、氯化钾1.86g、氯化镁0.57g、氯化钙0.01g，搅拌至颜色变清晰；再加入组氨酸11.52g、葡萄糖2.18g、甘露醇0.91g、PEG-2010g，搅拌至颜色变清晰；然后加入胰岛素10μg、速尿50mg、PGE15μg，搅拌至颜色变清晰；pH调至7.65，渗透压调至310～315mOsm/L，双蒸水定容至1000ml，放置4℃低温保存用。

采用离体鼠心非循环式Langendorff灌流功能测试模型，通过与常用的3种供心保存液(Thomas液、Stanford液、UW液)相比较，研究自行设计的一种供心保护液(SH液)较长时间(10小时)4℃保存离体鼠心的保存效果。

受试对象：雄性Wistar大白鼠，体重200～250g

根据所用保护液成分不同分组为：

组1：Thomas液停搏并保存10小时组(STS-10)；

组2：Stanford液停搏并保存10小时组(STA-10)；

组3：UW液停搏并保存10小时组(UW-10)；

组4：自制液(SH液)停搏并保存10小时组(SH-10)。

实施过程：

大白鼠，称重，2％戊巴比妥钠0.5-0.7ml经腹腔注射。麻醉后，取仰卧位固定，经左股静脉注入肝素(3mg/Kg)，迅速开胸，于主动脉与右锁骨下动脉交界处离断主动脉，切除心脏。立即把心脏放入含有冷KHB液(4℃)的平皿中，用冷KHB液冲掉残留在主动脉内的血液，插主动脉灌注管并固定(灌注管的末端不应接触主动脉瓣)，将心脏迅速移至Langendorff灌流装置上并开始灌流。灌流压为90cmH₂O(8.32Kpa)。从开胸到灌流开始要在50--70秒内迅速完成，超过80秒钟则放弃。心脏复跳后3分钟，用电刺激仪起搏心脏(阳极置于右心耳，阴极固定于右心室。刺激频率为5Hz(300次/分钟)，刺激波形为方波(40mv)。切开右心耳，经右心房、二尖瓣将带有测压导管的球囊送入左心室，测压管的另一端接压力传感器，后者与电生理多导记录仪连接。测定左室压力时经三通接头往球囊内注蒸馏水40--60μl，以保持充盈此球囊容积时的左室舒张末压力为10mmHg(每1例保存前、后的球囊内注水量保持一致)。每隔5分钟测定心脏功能观察指标一次，包括①.心率(HR)②.左室舒张末压力(LVEDP)③.左室收缩压力(LVP)④.左室产生压(LVDP)＝LVP-LVEDP⑤.左室压力微分(+dp/dt)⑥.冠脉流量(LF)。冠脉流量的测定：收集经右心房流出的液体，每分钟收集的液体量为冠脉流量(ml/min)。灌流至30分钟时，如果鼠心收缩无力，有心室纤颤左室产生压＜70mmHg，则放弃。在30分钟时，停止心脏灌流，立即改为灌注心脏停搏液，压力为75cmH2O(7.36Kpa)，停搏液温度4℃，心脏同时表面降温(4℃)，灌注3分种后，置心脏于相应的保存液中。恒温(4℃)。保存6小时或10小时后，心脏恢复灌注(灌注方法同停搏前的方法)，再灌30分钟时，测定心脏功能，切取左心室壁组织，均匀切开2份迅速液氮冷冻保存，以备作能量代谢指标的测定。

对实施例1所测定指标结果如下：

表1SH等4种液体保存10小时后再灌注30分钟时的心功能(X±SD)

与SH-10组相比，^*P＜0.05

表2SH等4种保存液保存10小时再灌注30分钟心功能的恢复率(％)(X±SD)

与SH-10组相比，^*P＜0.05

表3SH等4种液体保存10小时再灌注30分钟时心肌高能磷酸盐的含量(X±SD，μmol/L)

与SH-10组相比，^*P＜0.05

表4各实验组保存后再灌注30分钟时左室心肌干/湿重比(％)(X±SD)

与SH-10组相比，，·P＜0.05

结果分析如下：

1.心功能恢复：SH液组左室等容收缩的舒张末压(LVDEP)明显低于Thomas液组和Stanford液组(p＜0.05)，而与UW液组相接近(p＜0.05)；而SH液组的左室产生压(LVDP)和左室正压力微分(+dp/dt)明显高于Thomas液组及Stanford液组(p＜0.05)，与UW液组比较无明显差异(p＞0.05)，请参见表1。另外，从保存后左室LVDP和+dp/dt的恢复率看，SH液组LVDP和+dp/dt的恢复率也明显好于Thomas液组和Stanford液组(p＜0.05)，与UW液组相近(p＞0.05)，请参见表2。可见，在心脏功能的恢复上，SH液明显优越于Stanford液和Thomas液，与UW液的保护作用相近似。

2.保存后心肌高能磷酸化合物含量：SH液的心肌高能磷酸化合物的含量明显高于Thomas液组和Stanford液组(P＜0.05)；与UW液组相比较，其含量无显著差异(P＞0.05)，请参见表3。

3.保存后心肌水肿程度：SH液组的水肿程度明显低于Thomas液组和Stanford液组；而与UW液组相比，SH液组的水肿程度较低，但两组间无显著差别(P＞0.05)，请参见表4。

实验证明，用本供心保存液(SH液)4℃下较长时间(10小时)保存离体鼠心，具有良好的保存效果。

附三种保存液的组成：

Thomas液的组成(mmol/L)

UW液的组成(mmol/L)

Stanford液的组成(mmol/L)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。