一种用金磁微粒纯化总核酸的方法

摘要

本发明属于核酸纯化领域，尤其涉及一种用金磁微粒纯化总核酸(包括基因组DNA和总RNA)的方法。该方法包括制备含有总核酸的样品裂解液；将金磁微粒与生物样品裂解液混合，在结合缓冲液的作用下，形成金磁微粒-总核酸复合物；对金磁微粒-总核酸复合物磁性分离，进行清洗；然后用洗脱液将总核酸从金磁微粒表面洗脱下来，磁性分离后收集上清液，即得纯化的总核酸溶液。该纯化方法不需要离心，操作简便，纯化过程快速，得到总核酸质量高且成本低廉，并可同时分离得到生物样本中的基因组DNA和RNA。

说明书

技术领域

本发明属于核酸纯化领域，涉及一种对总核酸(包括基因组DNA和总RNA)进行纯化的方法，具体涉及一种用金磁微粒纯化总核酸的方法。

背景技术

在过去的几十年，分子生物学研究经历了突飞猛进的发展。随着技术的进步，核酸纯化已经成为分子生物学研究准备阶段的必备工作。疾病诊断、克隆、测序、扩增、杂交、cDNA分析等实验操作的首要步骤就是纯化出完整、高质量的核酸。因此，寻求快速、可靠、具有可重复性的核酸纯化方法一直以来为人们所关注。

目前使用的核酸纯化方法大体上可分为液相分离和固相分离两大类。传统的液相分离纯化方法需要经过一系列复杂的沉淀和清洗步骤，不仅耗时而且费力。同时，繁多的纯化步骤还增加了核酸降解、核酸损失以及交叉污染的可能性，造成低得率、低纯度。该方法首先需要用变性剂或离液剂以及蛋白酶对生物样本进行裂解，再用有机溶剂如酚、氯仿或醇对裂解的生物样本进行处理。而清理这些对人体有剧毒的有机溶剂又需要一笔昂贵的费用。近些年来，基于吸附作用的固相分离纯化技术得到了进一步的发展，该吸附过程可通过以下四种方式得以实现：①在离液剂存在的条件下，核酸与亲水性基质间的氢键作用；②通过阴离子交换剂实现水相中的离子交换；③亲和吸附；④用于DNA纯化的分子排阻机制。

利用磁性载体进行的核酸分离纯化属于固相分离纯化法的一种。与非磁性分离纯化方法相比，磁性分离纯化法具有显著优势，其纯化过程简单、快速且纯化质量高，无需使用酚、氯仿等有机溶剂。目前，国内此类研究起步较晚，产品参差不齐，纯化质量不高，而Qiagen、Ambion等国外公司的类似产品价格又十分昂贵，不能得到普遍应用。

专利CN 1580067A、CN1995052A以及CN 101354938A所涉及的核酸的磁性分离方法都需对磁粒进行目的核酸探针的修饰，然后再用经过修饰的磁粒分离纯化得到目的核酸。该过程不但复杂，而且属于特异性分离，不能将生物样本的总核酸同时纯化出来。

金磁微粒，即组装型磁性复合微粒和核/壳型超顺磁性复合微粒，其制备方法以及结构组成已经在中国专利ZL 03153486.4和ZL 03124061.5分别进行了公开，本专利即利用该自主研发的金磁微粒提供一种能够快速、有效且成本低廉的纯化生物样本总核酸的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便、快速、纯化质量高且成本低廉的利用金磁微粒纯化总核酸的方法，通过此方法能够同时纯化出基因组DNA和RNA。

本发明的技术解决方案是：

一种用金磁微粒纯化总核酸(包括基因组DNA和总RNA)的方法，其特殊之处在于，该方法包括以下步骤：

1)制备含有总核酸的样品裂解液

用裂解液对生物样本进行裂解，得到含有总核酸的样品裂解液；

2)结合

将金磁微粒与含有总核酸的样品裂解液混合，在结合缓冲液的作用下，形成金磁微粒-总核酸复合物；

3)清洗

对含有金磁微粒-总核酸复合物的溶液进行磁性分离，弃去上清液，再加入清洗液混匀，磁性分离，弃上清，得到金磁微粒-总核酸复合物；

4)洗脱

将洗脱液与金磁微粒-总核酸复合物混匀，使总核酸从金磁微粒上转到洗脱液中，磁性分离直至上清澄清，收集上清液，所得上清液即为纯化得到的总核酸溶液。

上述步骤4)纯化得到的总核酸，经过核酸酶的处理，还可以分别得到基因组DNA和总RNA，具体实现方法是：将步骤4)纯化得到的总核酸通过DNase消化，可以得到总RNA；或将步骤4)纯化得到的总核酸通过RNase消化，可以得到基因组DNA。

上述金磁微粒是指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面包裹单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复合微粒。所述磁性纳米粒子包括Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃等铁的氧化物粒子，单质Fe、Co、Ni粒子，或由Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子；磁性纳米粒子的聚集体是指经修饰后形成的Fe3O4、γ-Fe2O3等铁的氧化物粒子聚集体，经修饰后形成的单质Fe、Co、Ni粒子聚集体，或经修饰后形成的Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子聚集体。

上述步骤1)的裂解液是胍盐裂解液或锂盐裂解液；所述胍盐是硫氰酸胍或盐酸胍，浓度为0.2M～20M；所述锂盐是LiCl或LiBr，浓度为2M～12M。

上述步骤2)的结合缓冲液含聚乙二醇和盐，所述聚乙二醇的分子量在6000～10000之间，浓度为10％～30％(W/V)，所述盐是氯化钠、氯化锂、氯化钾、氯化镁、氯化钙、氯化钡或氯化铯，浓度为1M～10M。

上述步骤3)的清洗液是浓度为50％～90％(V/V)的乙醇溶液。

上述步骤4)的洗脱液为pH＝7.0～8.0，浓度为0.001M～0.1M的TE缓冲液或无核糖核酸酶水。

上述步骤1)用于纯化总核酸的生物样本包括血液、细胞、细菌、植物组织和动物组织。

利用本方法纯化鼠肝脏组织基因组DNA的电泳图片如图3所示；

利用本方法从硫酸盐还原菌中纯化总核酸的电泳图片和紫外图谱如图4所示；

利用本方法从拟南芥植物中纯化总核酸的电泳图片和紫外图谱如图5所示；

利用本方法从Jurkat细胞中纯化总核酸的电泳图片和紫外图谱如图6所示；

利用本方法纯化的总核酸进行β-actin基因的RT-PCR的电泳图片如图8所示。

本发明的优点是：

1、该方法整个纯化过程不需要离心：分离过程由磁性分离实现，这不但避免了离心过程中可能带来的交叉污染，而且能够避免多次离心过程产生的剪切力对核酸的破坏。

2、纯化得到的总核酸纯度高：由于在清洗过程中核酸-磁粒的复合物充分分散悬浮在清洗液中，清洗彻底，因此该纯化方法得到的总核酸纯度高，能够去除抑制酶反应的抑制剂。

3、纯化过程快速：该方法中无需对金磁微粒包裹核酸探针，可将金磁微粒直接用于核酸纯化。整个纯化过程可在不到一个小时内完成，操作简便、快速。

4、本发明在进行核酸纯化过程中，核酸与金磁微粒的结合属于非特异性吸附，因此纯化得到的核酸不具有专一性，可以同时分离得到生物样本中的基因组DNA和RNA。

附图说明

图1为利用本方法纯化鼠肝脏组织中总核酸的电泳图片；

图2为利用本方法纯化鼠肝脏组织中总RNA的电泳图片；

图3为利用本方法纯化鼠肝脏组织基因组DNA的电泳图片；

图4为利用本方法从硫酸盐还原菌中纯化总核酸的电泳图片和紫外图谱；

图5为利用本方法从拟南芥植物中纯化总核酸的电泳图片和紫外图谱；

图6为利用本方法从Jurkat细胞中纯化总核酸的电泳图片和紫外图谱；

图7为利用本方法从兔血中纯化总核酸的电泳图片和紫外图谱；

图8为利用本方法纯化的总核酸进行β-actin基因的RT-PCR的电泳图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明金磁微粒纯化总核酸的方法作进一步的说明。实施例1：用金磁微粒从鼠肝脏组织中纯化总核酸的方法

1)制备含有总核酸的样品裂解液

1.1)取50mg鼠肝脏组织放入玻璃匀浆器，加入1ml胍盐裂解液匀浆。该胍盐裂解液含2M盐酸胍；

1.2)将样品裂解液移入一2ml离心管中，置于冰上备用；

2)结合

2.1)取100μl金磁微粒于另一支2ml离心管中，将其置于磁性分离器上磁性分离直至上清澄清，弃去上清液；

2.2)取下离心管，向管中加入600μl结合缓冲液，混匀备用。该结合缓冲液含1M的NaCl和10％(W/V)的聚乙二醇，其中聚乙二醇的分子量是8000；

2.3)用移液器移取步骤1.2)的样品裂解液600μl于步骤2.2)的离心管中，吹吸混匀，室温静置5min，然后将离心管置于磁性分离器上，磁性分离至上清澄清，弃去上清液；

3)清洗

取下离心管，向管中加入600μl浓度为75％(V/V)的乙醇溶液，吹吸混匀，将其置于磁性分离器上，弃去上清液；重复清洗两次，在室温晾干5min；

4)洗脱

向管中加入200μl无核酸酶水，吹吸混匀，室温静置5min；然后将离心管置于磁性分离器上分离至上清澄清，并将上清液移入另一离心管中，保存备用。所得上清液即为从鼠肝脏组织中纯化得到的总核酸溶液。图1为该方法从鼠肝组织中纯化总核酸的电泳图片。

实施例2：从鼠肝脏组织中纯化总RNA的方法

1)制备含有总核酸的样品裂解液

1.1)取50mg鼠肝脏组织放入玻璃匀浆器，加入1ml锂盐裂解液匀浆。该锂盐裂解液含3M的LiCl；

1.2)将样品裂解液移入一2ml离心管中，置于冰上备用；

2)结合

2.1)取100μl金磁微粒于另一支2ml离心管中，将其置于磁性分离器上磁性分离直至上清澄清，弃去上清液；

2.2)取下离心管，向管中加入600μl结合缓冲液，混匀备用。该结合缓冲液含1M的NaCl和10％(W/V)的聚乙二醇，其中聚乙二醇的分子量是8000；

2.3)用移液器移取步骤1.2)的样品裂解液300μl于步骤2.2)的离心管中，吹吸混匀，室温静置5min，然后将离心管置于磁性分离器上，磁性分离至上清澄清，弃去上清液；

3)清洗

取下离心管，向离心管中加入600μl浓度为75％(V/V)的乙醇溶液，吹吸混匀，将其置于磁性分离器上，弃去上清液，室温晾干5min；

4)消化

向离心管中加入85μl无核酸酶水、10μl RDD buffer和5μl DNase，吹吸混匀，室温静置15min；

5)再结合

向离心管中加入600μl结合缓冲液吹吸混匀，室温静置2min；将离心管置于磁性分离器上，磁性分离至上清澄清，弃去上清液。该结合缓冲液含1M的NaCl和10％(W/V)的聚乙二醇，其中聚乙二醇的分子量是8000；

6)清洗

重复步骤3)两次，室温晾干5min；

7)洗脱

向离心管中加入200μl无核酸酶水，吹吸混匀，室温静置5min；然后将离心管置于磁性分离器上分离至上清澄清，并将上清液移入另一离心管中，保存备用。所得上清液即为从鼠肝脏组织中纯化得到的总RNA溶液。图2为该方法从鼠肝组织中纯化总RNA的电泳图片。

实施例3：从兔血中纯化总核酸的方法

1)制备含有总核酸的样品裂解液

1.1)取600μl新鲜兔血抗凝血液于2ml离心管，加入600μl的胍盐裂解液吹吸混匀。该胍盐裂解液含2M盐酸胍；

1.2)3000g离心1min，将沉淀甩至管底，吸取约600μl上清液于另一离心管中备用；

2)结合

2.1)取100μl金磁微粒于另一支2ml离心管中，将其置于磁性分离器上磁性分离直至上清澄清，弃去上清液；

2.2)取下离心管，向管中加入600μl结合缓冲液，混匀备用。该结合缓冲液含1M的NaCl和10％(W/V)的聚乙二醇，其中聚乙二醇的分子量是8000；

2.3)用移液器移取步骤1.2)的上清液600μl于步骤2.2)的离心管中，吹吸混匀，室温静置5min，然后将离心管置于磁性分离器上，磁性分离至上清澄清，弃去上清液；

3)清洗

取下离心管，向离心管中加入600μl浓度为75％(V/V)的乙醇溶液，吹吸混匀，将其置于磁性分离器上，弃去上清液；重复清洗两次，在室温晾干5min；

4)洗脱

向管中加入200μl无核酸酶水，吹吸混匀，室温静置5min；然后将离心管置于磁性分离器上分离至上清澄清，并将上清液移入另一离心管中，保存备用。所得上清液即为从兔血中纯化得到的总核酸溶液。图7为该方法从兔血中纯化总核酸的电泳图片和紫外光谱。