分离积雪草苷-B、羟基积雪草苷和积雪草苷的方法

摘要

本发明公开了一种分离积雪草苷-B、羟基积雪草苷和积雪草苷的方法，包括：将原料溶于甲醇水溶液后通入模拟移动床色谱系统，用甲醇水溶液洗脱得到积雪草苷，提余液蒸除溶剂后得到一次固体料；将一次固体料溶于含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液后通入模拟移动床色谱系统，用含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液洗脱得到羟基积雪草苷，提余液蒸除溶剂后得到二次固体料；将二次固体料溶于甲醇水溶液后通入模拟移动床色谱系统，用甲醇水溶液洗脱得到积雪草苷-B。该方法自动化程度高、操作简单、生产连续、生产效率高、固定相和溶剂消耗低，且产品质量稳定，整个过程不涉及化学反应，绿色环保，适于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及积雪草总苷中组分的分离，具体涉及一种分离积雪草苷-B、羟基积雪草苷和积雪草苷的方法，属化工分离技术领域。

背景技术

积雪草Centella asiatica(L.)Urban，又名胡薄荷、地钱草等，为伞形科积雪草属植物，广泛分布在南非、印度以及我国长江流域以南各地，是一种传统中草药。据研究报道，积雪草具有消炎、增强记忆力、促进胶原蛋白合成、抗抑郁和抗癌等多种生理活性。目前认为，积雪草的主要活性成分为积雪草总苷，积雪草总苷是一种混合物，主要由三萜烷酸形成的糖苷组成，包括积雪草苷-B(Asiaticoside B，CAS No.：125265-68-1)，羟基积雪草苷(Madecassoside；Asiaticoside A，CAS No.：34540-22-2)和积雪草苷(Asiaticoside，CAS No.：16830-15-2)，它们都具有五环三萜结构和糖苷支链，仅在三萜环上的羟基数目和位置存在着差异。虽然它们的结构极其相似，但生物活性却不尽相同，其中羟基积雪草苷具有消炎和治疗风湿性关节炎等活性；积雪草苷能够促进伤口的愈合，对烧伤性瘢痕有明显的治愈作用，常作为评价积雪草药理活性的标志性成分；由于积雪草苷-B纯品难以获得，关于它的药理活性还未见报道。

鉴于积雪草总苷中各物质的结构及理化性质都较为接近，其中羟基积雪草苷和积雪草苷-B是一对同分异构体，它们和积雪草苷相比只多了一个羟基，而强极性糖元的连接又大大地弱化了这种微小极性的差异，使得很难用常规的分离方法将这三种物质完全分离。

专利EP 867447，CN 1194154，US 6417349，IN 183285和CN 1387868A报道了提取积雪草总苷的方法，但分离纯化这三种物质的方法却较少。杜琪珍(Du Q Z，Jerz G，Chen P，et al..Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies，2004，27(14)：2201-2215.)和Vanhaelen-Fastré(DialloB，Vanhaelenfastre R，Vanhaelen M.Journal of Chromatography，1991，558(2)：446-450.)等采用高速逆流色谱实现了积雪草苷和羟基积雪草苷的分离，但该方法制备规模较小，所得产品质量只能达到毫克级，而且不能分离羟基积雪草苷和积雪草苷-B。

专利US 2006/0106206A1报道了一种制取羟基积雪草苷的方法，但它所获得的羟基积雪草苷的纯度只有81％，且回收率低，消耗大量溶剂，无法实现工业化。公开号为CN 101182346A的中国专利申请报道了一种用硅胶柱分离羟基积雪草苷和积雪草苷-B的方法，所得产品纯度只能在95％左右，且操作步骤比较繁琐。

模拟移动床色谱(Simulated moving bed chromatography，SMBC)具有分离能力强，设备结构小，便于自动控制，并特别有利于分离热敏性高及难以分离物系等优点，适用于进行连续性大规模工业化生产，它的引入能够在保证分离纯度和收率的前提下大大提高生产的自动化水平和生产效率，并且使得生产环境得到非常大的改善。90年代以来，SMBC技术开始应用于精细化工和药物尤其是手性药物的分离。由于积雪草总苷中各成分性质的复杂性和特殊性，目前尚未见到有关模拟移动床色谱分离纯化积雪草总苷中各活性成分的报道。

发明内容

本发明提供了一种分离积雪草苷-B、羟基积雪草苷和积雪草苷的方法，针对积雪草总苷中复杂的活性成分，采用模拟移动床色谱，结合合适的流动相分离得到高纯度的积雪草苷-B、羟基积雪草苷和积雪草苷单体。

一种分离积雪草苷-B、羟基积雪草苷和积雪草苷的方法，包括步骤：

(1)将含积雪草总苷的原料溶于甲醇水溶液中配制原料液，将原料液通入模拟移动床色谱系统，以甲醇水溶液为流动相进行洗脱，将提取液蒸除溶剂后得到积雪草苷，提余液蒸除溶剂后得到一次固体料；

(2)将一次固体料溶于含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液中配制一次料液，将一次料液通入模拟移动床色谱系统，以含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液为流动相进行洗脱，将提取液蒸除溶剂后得到羟基积雪草苷，提余液蒸除溶剂后得到二次固体料；

(3)将二次固体料溶于甲醇水溶液中配制二次料液，将二次料液通入模拟移动床色谱系统，以甲醇水溶液为流动相进行洗脱，将提取液蒸除溶剂后得到积雪草苷-B。

积雪草总苷中含积雪草苷-B、羟基积雪草苷和积雪草苷三种活性成分。其中羟基积雪草苷和积雪草苷-B是一对同分异构体，它们比积雪草苷多一个羟基连接在母环上，而强极性糖元的连接又大大地弱化了这种极性的微小差异，所以采用吸附分离方法时，很难用一般的固定相来实现这三种物质的完全分离。因此本发明所述的模拟移动床色谱系统中色谱柱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，固定相的粒径越小越有利于分离，为了保证分离度，优选粒径为5μm～100μm的固定相。

当使用十八烷基键合硅胶作为固定相时，极性大的物质先出峰，极性小的物质后出峰。根据所要分离物质的性质分析，积雪草总苷中各组分出峰的先后顺序是积雪草苷-B、羟基积雪草苷、积雪草苷。而杂质基本聚集在积雪草苷-B之前出峰，所以根据出峰时间的先后可以逐步分离出积雪草苷、羟基积雪草苷和积雪草苷-B。同时，单柱试验结果表明，流动相对色谱分离过程也有很大影响。如图1所示，当以甲醇水溶液为流动相时，积雪草苷-B和羟基积雪草苷的色谱峰完全重叠，但与积雪草苷能完全分离。当以含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液为流动相时，能部分分离积雪草苷-B和羟基积雪草苷，见图2。分离积雪草苷和羟基积雪草苷后的物料中只含有积雪草苷-B和杂质，此时，就可以再用甲醇水溶液为流动相将积雪草苷-B和杂质进行分离，见图3。

步骤(1)流动相中甲醇比例越高，出峰越快，而分离度降低，综合考虑分离时间和分离效果，所述的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比优选为50∶50～80∶20。。

步骤(2)中，流动相中乙腈比例越高，出峰越快，而分离度降低，综合考虑分离时间和分离效果，所述的含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液中水、乙腈与甲基叔丁基醚的体积比优选为70∶30∶2～80∶20∶2。

步骤(3)中，流动相中甲醇比例越高，出峰越快，而分离度降低，综合考虑分离时间和分离效果，所述的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比优选为50∶50～70∶30。

为了避免色谱柱过载，保证所得产品的纯度，所述的原料液中原料的浓度优选为1mg/mL～300mg/mL，所述的一次料液中一次固体料的浓度优选为1mg/mL～300mg/mL，所述的二次料液中二次固体料的浓度优选为1mg/mL～300mg/mL。

所述的模拟移动床色谱(简称SMBC)系统中色谱柱的总数量一般为4根～32根，每区色谱柱的数量为1根～8根，增加色谱柱的数量有利于提高产品的纯度，随着柱子数目的增加，切换时间将缩短，而频繁的切换将降低整个操作系统的使用寿命，所以优选色谱柱的总数量为8根～16根，每区色谱柱的数量为2根～4根。

所述的模拟移动床色谱系统的操作温度为10℃～60℃，操作温度过高，物质在固定相和流动相之间传质加快，使得物质出峰变快，而分离效果变差，综合考虑优选30℃～50℃。

为了提高色谱柱的生产能力，最好选用积雪草总苷的质量百分含量为70％～100％的原料。

采用本发明的分离方法，结合合适的模拟移动床操作条件，可以使步骤(1)中的提取液中只含最强吸附组分积雪草苷，使步骤(2)中的提取液中只含最强吸附组分羟基积雪草苷，使步骤(3)中的提取液中只含最强吸附组分积雪草苷-B，实现积雪草苷-B、羟基积雪草苷和积雪草苷的最大程度的完全分离。

通过优化实验分析，步骤(1)中优选的模拟移动床操作条件为：进样液流量为0.5ml/min～2ml/min，洗脱液流量为0.8ml/min～3.5ml/min，提余液流量为0.70ml/min～2.5ml/min，提取液流量为0.6ml/min～2.8ml/min，切换时间为80s～420s。

步骤(2)中优选的模拟移动床操作条件为：进样液流量为lml/min～2ml/min，洗脱液流量为3ml/min～16ml/min，提余液流量为2ml/min～9ml/min，提取液流量为2ml/min～8.5ml/min，切换时间为60s～100s。

步骤(3)中优选的模拟移动床操作条件为：进样液流量为1ml/min～4ml/min，洗脱液流量为2.0ml/min～15.0ml/min，提余液流量为2ml/min～9ml/min，提取液流量为2ml/min～9ml/min，切换时间为90s～470s。

本发明具有如下有益效果：

本发明采用三步分离法，第一步以甲醇水溶液作为流动相，利用出峰时间不同将积雪草苷单体与其它组分进行分离，第二步以含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液作为流动相将羟基积雪草苷单体与其它组分进行分离，第三步以甲醇水溶液作为流动相将积雪草苷-B单体与其它组分进行分离，各步提取液蒸除溶剂后即可得到纯度高于98％的单体，无需进行后处理，节约成本和资源，分离得到的积雪草苷-B、羟基积雪草苷和积雪草苷单体的收率也均高于98％。

本发明方法自动化程度高、操作简单、生产连续、生产效率高、固定相和溶剂消耗低，且产品质量稳定，整个过程不涉及化学反应，绿色环保，适于工业化生产。

附图说明

图1为步骤(1)中使用甲醇水溶液(其中甲醇∶水＝60∶40，v/v)作为流动相的单柱实验结果，图中前20min都是杂质峰，峰1是积雪草甘-B和羟基积雪草苷的重叠峰，峰2是积雪草苷；

图2为步骤(2)中使用含乙腈与甲基叔丁基醚的水溶液(水∶乙腈∶甲基叔丁基醚＝80∶20∶2，v/v)作为流动相的单柱实验结果，图中前36min都是杂质峰，峰1为积雪草苷-B，峰2为羟基积雪草苷；

图3为步骤(3)中使用甲醇水溶液(甲醇∶水＝50∶50)作为流动相的单柱实验结果，图中前48min都是杂质峰，峰1为积雪草苷-B。

图4为本发明所用的模拟移动床色谱系统的结构示意图。

具体实施方式

本发明针对不同含量的积雪草总苷原料，在不同的操作条件下，进行了实验验证。以下实施例中均采用图4所示的模拟移动床系统。该系统包括进样泵、洗脱液泵、提取泵、提余泵、旋转阀和色谱柱。SMBC系统有4个区，每个区一般可设置1根～8根色谱柱，整个模拟移动床色谱系统中色谱柱的总数量一般为4根～32根。其工作原理为：进料液从2区和3区之间注入，洗脱液从4区和1区之间注入，弱吸附组分(即提余液)在3区和4区之间收集，强吸附组分(即提取液)在1区和2区之间收集。每隔一定时间，进样液入口、洗脱液入口、提取液出口和提余液出口同时沿流动相流动方向切换至下一根色谱柱出口，如图4虚线箭头所指位置。用HPLC法(邢华斌，苏宝根，杨亦文，吕秀阳，任其龙，Separation anddetermination of asiaticoside，asiaticoside-B and madecassoside in Centellaasiatica total triterpenoid saponins by HPLC.Journal of LiquidChromatography&Related Technologies，2009，32(13)：1891-1900.)分析提余液和提取液的组成。

根据图1所示的单柱试验结果，在步骤(1)中选择合适的模拟移动床操作条件，使提取液中只含有最强吸附组分积雪草苷，其它弱吸附组分则全部作为提余液。

根据图2所示的单柱试验结果，在步骤(2)中选择合适的模拟移动床操作条件，使提取液中只含有最强吸附组分羟基积雪草苷，其它弱吸附组分则全部作为提余液。

根据图3所示的单柱试验结果，在步骤(3)中选择合适的模拟移动床操作条件，使提取液中只含有最强吸附组分积雪草苷-B，其它弱吸附组分则全部作为提余液。

实施例1

模拟移动床色谱系统916(德国诺尔制造)，装配4根ID 1cm×15cm的色谱柱，每区1根，色谱柱内装填的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径5μm。流动相(即洗脱液)为甲醇水溶液，其中甲醇与水的体积比为70∶30，操作温度30℃。

原料中积雪草总苷的质量百分含量为70.1％，其中积雪草苷-B的质量百分含量为17.9％，羟基积雪草苷的质量百分含量为25.5％，积雪草苷的质量百分含量为26.7％。

将含积雪草总苷的原料用流动相配制成50mg/ml的进样溶液。

a、操作条件

进样液流量：UF＝0.50ml/min

洗脱液流量：UD＝0.88ml/min

提余液流量：UR＝0.70ml/min

提取液流量：UE＝0.68ml/min

切换时间：ts＝87s；

b、成品分析

用HPLC分析提余液和提取液的组成，提取液中积雪草苷纯度为98.95％，积雪草苷收率为99.02％，每生产1g积雪草苷消耗1.389L流动相。

实施例2

模拟移动床色谱系统916(德国诺尔制造)，装配16根ID 1cm×15cm的色谱柱，每区4根，色谱柱内装填的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径50μm。流动相(即洗脱液)为甲醇水溶液，其中甲醇与水的体积比为60∶40，操作温度40℃。

原料中积雪草总苷的质量百分含量为83.3％，其中积雪草苷-B的质量百分含量为21.3％，羟基积雪草苷的质量百分含量为30.6％，积雪草苷的质量百分含量为31.4％。

将含积雪草总苷的原料用流动相配制成300mg/ml的进样溶液。

a、操作条件

进样液流量：UF＝1.00ml/min

洗脱液流量：UD＝1.71ml/min

提余液流量：UR＝1.28ml/min

提取液流量：UE＝1.43ml/min

切换时间：ts＝146s；

b、成品分析

用HPLC分析提余液和提取液组成，提取液中积雪草苷纯度为99.85％，积雪草苷收率为98.75％，每生产1g积雪草苷消耗1.357L流动相。

实施例3

模拟移动床色谱系统916(德国诺尔制造)，装配24根ID 1cm×15cm的色谱柱，每区6根，色谱柱内装填的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径100μm。流动相(即洗脱液)为甲醇水溶液，其中甲醇与水的体积比为50∶50，操作温度60℃。

原料中积雪草总苷的质量百分含量为97.2％，其中积雪草苷-B的质量百分含量为26.3％，羟基积雪草苷的质量百分含量为34.2％，积雪草苷的质量百分含量为36.7％。

将含积雪草总苷的原料用流动相配制成150mg/ml的进样溶液。

a、操作条件

进样液流量：UF＝2.00ml/min

洗脱液流量：UD＝3.25ml/min

提余液流量：UR＝2.50ml/min

提取液流量：UE＝2.75ml/min

切换时间：ts＝418s；

b、成品分析

用HPLC分析提余液和提取液组成，提取液中积雪草苷纯度为99.89％，积雪草苷收率为99.20％，每生产1g积雪草苷消耗1.31L流动相。

实施例4

模拟移动床色谱系统916(德国诺尔制造)，装配8根ID 1cm×15cm的色谱柱，每区2根，色谱柱内装填的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径20μm。流动相(即洗脱液)为甲醇水溶液，其中甲醇与水的体积比为80∶20，操作温度20℃。

原料中积雪草总苷的质量百分含量为99.7％，其中积雪草苷-B的质量百分含量为27.2％，羟基积雪草苷的质量百分含量为35.0％，积雪草苷的质量百分含量为37.5％。

将含积雪草总苷的原料用流动相配制成10mg/ml的进样溶液。

a、操作条件

进样液流量：UF＝1.00ml/min

洗脱液流量：UD＝1.54ml/min

提余液流量：UR＝1.09ml/min

提取液流量：UE＝1.45ml/min

切换时间：ts＝85s；

b、成品分析

用HPLC分析提余液和提取液组成，提取液中积雪草苷纯度为99.82％，积雪草苷收率为99.30％，每生产1g积雪草苷消耗1.39L流动相。

实施例5

模拟移动床色谱系统916(德国诺尔制造)，装配16根ID 1cm×15cm的色谱柱，每区4根，色谱柱内装填的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径10μm。流动相(即洗脱液)为含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液，其中水、乙腈与甲基叔丁基醚的体积比为80∶20∶2，操作温度20℃。

合并实施例1和实施例2中的提余液，蒸除溶剂至干，得一次固体料，其中积雪草苷-B的质量百分含量为27.6％、羟基积雪草苷的质量百分含量为39.6％，杂质的质量百分含量为32.8％。

取一次固体料用流动相配成200mg/ml的进样溶液。

a、操作条件

进样液流量：UF＝1.00ml/min

洗脱液流量：UD＝3.39ml/min

提余液流量：UR＝2.12ml/min

提取液流量：UE＝2.27ml/min

切换时间：ts＝88s；

b、成品分析

用HPLC分析提余液和提取液组成，提取液中羟基积雪草苷纯度为99.10％，羟基积雪草苷收率为98.11％，每生产1g羟基积雪草苷消耗3.39L流动相。

实施例6

模拟移动床色谱系统916(德国诺尔制造)，装配24根ID 1cm×15cm的色谱柱，每区6根，色谱柱内装填的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径50μm。流动相(即洗脱液)为含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液，其中水、乙腈与甲基叔丁基醚的体积比为80∶20∶2，操作温度10℃。

合并实施例3和实施例4中的提余液，蒸除溶剂至干，得一次固体料，其中积雪草苷-B的质量百分含量为42.5％、羟基积雪草苷的质量百分含量为55.0％，杂质的质量百分含量为2.5％。

取一次固体料用流动相配成50mg/ml的进样溶液。

a、操作条件

进样液流量：UF＝2.00ml/min

洗脱液流量：UD＝8.00ml/min

提余液流量：UR＝4.27ml/min

提取液流量：UE＝5.73ml/min

切换时间：ts＝68s；

b、成品分析

用HPLC分析提余液和提取液组成。提取液中羟基积雪草苷纯度为99.72％，羟基积雪草苷收率为99.38％，每生产1g羟基积雪草苷消耗5.19L流动相。

实施例7

模拟移动床色谱系统916(德国诺尔制造)，装配32根ID 1cm×15cm的色谱柱，每区8根，色谱柱内装填的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径100μm。流动相(即洗脱液)为含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液，其中水、乙腈与甲基叔丁基醚的体积比为70∶30∶2，操作温度35℃。

合并实施例3和实施例4中的提余液，蒸除溶剂至干，得一次固体料，其中积雪草苷-B的质量百分含量为42.5％、羟基积雪草苷的质量百分含量为55.0％，杂质的质量百分含量为2.5％。

取一次固体料用流动相配成20mg/ml的进样溶液。

a、操作条件

进样液流量：UF＝1.00ml/min

洗脱液流量：UD＝6.00ml/min

提余液流量：UR＝3.40ml/min

提取液流量：UE＝3.60ml/min

切换时间：ts＝70s；

b、成品分析

用HPLC分析提余液和提取液组成，提取液中羟基积雪草苷纯度为99.83％，羟基积雪草苷收率为98.87％，每生产1g羟基积雪草苷消耗3.50L流动相。

实施例8

模拟移动床色谱系统916(德国诺尔制造)，装配16根ID 1cm×15cm的色谱柱，每区4根，色谱柱内装填的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径20μm。流动相(即洗脱液)为含乙腈和甲基叔丁基醚的水溶液，其中水、乙腈与甲基叔丁基醚的体积比为75∶25∶2，操作温度50℃。

合并实施例1和实施例2中的提余液，蒸除溶剂至干，得一次固体料，其中积雪草苷-B的质量百分含量为27.6％、羟基积雪草苷的质量百分含量为39.6％，杂质的质量百分含量为32.8％。

取一次固体料用流动相配成50mg/ml的进样溶液。

a、操作条件

进样液流量：UF＝2.00ml/min

洗脱液流量：UD＝15.38ml/min

提余液流量：UR＝8.92ml/min

提取液流量：UE＝8.46ml/min

切换时间：ts＝97s；

b、成品分析

用HPLC分析提余液和提取液组成。提取液中羟基积雪草苷纯度为98.84％，羟基积雪草苷收率为98.51％，每生产1g羟基积雪草苷消耗4.09L流动相。

实施例9

模拟移动床色谱系统916(德国诺尔制造)，装配16根ID 1cm×15cm的色谱柱，每区4根，色谱柱内装填的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径10μm。流动相(即洗脱液)为甲醇水溶液，其中甲醇与水的体积比为70∶30，操作温度30℃。

合并实施例5、实施例6、实施例7和实施例8中的提余液，蒸除溶剂至干，得二次固体料，其中积雪草苷-B的质量百分含量为66.5％，杂质的质量百分含量为33.5％。

取二次固体料用流动相配成50mg/ml的进样溶液。

a、操作条件

进样液流量：UF＝2.00ml/min

洗脱液流量：UD＝2.95ml/min

提余液流量：UR＝2.28ml/min

提取液流量：UE＝2.67ml/min

切换时间：ts＝156s；

b、成品分析

用HPLC分析提余液和提取液组成。提取液中积雪草苷-B纯度为98.75％，积雪草苷-B收率为98.90％，每生产1g积雪草苷-B消耗1.281L流动相。

实施例10

模拟移动床色谱系统916(德国诺尔制造)，装配24根ID 1cm×15cm的色谱柱，每区6根，色谱柱内装填的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径20μm。流动相(即洗脱液)为甲醇水溶液，其中甲醇与水的体积比为60∶40，操作温度40℃。

合并实施例5、实施例6、实施例7和实施例8中的提余液，蒸除溶剂至干，得二次固体料，其中积雪草苷-B的质量百分含量为66.5％，杂质的质量百分含量为33.5％。

取二次固体料用流动相配成100mg/ml的进样溶液。

a、操作条件

进样液流量：UF＝2.00ml/min

洗脱液流量：UD＝2.71ml/min

提余液流量：UR＝2.24ml/min

提取液流量：UE＝2.47ml/min

切换时间：ts＝178s；

b、成品分析

用HPLC分析提余液和提取液组成。提取液中积雪草苷-B纯度为99.00％，积雪草苷-B收率为98.20％，每生产1g积雪草苷-B消耗1.389L流动相。

实施例11

模拟移动床色谱系统916(德国诺尔制造)，装配8根ID 1cm×15cm的色谱柱，每区2根，色谱柱内装填的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径50μm。流动相(即洗脱液)为甲醇水溶液，其中甲醇与水的体积比为50∶50，操作温度50℃。

合并实施例5、实施例6、实施例7和实施例8中的提余液，蒸除溶剂至干，得二次固体料，其中积雪草苷-B的质量百分含量为66.5％，杂质的质量百分含量为33.5％。

取二次固体料用流动相配成150mg/ml的进样溶液。

a、操作条件

进样液流量：UF＝2.00ml/min

洗脱液流量：UD＝2.89ml/min

提余液流量：UR＝2.22ml/min

提取液流量：UE＝2.67ml/min

切换时间：ts＝470s；

b、成品分析

用HPLC分析提余液和提取液组成。提取液中积雪草苷-B纯度为98.25％，积雪草苷-B收率为99.40％，每生产1g积雪草苷-B消耗1.222L流动相。