鲍鱼壳抗氧化性水溶性物质提取方法

摘要

本发明提供一种鲍鱼壳抗氧化性水溶性多糖提取方法；属于解决水溶性多糖提取和鲍鱼壳废物利用技术领域；解决现有技术中对于鲍鱼壳的处理一般为研磨后药用或直接丢弃，利用率低下的问题；提取方法的步骤包括：所述提取方法的步骤包括：鲍鱼壳经过溶解、抽滤去沉淀后加入有机溶剂沉淀、离心分离、重溶、三氯乙酸法脱蛋白、膜分离去盐与色素得到水溶性多糖，可以制成抗氧化剂；鲍鱼壳资源丰富，提取容易，具有开发潜力。

说明书

技术领域

本发明属于水溶性多糖提取及鲍鱼壳废物利用技术领域，更具体涉及一种鲍鱼壳抗氧化性水溶性物质提取方法。

背景技术

从目前研究结果来看，氧自由基不仅与衰老有关而且与人类大部分常见疾病有关，从人类死亡率最高的心脑血管疾病到癌症以及艾滋病，无一不和自由基有密切关系。通过防止自由基产生以及清除已有自由基达到防病治病的目的。现在人工合成的抗氧化剂，具有一定毒性和诱变性，重复使用受到很大的限制，所以国内外研究人员正在寻找安全，有效地天然抗氧化剂。

鲍鱼属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、鲍螺科(Haliotidae)、鲍属(Haliotis)。鲍鱼壳有机基质分为水溶性有机基质(WSM)和非水溶性有机基质(water insoluble matrix，WISM)；一般对于鲍鱼壳的处理为研磨后药用或直接丢弃，利用率低下，未见鲍鱼壳中多糖成分提取以及抗氧化性分析的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种废弃鲍鱼壳具有抗氧化性水溶性多糖的提取方法；解决现有技术中对于鲍鱼壳的处理一般为研磨后药用或直接丢弃，利用率低下的问题，提取方法简单，该提取物具有天然抗氧化活性，可以制成抗氧化剂；鲍鱼壳资源丰富，提取容易，具有开发潜力。

本发明提取方法的步骤包括：所述提取方法的步骤包括：鲍鱼壳经过溶解、抽滤去沉淀后加入有机溶剂沉淀、离心分离、重溶、三氯乙酸法脱蛋白、膜分离去盐与色素得到抗氧化水溶性物质，即水溶性多糖。

本发明的优点为：提取物为多糖，每1kg鲍鱼壳粉得率最终获得精多糖6.67mg。本提取物中的活性多糖是由甘露糖；核糖；鼠李糖；葡萄糖；半乳糖、半乳糖醛酸、岩藻糖或阿拉伯糖等中的一种或多种的杂多糖，具有较高的清除超氧自由基的活性，可以制成抗氧化剂，鲍鱼壳资源丰富，提取容易，具有开发潜力；也对鲍鱼壳资源充分利用，变废为宝，成本低廉。

具体实施方式

鲍鱼壳原料：所有种类鲍鱼壳。

提取方法的具体步骤包括：

(1)将干燥的鲍鱼壳粉碎，加水浸泡，并于60℃-85℃下充分搅拌提取，搅拌提取时间为1-5小时，抽滤去残渣；提取2-3次，将上清液合并，冻干为粉末，该粉末为鲍鱼壳水溶性基质冻干粉；

(2)取步骤(1)得到的鲍鱼壳可溶性基质冻干粉溶于适量水中，制成鲍鱼壳水溶性基质水溶液，加入三倍体积的无水乙醇，保持温度为4℃的条件下静置1-12小时，离心分离收集沉淀，离心分离按照：10000rpm离心10min；对上清重复以上离心分离步骤2-3次，将沉淀汇总后用无水乙醇清洗，用蒸馏水溶解至完全重溶得到鲍鱼壳水溶性多糖粗提物；

(3)取步骤(2)中获得重溶的粗多糖提取物利用三氯乙酸法脱蛋白，每10ml重溶的粗多糖提取物加入(体积浓度)5％-15％三氯乙酸溶液5ml，摇匀于4℃的条件下静置1-12小时，10000rpm离心10min，上清液即为去蛋白溶液；

(4)取步骤(3)中获得去蛋白水溶液用1KD膜流水透析24-72小时除盐和色素后，于-60℃～-80℃真空冷冻干燥得到抗氧化水溶性物质，即水溶性多糖。

其中，步骤(1)中的鲍鱼壳用粉碎机粉碎成60-120目的粉末。

步骤(1)中的加水浸泡时鲍鱼壳粉末与水的体积比为1∶2-1∶8。

步骤(2)中的鲍鱼壳可溶性基质冻干粉与溶解用水的用量比例为：每10mg干粉约溶于1ml-5ml水中。

多糖含量的测定以苯酚-硫酸比色法：

(1)5％苯酚溶液配制：准确称取5g苯酚，于100ml容量瓶中用蒸馏水定容。

(2)标准曲线的制定：以105℃干燥至恒重的葡萄糖为标准品，精密称量，用蒸馏水溶解定容，使其浓度为0.1mg/mL。将标准溶液分别稀释成：0.01、0.02、0.04、0.06、0.08mg/ml的溶液。分别取各浓度标准溶液0.5ml置于具塞试管中，加入加入5％苯酚试液0.5ml，摇匀后迅速加入浓硫酸2.5mL，摇匀后静置至室温，于490nm处测定吸光度；另取蒸馏水0.5mL，加苯酚和硫酸，同上操作为空白对照。以葡萄糖的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为：Y＝7.5686X-0.0031(R2＝0.9994)，Y为吸光度，X为多糖浓度。

(3)样品溶液中多糖含量测定：取0.5ml样品溶液置于试管中，加入5％苯酚试液0.5ml，摇匀后，迅速加入浓硫酸2.5mL，摇匀后静置至室温，于490nm处测定吸光度(Y)代入回归方程得到X，即为样品溶液中多糖的浓度。

反相高效液相色谱(RP-HPLC)单糖组成分析：

(1)对照品溶液：精密称取80℃干燥至恒重的甘露糖，核糖，鼠李糖，葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、半乳糖醛酸对照品各2mg，置同一离心管中，加水1ml溶解并定容，精密量取25μl置5ml离心管中，加0.6mol/L氢氧化钠溶液25μl，混匀，再加0.4mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)-甲醇溶液50μl，混匀，70℃水浴100min；室温冷却10min后加0.3mol/L盐酸50μl中和，加水600μl，混匀，加氯仿1ml，涡旋3min，离心(8000×g)5min，取水相。自上述“加氯仿1ml”起重复操作3次，水相即为对照品溶液。

(2)供试品溶液：精密称取PS-1适量，加水稀释制成约25mg/ml的溶液，精密量取100μl置安瓿中，加2mol/L三氟乙酸150μl，封口，110℃水解2h，冷却至室温。打开安瓿，加甲醇200μl，用氮气吹干，重复操作3次。剩余物中加水50μl溶解，摇匀，量取25μl，按对照品溶液配制方法，自上述“置5ml离心管中，加0.6mol/L氢氧化钠溶液25μl”起操作，所得水相即为供试样品溶液，经过0.2μm滤膜过滤后进行色谱分析。

(3)色谱条件：色谱柱C18柱(4.6mm×250mm)；流动相为0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.7)-乙腈(83∶17)；流速1ml/min；检测波长254nm；柱温30℃；进样量20μl，通过与标准品比对处峰时间来判定成分，通过比对峰面积来确定含量。

以下是本发明的实施例，进一步说明本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

鲍鱼壳水溶性基质提取物的制备与纯化

闽产皱纹盘鲍壳冲洗干净，自然晾干后，粉碎机粉碎成60-120目的粉末。称取3kg粉末放入6L蒸馏水中，60℃搅拌溶解2h，取出混合液抽滤，残渣再用水提取两次后合并到混合液里，去掉沉淀后的上清液冻干成粉末，该冻干粉即为鲍鱼壳水溶性基质，共为0.3g。

每1g冻干粉溶于50ml水中，加入三倍体积的无水乙醇，4℃保温12小时，此后在4℃，10000rpm下离心分离10分钟，收集沉淀，对上清再醇沉1次，将两次沉淀合并后用无水乙醇清洗，此后用100mL蒸馏水重溶。

对重溶液脱蛋白：5％三氯乙酸法工作液∶水溶液(v∶v)＝1∶2，混匀后于4℃保温12小时，10000rpm离心10min，上清液即为去蛋白溶液；用1KD膜流水透析24小时除盐和色素后于-60℃--80℃真空冷冻干燥即得到水溶性多糖，为20mg；其中多糖的含量为7mg(约为35％)。

该水溶性多糖为淡黄色粉末，水溶性较好，不溶于乙醇，乙醚等。

实施例2

鲍鱼壳水溶性基质提取物的制备与纯化

闽产皱纹盘鲍壳冲洗干净，自然晾干后，粉碎机粉碎成60-120目的粉末。称取3kg粉末放入18L蒸馏水中，80℃搅拌溶解3h，取出混合液抽滤，残渣再用水提取两次后合并到混合液里，去掉沉淀后的上清液冻干成粉末，该冻干粉即为鲍鱼壳水溶性基质，共0.9g。

每1g冻干粉溶于50ml水中，加入三倍体积的无水乙醇，4℃保温12小时，此后在4℃，10000rpm下离心分离10分钟，收集沉淀，对上清再醇沉1次，将两次沉淀合并后用无水乙醇清洗，此后用100mL蒸馏水重溶。

对重溶液脱蛋白：10％三氯乙酸法工作液∶水溶液(v∶v)＝1∶2，混匀后于4℃保温12小时，10000rpm离心10min，上清液即为去蛋白溶液；用1KD膜流水透析24小时除盐和色素后于-60℃--80℃真空冷冻干燥即得到水溶性多糖，共60mg其中多糖的含量为20mg(约为33.3％)。

该水溶性多糖为淡黄色粉末，水溶性较好，不溶于乙醇，乙醚等。

实施例3

鲍鱼壳水溶性基质提取物的制备与纯化

闽产皱纹盘鲍壳冲洗干净，自然晾干后，粉碎机粉碎成60-120目的粉末。称取3kg粉末放入24L蒸馏水中，70℃搅拌溶解4h，取出混合液抽滤，残渣再用水提取两次后合并到混合液里，去掉沉淀后的上清液冻干成粉末，该冻干粉即为鲍鱼壳水溶性基质，共0.8g。

每1g冻干粉溶于50ml水中，加入三倍体积的无水乙醇，4℃保温12小时，此后在4℃，10000rpm下离心分离10分钟，收集沉淀，对上清再醇沉1次，将两次沉淀合并后用无水乙醇清洗，此后用100mL蒸馏水重溶。

对重溶液脱蛋白：15％三氯乙酸法工作液∶水溶液(v∶v)＝1∶2，混匀后于4℃保温12小时，10000rpm离心10min，上清液即为去蛋白溶液；用1KD膜流水透析24小时除盐和色素后于-60℃--80℃真空冷冻干燥即得到水溶性多糖，为52mg；其中多糖的含量为18mg(约为34.6％)。

该水溶性粗多糖为淡黄色粉末，水溶性较好，不溶于乙醇，乙醚等。

抗氧化活性测定

O₂^-·体系中抗氧化活性测定

试管中依次加入1.0ml 75mmol/L磷酸盐缓冲液(pH＝7.8)，待测样品0.2ml，0.1mol/L盐酸羟胺溶液0.1ml，75mmol/L黄嘌呤氢氧化钠溶液0.1ml，0.1U/ml黄嘌呤氧化酶0.1ml，摇匀后置于37℃水浴30min，加入2.0mL显色剂，静置10min于530nm处测定吸光度Ai；0.2ml蒸馏水代替待测样品，其它不变，测得吸光度Ao。以2.3ml双蒸水代替黄嘌呤氧化酶和显色剂，其它不变，用以调零。清除率计算根据公式：

式中：Ai为加入抗氧化剂后的吸光度；Ao为未加入抗氧化剂的吸光度。

研究表明经粗提后鲍鱼壳多糖的抗氧化性较鲍鱼壳可溶性基质有显著提高，见表1中，提取多糖具有较强的超氧自由基清除活性。提取多糖超氧自由基清除能力较强；具体结果见表2中。

表1粗提后鲍鱼壳WSM抗氧化性结果数据表

    A 530    O2-·/％    WSM浓缩液    0.116    75.77    WSM一次醇沉上清    0.332    30.33    WSM一次醇沉粗多糖    0.087    81.74

说明：上清和多糖都重溶到所取浓缩液的体积。

表2鲍鱼壳WSM多糖提取物与VC抗氧化性比较结果数据表

说明：多糖浓度由苯酚-硫酸法测定后调整获得。