一种功能化离子液体修饰的介孔分子筛在酶固定化中的应用

摘要

本发明属于固定化酶载体领域，公开了一种功能化离子液体修饰介孔分子筛在酶固定化中的应用。该介孔分子筛表面能与酶氨基酸残基作用结合的来自于功能化离子液体的有机官能团。本发明利用离子液体的可设计性，在介孔材料表面分别引入带有烷基、氨基、羧基、羟基等官能团的功能化离子液体，通过这些基团与酶分子氨基酸残基发生静电、氢键、疏水键等作用，增强了载体与酶的结合力，改变了酶所处的微环境，改善了固定化酶的催化性能。本发明将功能性离子液体修饰介孔材料用于酶的固定化，不仅仅是提出了一个全新的概念，更丰富了介孔材料的表面修饰方法，也拓展了离子液体和介孔材料在酶工程领域中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于催化剂载体领域，涉及一种功能化离子液体修饰的介孔分子筛在酶固定化中的应用。

背景技术

酶作为催化剂，具有高效性、专一性、温和性、环境友好等特点，广泛应用于食品、医药和化工等行业。其中固定化酶相对游离酶具有稳定性好、易从反应系统中分离、能重复使用、便于运输和贮存、有利于生产的连续化和自动化等优点，因此具有更广阔的应用空间。而载体材料作为固定化酶的一部分，其结构和性能对固定化酶的性能有很大的影响。如载体的比表面积、孔径分布、孔容、拓扑结构、表面性质、稳定性等都会影响酶所处的微环境，从而改变酶的催化特性，因此载体的选择十分重要。

介孔材料(孔径：2-50nm)作为一种载体具有较大的比表面积、有序的纳米孔道结构、较大的孔容、较窄的孔径分布、良好的热稳定性和化学稳定性等特性，更为重要的是介孔材料表面富含活性羟基，可方便的对其进行表面修饰，改变载体特性。因此，介孔材料在酶的固定化中有着得天独厚的优势和广阔应用前景。如中国专利CN101575135通过使用载酶硅基介孔材料SBA-15，成功催化氧化析出了水中酚类物质。日本专利JP2009153448通过将水解酶固定在介孔材料上，成功实现了淀粉的水解。中国专利CN101451133也成功将辣根过氧化物酶负载在了介孔材料SBA-15上。

然而，酶通过物理吸附方式直接固定到介孔材料上，酶分子与载体结合力不强，容易导致酶的固定化效率及稳定性降低，而且使酶在洗脱与反应时容易脱落。此外，酶固定化后其催化作用由均相转移到多相，由此带来的扩散限制效应、空间位阻、分配效应等对酶的催化特性有很大影响。(Enzyme immobilization using SBA-15mesoporous molecular sieveswith functionalised surfaces.Journal of Molecular Catalysis.B，Enzymatic，2001.15(1-3)：81-92)。

功能化离子液体是指在室温下呈液态的仅由阴阳离子组成的盐，它具有很强的溶解性、几乎无蒸汽压、有较好的热稳定性、化学稳定性等特点；此外，还可以通过改变阴阳离子的结构来改变离子液体的亲水性、疏水性、黏性、熔点、密度等性质，设计合成具有适合某种反应需求的离子液体，因此，功能化离子液体也被称“可设计性溶剂”；同时，离子液体由于对环境友好的特性又被称为“绿色”溶剂，已经在有机合成、分离过程、材料合成、催化等领域得到广泛应用。并且功能化离子液体近年来在生物催化领域也已得到了广泛的应用，脂肪酶、蛋白酶、氧化还原酶等多种酶都在功能化离子液体中显示出了很好的稳定性，而且在功能化离子液体中酶催化的区域、对映体选择性往往都有所提高。(On thebackground of enhanced stability and reusability of enzymes in ionic liquids.BiochemicalSociety transactions.(2007)，35(Pt 6)，1624-1627.)

但是，目前功能化离子液体在酶催化反应中基本上都是作为反应介质使用，其使用量大，成本高，而且功能化离子液体在某些酶催化反应中还存在与产物分离困难，粘度高使传质受到限制等问题。近些年来，专利JP2009207492、JP2009203454、WO2008090156、CN101225427等利用功能化离子液体的“绿色”溶剂和“可设计性溶剂”性质，简化了产物分离的过程，提高了酶的稳定性或者活性，但是同样遇到了离子液体用量过大，不适宜工业化生产的问题，且稳定性虽有提高但仍然不及固定化酶的稳定性。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有固定化酶技术存在的不足，提供一种离子液体修饰的介孔分子筛作为酶固定化得载体，改善酶的酶学性质。

一种功能化离子液体修饰的介孔分子筛，其表面存在能与酶氨基酸残基作用结合的来自于功能化离子液体的有机官能团。

其中，所述的介孔分子筛有SBA-15、SBA-16、MCM-41或MCM-48等。

所述的功能化离子液体的阳离子是含不同有机官能团的咪唑类离子。其中，有机官能团为烷基、羟基、羧基或氨基，本发明提供的功能化离子液体修饰的介孔分子筛通过有机官能团与酶的静电、氢键、疏水或化学成键等作用，增强酶与载体的结合力，改善酶的催化特性。

所述的功能化离子液体的阴离子是具有不同亲水性或电负性的极性离子，优选四氟硼酸根亲水阴离子和六氟磷酸疏水根阴离子，本发明提供的功能化离子液体修饰的介孔分子筛通过阴离子亲疏水性质的差异调节酶的酶学性质。

所述的介孔分子筛原粉的平均孔径为2-50nm，比表面积在300-1500m²/g之间，有利于酶的固定化和高度分散。

所述的介孔分子筛与功能化离子液体的有机官能团的摩尔比为3-100∶1。

所述的功能化离子液体修饰的介孔分子筛的制备方法包括如下步骤(原理见图1(a))：

将介孔分子筛原粉真空脱气处理后装入反应瓶中，然后加入氯代丙基甲氧基硅烷在氯仿回流下进行偶联反应，再加入咪唑进行取代，接着加入有机官能团供体引入不同的有机官能团修饰，然后加入KPF₆或者KBF₄进行离子交换，得到功能化离子液体修饰介孔分子筛固定化酶载体，将上述物料提纯后，在50-150℃进行真空干燥得到功能化离子液体修饰过的功能化分子筛介孔材料；其中介孔分子筛原粉、溶剂氯仿、氯代丙基甲氧基硅烷、咪唑、有机官能团供体以及KPF₆或者KBF₄的摩尔比为3-100∶30∶1∶1∶1∶1。

其中，所述的有机官能团为烷基、羟基、羧基或氨基，有机官能团供体为卤代烷烃，含羟基的卤代烷烃，含羟基的卤代烷烃或含羟基的卤代烷烃。

有机官能团为烷基的功能化离子液体修饰的介孔分子筛还可通过如下步骤制备(原理见图1(b))：

将烷基咪唑类化合物和氯代丙基三甲氧基硅烷在50-150℃下氮气氛下反应回流10-40小时，将得到的产物与KPF₆或者KBF₄在丙酮中23～30℃搅拌三天得到离子液体粗液，将离子液体粗液提纯得到离子液体；将介孔分子筛原粉真空脱气处理后装入反应瓶中，然后加入功能化离子液体，在50-100℃温度下，在氯仿中回流20-40h，得到功能化离子液体修饰介孔分子筛固定化酶载体，将上述物料提纯后，在50-150℃进行真空干燥得到功能化离子液体修饰过的功能化分子筛介孔材料，其中介孔分子筛原粉、溶剂氯仿、烷基咪唑、氯代丙基三甲氧基硅烷以及KPF₆或者KBF₄的摩尔比为3-100∶30∶1∶1∶1。

本发明所述的功能化离子液体修饰的介孔分子筛可作为酶的固定化载体，应用于酶的固定化，可广泛用于胰蛋白酶、淀粉酶、青霉素酰化酶、脂肪酶或辣根过氧化物酶等生物酶催化剂的固定化。

本发明的有益效果：

本发明将功能化离子液体用于修饰介孔分子筛，充分发挥了介孔材料和功能化离子液体在催化反应中的优点，并克服了现有技术中功能化离子液体作为反应介质时用量大，生产成本居高不下等缺陷，提供了一种新型的介孔分子筛材料。该分子筛改善了酶在固定化载体上的酶学性质，解决了当前固定化酶领域普遍存在的载体负载量效率低、固定化酶活性不够高，而且当表面修饰基团与酶以化学键共价结合时，往往由于酶的三维构像及其柔性受到限制而影响酶活等问题。

本发明通过离子液体嫁接在介孔材料上减少离子液体用量的同时充分利用离子液体所具有的较强溶解性能，使固定化酶催化的多相反应具有准均相反应的特点，缓解扩散限制对酶催化效率的影响，开发了一种新颖、高效的酶固定化用介孔材料。

本发明将功能性离子液体修饰介孔材料用于酶的固定化，不仅仅是提出了一个全新的概念，也拓展了离子液体和介孔材料在酶工程领域中的应用。

本发明提供的功能化离子液体修饰的介孔分子筛，其表面存在着能与酶氨基酸残基间产生静电、氢键、疏水等作用的离子液体有机官能团，既能与酶有效的结合改善酶学性质，又不会对酶结构造成大的破坏，示意图见图2。

本发明提供的功能化离子液体修饰的介孔分子筛具有孔径2-50nm分布均一的孔道，孔道的尺寸可以调变到和酶分子的尺寸相近，使酶分子能够进入到其纳米尺寸孔道，。

本发明提供的功能化离子液体修饰的介孔分子筛比表面积在300-1500m²/g，酶固载量高，制备的固定化酶活性和稳定性高。

利用本发明提供的功能化离子液体修饰的介孔分子筛固定化酶，固定化反应条件温和，在30-80℃左右的中性条件下即可进行，操作过程简单，适合于工业化应用。

本发明提供的功能化离子液体修饰的介孔分子筛表面在酶催化反应过程中表现惰性，且载体本身具有良好的耐酸性、耐有机溶剂性等化学稳定性和耐温热稳定性。

利用本发明提供的功能化离子液体修饰的介孔分子筛固定化的酶可以通过简单过滤与产物分离并回收且固定化酶表观活性和重复使用次数高。

附图说明

图1功能化离子液体合成以及嫁接在介孔分子筛表面的原理图；

其中，图(a)为功能化离子液体合成以及嫁接在介孔分子筛表面的过程图，其中R为烷基，或含羟基、羧基、胺基等官能团的有机基团；图(b)为有机官能团为烷基的功能化离子液体修饰的介孔分子筛的制备过程图，其中R为甲基、乙基、丙基、丁基等烷基。

图2功能化离子液体修饰介孔材料固定化酶催化剂的模拟图。

图3实施例1制备的功能化离子液体修饰介孔分子筛红外图谱

图4温度对固定化猪胰脂肪酶及游离猪胰脂肪酶的影响图。

图5固定化猪胰脂肪酶的操作稳定性图。

具体实施方式

实施例1

1)介孔分子筛SBA-15的合成：依据赵东元等人在(Triblock Copolymer Syntheses ofMesoporous Silica with Periodic 50to 300Angstrom Pores.Science，1998，279：548-553)中的叙述，制备得到SBA-15分子筛原粉，孔径为10nm，比表面积为350m²/g。

2)功能化离子液体的合成：1-甲基咪唑和氯代丙基三甲氧基硅烷在120℃下回流反应40小时，冷却至室温，将得到的产物与KPF6在丙酮中室温搅拌三天得到功能化离子液体粗液，将离子液体粗液过滤，洗涤，分液，减压蒸馏蒸出丙酮和水，得到功能化离子液体，其中1-甲基咪唑、氯代丙基三甲氧基硅烷以及KPF₆摩尔比为1∶1∶1。

3)功能化离子液体修饰介孔分子筛固定化酶载体的制备：将180℃真空干燥活化的1g分子筛原粉分散在50ml氯仿中，加入上述离子液体，与介孔分子筛原粉摩尔质量之比为1∶50，在85℃回流26h，过滤并洗涤，在真空干燥箱中干燥至恒重，得到功能化离子液体修饰介孔分子筛酶固定化载体。经红外检测，红外图谱表明离子液体成功嫁接在分子筛的表面，见图3；元素分析结果显示1g介孔材料上负载的离子液体量为0.2mmol。

4)酶固定化：取25ml PH＝7.5的Tris-HCl缓冲液加入锥形瓶中，再加入0.5g介孔载体和25ml去离子水；称量0.125g猪胰脂肪酶加入锥形瓶中于室温搅匀；在温度30℃的振荡器中振荡10h；抽滤，得到固定化酶。

5)酶活测定：

载体固定化猪胰脂肪酶水解三醋酸甘油酯乳化液为探针反应。在温度30℃，PH为7.5时，采用酸碱滴定法测定该固定化酶的活力，表观活性为450IU/g脂肪酶。

其中酶活的定义为：在在温度30℃，PH为7.5时，每分钟酶催化三醋酸甘油酯生成1微摩尔醋酸时需要的酶量，计算公式为：

U＝(V-V₀)×50/(10×0.25)＝20(V-V₀)

其中：V——样品耗用的NaOH溶液的体积，ml；

V₀——空白样耗用的NaOH溶液的体积，ml；

50——每毫升NaOH溶液含有的NaOH的微摩尔数；

10——反应时间，min；

0.25——游离酶或固定化酶量，g.。

按照本领域考察酶温度稳定性的常规方法分别考察了该固定化酶和游离猪胰脂肪酶在28～40℃范围内的温度稳定性，结果见图4。由图4可看出，游离酶的最佳反应温度为30℃，未经修饰的相应介孔分子筛所固定化的猪胰脂肪酶的最佳反应温度在36℃，而本发明所制备的功能化离子液体修饰的介孔分子筛所固定化的猪胰脂肪酶的最佳反应温度为38℃，且表观酶活显著提高，可见由本发明所制备的功能化离子液体修饰的介孔分子筛作为固定化载体固定的猪胰脂肪酶，其温度稳定性较之游离酶及未经修饰的介孔分子筛所固定化的猪胰脂肪酶明显提高。

按照本领域考察酶操作稳定性的常规方法考察了该功能化离子液体修饰的介孔分子筛及未经修饰的相应介孔分子筛所固定化的猪胰脂肪酶，结果如图5。由图5可知本发明所提供的经功能化离子液体修饰的介孔分子筛所固定化的猪胰脂肪酶较之未经修饰的相应介孔分子筛所固定化的猪胰脂肪酶具有更加优越的操作稳定性，前者重复使用5次后活性仍然在最初表观活性80％以上(而其中游离脂肪酶酶活为190IU/g脂肪酶)。

实施例2

1)介孔分子筛MCM-48的合成：依据Mobil公司在(Ordered mesoporous molecular sievessynthesized by a liquid-crystal template mechanism.Nature，1992.359(6397)：710-712)中的叙述，制备得到MCM-41分子筛原粉，孔径为5nm，比表面积为1500m²/g。

2)功能化离子液体的合成：1-丁基咪唑和氯代丙基三甲氧基硅烷在120℃下回流反应40小时(加干燥管)，冷却至室温得到产物.将得到的产物与KPF₆在丙酮中室温搅拌三天得到离子液体.得到产物过滤，洗涤，分液，减压蒸馏蒸出丙酮和水，得到离子液体，其中1-丁基咪唑、氯代丙基三甲氧基硅烷以及KPF₆摩尔比为1∶1∶1。

3)功能化离子液体修饰介孔分子筛固定化酶载体的制备：与实施例1修饰的操作条件和过程相同，加入离子液体的量与介孔分子筛原粉摩尔质量之比为1∶4。元素分析结果显示1g介孔分子筛原粉负载离子液体量为0.3mmol。

4)与实施例1制备固定化酶的操作条件相同，测得该载体制备的固定化猪胰脂肪酶的表观活性为650IU/g脂肪酶，而游离酶的酶活为190IU/g脂肪酶，未修饰的固定化猪胰脂肪酶的表观活性为250IU/g脂肪酶。

实施例3

5)1)介孔分子筛MCM-48的合成：依据Mobil公司在(Ordered mesoporous molecular sievessynthesized by a liquid-crystal template mechanism.Nature，1992.359(6397)：710-712)中的叙述，制备得到MCM-48分子筛原粉，孔径为8nm，比表面积为1400m²/g。

2)功能化离子液体的合成：1-乙基咪唑和氯代丙基三甲氧基硅烷在120℃下回流反应40小时(加干燥管)，冷却至室温得到产物。将得到的产物与KPF₆在丙酮中室温搅拌三天得到离子液体.得到产物过滤，洗涤，分液，减压蒸馏蒸出丙酮和水，得到离子液体.其中1-乙基咪唑、氯代丙基三甲氧基硅烷以及KPF₆摩尔比为1∶1∶1。

3)功能化离子液体修饰介孔分子筛固定化酶载体的制备：与实施例1修饰的操作条件和过程相同，加入离子液体的量与分子筛摩尔质量之比为1∶10。元素分析结果显示1g介孔分子筛原粉负载离子液体量为1mmol。

4)酶固定化：与实施例1制备固定化酶的操作条件相同(改用青霉素酰化酶)，在温度35℃，PH为7.5的磷酸盐缓冲溶液中，水解青霉素G反应10min，用酸碱滴定法(见实施例1)测得该载体制备的固定化青霉素酰化酶的表观活性为1600IU/g青霉素酰化酶，而游离酶的酶活为400IU/g青霉素酰化酶，未修饰的固定化青霉素酰化酶的表观活性为850IU/g青霉素酰化酶。

实施例4

1)介孔分子筛MCM-41的合成：依据Mobil Res.And Dev.Corp公司在(ANew Familyof Mesoporous Molecular Sieves Prepared with Liquid Crystal Templates.J.Am.Chem.Sot.1992，114，10834-10843.)中的叙述，制备得到MCM-41分子筛原粉，孔径为5nm，比表面积为1200m²/g。

2)功能化离子液体修饰介孔分子筛固定化酶载体的制备：将1g介孔分子筛原粉真空脱气处理后装入反应瓶中，加入氯代丙基甲氧基硅烷在50ml氯仿回流下进行偶联反应，再加入咪唑进行取代，接着引入官能团物质氯乙酸，然后加入KBF₄进行离子交换，得到功能化离子液体修饰介孔分子筛固定化酶载体，元素分析结果显示1g介孔分子筛原粉负载的离子液体量为0.3mmol。其中介孔分子筛原粉、氯代丙基甲氧基硅烷、咪唑、氯乙酸以及KBF₄的摩尔比为4∶1∶1∶1∶1。

3)酶固定化：与实施例1制备固定化酶的操作条件相同(改用青霉素酰化酶)，在温度35℃，PH为7.5的磷酸盐缓冲溶液中，水解青霉素G反应10min，用酸碱滴定法(见实施例1)测得该载体制备的固定化青霉素酰化酶的表观活性为1800IU/g青霉素酰化酶，而游离酶的酶活为400IU/g青霉素酰化酶，未修饰的固定化青霉素酰化酶的表观活性为850IU/g青霉素酰化酶。

实施例5

1)介孔分子筛MCM-41的合成：依据Mobil Res.And Dev.Corp公司在(A New Family ofMesoporous Molecular Sieves Prepared with Liquid Crystal Templates.J.Am.Chem.Sot.1992，114，10834-10843.)中的叙述，制备得到MCM-41分子筛原粉，孔径为6nm，比表面积为1400m²/g。

2)功能化离子液体修饰介孔分子筛固定化酶载体的制备：将1g介孔分子筛原粉真空脱气处理后装入反应瓶中，然后加入氯代丙基甲氧基硅烷在75ml氯仿回流下进行偶联反应，再加入咪唑进行取代，接着引入官能团物质溴乙醇，然后加入KPF₆进行离子交换，得到功能化离子液体修饰介孔分子筛固定化酶载体，元素分析结果显示1g介孔分子筛原粉负载的离子液体的量为0.15mmol。其中分子筛、氯代丙基甲氧基硅烷、咪唑、溴乙醇以及KPF₆的摩尔比为50∶1∶1∶1∶1。

3)酶固定化：与实施例1制备固定化酶的操作条件相同(改用淀粉酶))，在温度65℃，PH为6.5的缓冲溶液中，水解淀粉反应5min，用分光光度法(淀粉酶测定方法的探讨.江苏食品发酵，1996)测得该载体制备的固定化淀粉酶的表观活性为6U/ml，而游离酶的酶活为2U/ml，未修饰的固定化淀粉酶的表观活性为3.5U/ml淀粉酶。

实施例6

1)介孔分子筛SBA-15的合成：依据赵东元等人在(Triblock Copolymer Syntheses ofMesoporous Silica with Periodic 50to 300Angstrom Pores.Science，1998，279：548-553)中的叙述，制备得到SBA-15分子筛原粉，孔径为15nm，比表面积为300m²/g。

2)功能化离子液体修饰介孔分子筛固定化酶载体的制备：将1g介孔分子筛原粉真空脱气处理后装入反应瓶中，然后加入氯代丙基甲氧基硅烷在50ml氯仿回流下进行偶联反应，再加入咪唑进行取代，接着引入官能团物质氯乙胺，然后加入KBF₄进行离子交换，得到功能化离子液体修饰介孔分子筛固定化酶载体，元素分析结果显示1g介孔分子筛原粉负载的离子液体量为0.5mmol。其中分子筛、氯代丙基甲氧基硅烷、咪唑、氯乙醇以及KBF₄的摩尔比为20∶1∶1∶1∶1。

3)酶固定化：与实施例1制备固定化酶的操作条件相同(改用淀粉酶))，在温度65℃，PH为6.5的缓冲溶液中，水解淀粉反应5min，用分光光度法(淀粉酶测定方法的探讨.江苏食品发酵，1996)测得该载体制备的固定化淀粉酶的表观活性为6U/ml而游离酶的酶活为2U/ml，未修饰的固定化淀粉酶的表观活性为3.5U/ml淀粉酶。