淡水鱼类肌球蛋白重链mRNA表达量快速检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明为淡水鱼类肌球蛋白重链mRNA表达量快速检测试剂盒及其检测方法。试剂盒包括PCR扩增反应液A、对照cDNA；PCR扩增反应液A含有10×PCR反应缓冲液、氯化镁、dNTP、Taq酶、重链基因和内参基因特异性上、下游引物各一对、SYBR Green I染料，鱼类淡水鱼类肌球蛋白重链mRNA表达量的快速检测方法包括鱼的总RNA提取、鱼类淡水鱼类肌球蛋白重链mRNA的实时荧光PCR扩增和结果判定。本发明的优点是需要量少、快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、重复性好。

说明书

技术领域

本发明涉及淡水鱼类肌球蛋白重链(MYH)的检测技术，具体的说是运用实时荧光PCR技术快速检测淡水鱼类肌球蛋白中重链mRNA的表达量的方法。

背景技术

肌球蛋白广泛存在于动物中，是构成骨骼肌粗丝的主要成分，也是重要的功能性蛋白。脊椎动物肌球蛋白的分子结构为“Y”形不对称六聚体，长约160cm，由两条分子量约220Kd左右的淡水鱼类肌球蛋白重链(MYH)和四条分子量为16---20Kd左右的短链即肌球蛋白轻链(MLC)组成。根据结构和功能不同，肌球蛋白可分为3个结构域：2条重链和轻链的N端结合，折叠形成头部和颈部调节结构域(S1)；2条重链的C端折叠成一螺旋结构，构成肌球蛋白长杆状的尾部，形成尾部结构域。其中头部含有一个ATP和肌动蛋白结合位点，直接与肌肉的运动和能量供应相关；与头部等相连的一螺旋的颈部，通过钙或其他类似钙元素调节轻链对头部的活性；尾部的结构域有决定肌球蛋白与膜或与另外肌球蛋白分子结合的相互反应。另外，肌球蛋白具有ATP酶活性，能裂解ATP释放化学能，并且具有与肌动蛋白结合的能力，是决定肌纤维收缩性质的主要分子之一。

不同的鱼种、不同的发育阶段、不同的组织、不同的环境中，重链基因的表达情况不一样。因此，对淡水鱼类肌球蛋白重链的定量的研究有助于为今后的进一步研究该类基因在鱼肌肉生长和发育中的调控作用，以及研究不同养殖环境对该类基因表达的影响奠定基础。

当前Trizol(Invitrogen)一步抽提法以简便、快速、需要量少但提取质量高的特点，实时荧光PCR法以操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点得到研究者的普遍认可与应用。

目前，尚未有快速检测淡水鱼类淡水鱼类肌球蛋白重链mRNA表达量的试剂盒，而本发明可以完成鱼类淡水鱼类肌球蛋白重链mRNA表达量的快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供淡水鱼类肌球蛋白重链mRNA表达量快速检测试剂盒的制备和检测方法，为进一步研究该类基因在鱼肌肉生长和发育中的调控作用，以及研究不同养殖环境对该类基因表达的影响奠定基础。

本发明的主要原理为：针对淡水鱼类肌球蛋白重链基因和内参基因保守序列设计目的基因和内参基因引物(表1)。进行核酸检测时，通过PCR反应生成双链DNA，SYBR Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。

本发明涉及的鱼类肌球蛋白重链基因表达量的快速检测试剂盒，其中的试剂包括如下：

(1)PCR扩增反应液

包括10×PCR反应缓冲液、0.1-0.4mmol/LdNTP(含dTTP)、2-4mmol/L硫酸镁、1-2UTaq酶、0.2-0.6umol/L上游引物、0.2-0.6umol/L下游引物、1×0.2×SYBR Green I染料：

其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X-100；

其中目的基因引物和内参基因引物参数如表1。

表1用于荧光定量分析的目的基因引物

和内参基因的引物参数

其中上游引物、下游引物、SYBR Green I染料的体积比为：1∶1∶1；

其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的混合物的摩尔量比为dTTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝1∶1∶1∶1。

(2)对照cDNA

实验组：上面所述PCR扩增反应液，每管24uL的最佳组成为：2.5uL 10×PCR反应缓冲液、2uL 2.5mmol/LdNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、2uL25mmol/L硫酸镁、1uL 10umol/L目的基因上游引物、1uL 10umol/L目的基因下游引物、1uL SYBR Green I染料、0.3uLTaq酶、14.2uLddH20(灭菌双蒸水)。

对照组：上面所述PCR扩增反应液A，每管24uL的最佳组成为：2.5uL 10×PCR反应缓冲液、2uL 2.5mmol/LdNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、2uL25mmol/L硫酸镁、1uL 10umol/L内参基因上游引物、1uL 10umol/L内参基因下游引物、1uL SYBR Green I染料、0.3uLTaq酶、14.2uLddH20(灭菌双蒸水)。

使用上述试剂盒检测淡水鱼类肌球蛋白重链mRNA表达量的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)：

(1)待检样品总RNA提取及cDNA第一链的合成

采用Trizol一步抽提法提取待检样品总RNA，然后用反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成；

(2)淡水鱼类肌球蛋白重链的实时荧光PCR扩增

A.在装有24uL分别含目的基因引物、内参基因引物的两支PCR扩增反应液A的反应管中加入1uL待检样品cDNA，混匀。

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

95℃10s，1个循环，预变性；

95℃5s，1个循环，变性；

58℃20s退火延伸，45个循环，PCR扩增。

(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果，比较表达量的多少。

第一步：判断能否检测出肌球蛋白重链。

如待测样品出现扩增曲线，且Ct值小于或等于41，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出肌球蛋白重链。

如待测样品Ct值大于或等于45，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出肌球蛋白重链。

如待测样品Ct值在41-45之间，应重作实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于45，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出肌球蛋白重链；再次扩增后的结果Ct值大于45，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出肌球蛋白重链。

第二步：通过比较阈值法来测定目的基因的相对表达量。

根据数学推导得出，肌球蛋白重链mRNA的表达量＝2--ΔΔCt，在该公式中，Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组。实时荧光定量PCR结束后，目的基因的量的实验数据用Excel 2003软件进行初步处理，接着采用SPSS 12.0或SASS软件对所得表达丰度数据进行单因素方差分析(One-WayANOVA)，最后采用最小显著差数法(LSD)进行多重比较，以对比样品中重链基因的表达量。

本发明建立了鱼类肌球蛋白重链mRNA表达量的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。本试剂盒根据鱼类肌球蛋白重链基因的保守序列，设计了特异性引物。该保守基因序列通过对Genebank登录的各鱼种肌球蛋白重链基因的核酸序列的比对获得，可保证不同鱼种、不同组织、不同发育时期肌球蛋白重链表达量的检出。本发明采用Trizol一步抽提法提取RNA，该技术具有简便、快速、需要量少但提取质量高的特点，采用实时荧光PCR法进行检测，该技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、定量准确的特点，因此特别适用于鱼类样品量少的肌球蛋白重链mRNA表达量的对比。

有益效果：

本发明建立了鱼类淡水鱼类肌球蛋白重链mRNA表达量的实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。本试剂盒根据鱼类淡水鱼类肌球蛋白重链基因的保守序列，设计了特异性引物。该保守基因序列通过对Genebank登录的各鱼种淡水鱼类肌球蛋白重链基因的核酸序列的比对获得，可保证不同鱼种、不同组织、不同发育时期淡水鱼类肌球蛋白重链表达量的检出。本发明采用Trizol(Invitrogen)一步抽提法提取RNA，该技术具有简便、快速、需要量少但提取质量高的特点，采用实时荧光PCR法进行检测，该技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、定量准确的特点，因此特别适用于鱼类样品量少的淡水鱼类肌球蛋白重链mRNA表达量的对比。

附图说明

图1用实时荧光PCR技术检测某待测草鱼样品cDNA，样品的扩增曲线；

图2数据处理后胚胎发育时期MYHmRNA相对表达量；

图3用实时荧光PCR技术检测某待测鳜鱼样品cDNA，样品的扩增曲线；

图4数据处理后胚胎发育时期MYHmRNA相对表达量。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

实施例1：

按下列配方制作原肠阶段和尾肠阶段的鲢鱼肌肉肌球蛋白重链的实时荧光PCR检测试剂盒：

包括10×PCR反应缓冲液、0.2mmol/L dNTP(含dTTP)、2mmol/L硫酸镁、1.5UTaq酶、1×0.2×SYBRGreenI染料、0.4umol/L上游引物、0.4u mol/L下游引物；

其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X-100；

其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的摩尔比为dTTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝1∶1∶1∶1。

按照以下程序进行检测：

具体步骤如下：

1、采用Trizol一步抽提法提取不同阶段草鱼普通肌总RNA，并合成cDNA第一链

(1)先在5mL离心管(DEPC处理)中加入1mL Trizol溶液，然后剪碎鱼样约100mg，置于该离心管中，高速匀浆至匀浆液透明而无颗粒。

(2)将匀浆液转移至1.5mL的离心管(DEPC处理)中，室温静置10min，使其充分裂解。

(3)将第(2)步处理的样品置于离心机内，12000rpm，4℃离心10min。

(4)离心完毕，取上清液转入另一新的DEPC处理的1.5mL离心管中。并加入0.2mL的氯仿，用力摇晃1min，使其充分乳化，无分相，室温静置5min。

(5)将第(4)步处理的样品置于离心机内，12000rpm，4℃离心15min。

(6)离心完毕，小心吸取上层水相至另一DEPC处理的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，上下轻混几次，冰上放置10min。然后再在12000rpm，4℃离心10min。

(7)弃上清，用1ml 75％乙醇洗涤沉淀。

(8)弃75％乙醇，重复步骤(7)，8000rpm，4℃离心10min。

(8)弃75％乙醇，真空干燥5min，使剩余酒精完全挥发。

(9)沉淀用100μl DEPC处理H20溶解，-80℃冻存或直接用于RT--PCR。取上述DNase I处理过的总RNA样品，利用反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成，获得样品的cDNA，反转录产物(RT Products)于-20℃保存备用

2、待测样品cDNA的实时荧光PCR扩增

A.在装有24uL分别含目的基因引物MYH、内参基因引物的两支PCR反应管中加入PCR反应液和1uL样品cDNA，混匀。

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

95℃10s，1个循环，预变性；

95℃5s，1个循环，变性；

58℃20s退火延伸，45个循环，PCR扩增。

3、应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果，比较表达量的多少。

实验数据经过Excel 2003软件的初步处理，再采用SPSS 12.0软件对所得表达丰度数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)并采用最小显著差数法(LSD)进行多重比较，发现原肠阶段MYH相对表达量与尾芽阶段相比有显著差异(p＜0.05)，即尾芽阶段的MYH要多。

实施例2：

按下列配方制作尾芽期和仔鱼期鳜鱼肌肉肌球蛋白重链基因的实时荧光PCR检测试剂盒：

包括10×PCR反应缓冲液、0.2mmol/L dNTP(含dTTP)、2mmol/L硫酸镁、1.5U Taq酶、0.4u mol/L上游引物0.4u mol/L下游引物、1×--0.2×SYBR Green I染料；

其中10×PCR反应缓冲液含有100mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷--盐酸、500mmol/L氯化钾和1％曲拉通X--100；

其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的摩尔比为dTTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝1∶1∶1∶1。

按照以下程序进行检测：

1、采用Trizol一步抽提法提取不同时期鳜鱼普通肌的总RNA，并合成cDNA第一链

(1)先在5mL离心管(DEPC处理)中加入1mL Trizol溶液，然后剪碎鱼样约100mg，置于该离心管中，高速匀浆至匀浆液透明而无颗粒。

(2)将匀浆液转移至1.5mL的离心管(DEPC处理)中，室温静置10min，使其充分裂解。

(3)将第(2)步处理的样品置于离心机内，12000rpm，4℃离心10min。

(4)离心完毕，取上清液转入另一新的DEPC处理的1.5mL离心管中，并加入0.2mL的氯仿，用力摇晃1min，使其充分乳化，无分相，室温静置5min。

(5)将第(4)步处理的样品置于离心机内，12000rpm，4℃离心15min。

(6)离心完毕，小心吸取上层水相至另一DEPC处理的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，上下轻混几次，冰上放置10min。然后再在12000rpm，4℃离心10min。

(7)弃上清，用1ml 75％乙醇洗涤沉淀。

(8)弃75％乙醇，重复步骤(7)，8000rpm，4℃离心10min。

(8)弃75％乙醇，真空干燥5min，使剩余酒精完全挥发。

(9)沉淀用100μl DEPC处理H2O溶解，-80℃冻存或直接用于RT--PCR。

(10)取上述DNase I处理过的总RNA样品，利用反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成，获得样品的cDNA，反转录产物(RT Products)于-20℃保存备用。

2待测鱼样cDNA的实时荧光PCR扩增：

A.分别在两支PCR反应管中加入24u L分别含目的基因MYH、内参基因β--actin的PCR反应液A和1u L样品cDNA，混匀。

B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增：

95℃10s，1个循环，预变性；

95℃5s，1个循环，变性；

58℃20s退火延伸，45个循环，PCR扩增。

(3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果，，比较表达量的多少。

实验数据经过Excel 2003软件的初步处理，再采用SPSS 12.0软件对所得表达丰度数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)并采用最小显著差数法(LSD)进行多重比较，发现尾芽阶段MYH相对表达量与仔鱼阶段相比有显著差异(p＜0.05)，即仔鱼阶段的MYH要多。