测量细胞的物理性质值的方法和物理性质测量设备

摘要

本发明提供测量细胞的物理性质值的方法和物理性质测量设备。首先，对作为测量对象的细胞的形状进行模拟，并且，通过数值分析获得在对细胞施加交流电场时的复数电容率响应(步骤S1)。在改变膜电容C

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于测量细胞的物理性质的方法和设备。更具体地说，本发明涉及一种利用介电谱法(dielectric spectroscopy)来测量细胞的电特性的技术。

背景技术

通常，已知在细胞中诸如电导率、电容率和介电常数的表现出电特性的物理性质值(physical property value)随着细胞的种类、状态等而改变。例如，与其中含有较少水的皮肤细胞的情况相比，肌细胞和神经细胞显示出细胞外液和细胞内液的高的电导率值(在下文中称为细胞质电导率)。另外，当通过扫描(sweep)频率来测量细胞的电容率时，介电弛豫特性(dielectric relaxation chracteristics)随着细胞的形态而改变。因此，通过利用这种特性，对细胞的定性和定量的分析、识别、以及进一步的对疾病的存在或不存在的确认等变得可能。而且，迄今为止，还提出了利用细胞间的介电特性之差的技术作为通过流式细胞术(flow cytometry)来彼此分离细胞等的识别方法(例如，参见专利文献1和2)。

另一方面，由于细胞在电场作用下导致界面极化(麦克斯韦-瓦格纳(Maxwell-Wagner)极化)，所以在对其中含有细胞的溶液进行介电谱法测量时，获得复数电容率的频率色散(frequencydispersion)。此外，在将诸如麦克斯韦-瓦格纳方程的弛豫表达式应用于所得到的介电谱时，获得表现出细胞的电特性的物理性质值，例如细胞质电导率κ_i和膜电容C_m。通过以这样的方式利用介电谱法来测量诸如血细胞的细胞的电特性，从而使得以无损的(nondisruptive)方式知道细胞的状态成为可能。

专利文献1：JP-T-2003-507739的译文的公开

专利文献2：JP-T-2005-512042的译文的公开

发明内容

然而，上述的现有技术涉及下面所示出的问题。也就是说，遇到这样的问题：尽管细胞的形状在很大程度上影响界面极化，但是常规上一直用于分析的麦克斯韦-瓦格纳方程仅仅在具有球形或椭圆形的细胞中成立。图10是示出盘状红细胞(Discocyte)的扫描电子显微镜(SEM：1500倍放大率)图片，图11是示出刺毛状红细胞(Echinocyte)的SEM图片(1500倍放大率)。如图10所示，具有正常形状的红细胞呈其中心微凹的盘状形状。另外，由于血细胞的形状随着身体的状态、疾病等敏感地改变，所以还存在具有如图11所示的刺毛形状的红细胞。尽管如上所述存在具有各种形状的细胞，但是利用介电谱法的方法无法应用于具有除球形和椭圆形以外的各个形状的任何细胞。因此，迄今为止，对于具有非各向同性(nonisotropic)形状的这些细胞，诸如细胞质电导率κ_i和膜电容C_m的表现出电特性的物理性质值一直不能以无损的方式被知道。

因此，根据上述内容，本发明的主要目的是提供一种测量细胞的物理值的方法、以及物理性质测量设备，利用该方法和该设备中的每一个，同样地，对于具有非各向同性形状的细胞，表现出其电特性的物理性质值也能够以无损的方式被测量。

根据本发明的测量细胞的物理性质值的方法包含：计算过程，用于通过设置任意的膜电容C_m和任意的细胞质电导率κ_i来计算关于具有特定形状的细胞的介电谱，从而进行数值分析；获得过程，用于通过将介电谱回归为介电弛豫表达式来获得细胞的相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ；以及产生过程，用于基于相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ产生与细胞的形状相对应的回归表达式。

除了上述过程以外，测量细胞的物理性质值的方法还可以包含下述过程：测量细胞的介电谱；以及将测量结果与回归表达式相互比较，从而获得细胞的膜电容C_m，exp和细胞质电导率κ_i，exp。

另外，还有可能的是，针对细胞的每一种形状，产生回归表达式，并且，通过应用与细胞的形状相对应的回归表达式来获得膜电容C_m，exp和细胞质电导率K_i，exp。

而且，例如，细胞还可以具有非各向同性的形状。

另一方面，根据本发明的物理性质测量设备包含：计算部件，用于通过设置任意的膜电容C_m和任意的细胞质电导率κ_i来计算关于具有特定形状的细胞的介电谱，从而进行数值分析；获得部件，用于通过将介电谱回归为介电弛豫表达式来获得细胞的相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ；以及产生部件，用于基于相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ产生与细胞的形状相对应的回归表达式。

根据本发明，将实际测量的介电谱与通过模拟产生的回归表达式相互比较，从而确定作为测量对象的细胞的膜电容C_m，exp和细胞质电导率κ_i，exp。因此，对于不适用于常规弛豫表达式的具有非各向同性形状的细胞，能够以无损的方式获得该细胞的表现出电特性的物理性质值，例如，细胞质电导率κ_i和膜电容C_m。

附图说明

[图1]

图1是按其过程顺序示出根据本发明实施例的测量细胞的物理性质值的方法的流程图。

[图2]

图2是示出盘状红细胞的模拟模型的视图。

[图3]

图3是示出刺毛状红细胞的模拟模型的视图。

[图4]

图4(a)和(b)分别是均示出通过计算获得的盘状红细胞的回归曲面的视图，图4(a)是关于相对电容率的增量Δε的3D曲面，图4(b)是关于弛豫时间τ的3D曲面。

[图5]

图5(a)和(b)分别是均示出通过计算获得的刺毛状红细胞的回归曲面的视图，图5(a)是关于相对电容率的增量Δε的3D曲面，图5(b)是关于弛豫时间τ的3D曲面。

[图6]

图6是示出通过计算获得的值与对盘状红细胞实际测量的值之间的关系的曲线图，其中，细胞质电导率κ_i被描绘在横轴上，膜电容C_m被描绘在纵轴上。

[图7]

图7是示出通过计算获得的值与对刺毛状红细胞实际测量的值之间的关系的曲线图，其中，细胞质电导率κ_i被描绘在横轴上，膜电容C_m被描绘在纵轴上。

[图8]

图8是示出盘状红细胞的介电色散(dielectric dispersion)的图形表示，其中，频率被描绘在横轴上，复数电容率(ε’，ε”)被描绘在纵轴上。

[图9]

图9是示出刺毛状红细胞的介电色散的图形表示，其中，频率被描绘在横轴上，复数电容率(ε’，ε”)被描绘在纵轴上。

[图10]

图10是用于代替盘状红细胞的图的图片(1500倍放大率的SEM图片)。

[图11]

图11是用于代替刺毛状红细胞的图的图片(1500倍放大率的SEM图片)。

具体实施方式

在下文中，参照附图详细描述实施本发明的最佳方式。图1是按其过程顺序示出根据本发明实施例的测量细胞的物理性质值的方法的流程图。如图1所示，在本实施例的测量细胞的物理性质值的方法(在下文中也简称为测量方法)中，首先，对于诸如正常红细胞和刺毛状红细胞的均具有非各向同性形状的细胞，通过使用均具有非各向同性形状的细胞的形状模型，以数值分析的方式获得在交流电场施加到特定的各向同性的三维形状时的复数电容率响应，其中，在每一个各向同性的三维形状中，外相和内相通过薄膜隔开(步骤1)。尽管此时的计算方法绝不受特别的限制，但是，例如，可以利用三维有限差分方法等。

接下来，在膜电容C_m和细胞质电导率κ_i相互独立地被改变的同时，基于在步骤S1中获得的复数电容率响应进行数值计算，从而计算具有各个形状的细胞的介电谱(步骤S2)。

接下来，根据在步骤S2中获得的每一个介电谱计算相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ的两个参数(步骤S3)。尽管通过将每一个细胞的介电谱回归到在下面示出的表达式1中示出的Cole-Cole(科尔-科尔)型弛豫表达式，每一个细胞的介电谱通过简单的弛豫表达式不能被完全表达，但是每一个细胞的介电谱可以被转换为表现出介电弛豫特性的三个值，即，相对电容率的增量Δε、弛豫时间τ和表现出弛豫的扩展(spreading)的Cole-Cole参数β。然后，在本实施例中，通过使用在下面示出的表达式1中示出的Cole-Cole型弛豫表达式，对从计算获得的每一个介电谱的实部(ε’)进行拟合，从而获得相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ。请注意，在下面示出的表达式1中，ω是角频率，ε₀是真空的电容率，κ₁是处于低频率极限的溶液的电导率，ε_∽是处于高频率极限的相对电容率，并且i²＝-1。

[表达式1]

ε*(ω)＝Δε/{1+(i×ω×τ)^β}+ε_∽+κ_l/(i×ω×ε₀)

接下来，基于在步骤S3中计算的相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ，针对细胞的每一种形状，获得相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ对(C_m，κ_i)的依赖，从而产生回归表达式(步骤S4)。尽管细胞的形状在很大程度上影响从每一个介电谱获得的系数，但是人们认为，由于细胞的极化的本质就是界面极化，所以，相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ对(C_m，κ_i)的依赖形成与麦克斯韦-瓦格纳方程的函数形式相同的函数形式。因此，在本发明的测量方法中，设置在下面示出的表达式2和表达式3中示出的关系，并且，针对在步骤S3中获得的结果，对常数a、b、c和d进行多元回归分析，从而获得相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ对(C_m，κ_i)的依赖。请注意，在下面示出的表达式2中的p是从用于步骤S1中的每一种形状的模型获得的细胞的体积百分率(volume fraction)。

[表达式2]

Δε/P＝f(C_m，κ_i)＝(a×C_m)/(1+b×κ_i)

[表达式3]

τ＝g(C_m，κ_i)＝C_m×(C/κ_i+d)

这样，以数值分析的方式，针对细胞的每一种形状，预先获得复数电容率的频率色散，并且，将数值分析的结果回归为介电弛豫表达式，从而针对相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ对(C_m，κ_i)的依赖产生回归。因此，同样地，对于不适用于常规弛豫表达式的具有非各向同性形状的细胞，也能够以无损的方式快速、容易地获得该细胞的表现出电特性的物理性质值，例如，细胞质电导率κ_i和膜电容C_m。

另外，在通过首先针对分散到正常的盐溶液等中的作为测量对象的细胞使用本实施例的测量方法来获得细胞的细胞质电导率κ_i和膜电容C_m时，通过使用阻抗分析仪等扫描频率来测量该细胞的复数电容率。接下来，通过使用在下面描述的表达式1中示出的Cole-Cole型弛豫表达式，对所得到的介电谱的实部(ε’)进行拟合，从而获得相对电容率的增量Δε_exp和弛豫时间τ_exp。此外，将(Δε_exp，τ_exp)和在步骤S4中产生的回归表达式(f(C_m，κ_i)，g(C_m，κ_i))相互比较，从而确定作为测量对象的细胞的膜电容C_m，exp和细胞质电导率κ_i，exp(步骤S5)。

如上所述，在本实施例的测量方法中，将实际测量的介电谱与通过模拟产生的回归表达式相互比较，从而确定作为测量对象的细胞的膜电容C_m，exp和细胞质电导率κ_i，exp。因此，同样地，针对不适用于常规弛豫表达式的具有非各向同性形状的细胞，也能够以无损的方式测量该细胞的表现出电特性的物理性质值。另外，相比于通过估计关于细胞质电导率等未知量从而进行数值计算所获得的介电谱中，选出与实际测量的介电谱最相符的介电谱从而推导测量样品的假定数目的本实施例的方法，能够大大地缩短测量所需的劳力和时间。

另外，通过使用本实施例的测量方法确定的细胞的物理性质值可以被转换为要用于疾病的诊断等中的信息，例如，膜蛋白的解吸和细胞质的异常。而且，例如，在血细胞计数器中，不仅计数而且直到血细胞的状态都能够同时被高速地测量，并且，关于异常细胞的比率(rate)的统计研究等也成为可能。

应该注意，在上面描述的实施例中，作为例子描述了获得细胞质电导率κ_i和膜电容C_m的情况，但是本发明绝不局限于此。因此，关于细胞的物理性质值，除了细胞质电导率κ_i和膜电容C_m以外，例如，还可以测量膜电导率、细胞质电容率等。

另外，可以通过使用用于执行上述过程的设备来执行本实施例的测量方法。用于本实施例中的测量细胞的物理性质值的设备所需要的仅仅是至少包含：计算部件，用于通过设置任意的膜电容C_m和任意的细胞质电导率κ_i来计算关于具有特定形状的细胞的介电谱，从而进行数值分析；获得部件，用于通过将介电谱回归为介电弛豫表达式来获得细胞的相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ；以及产生部件，用于基于相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ产生与细胞的形状相对应的回归表达式。

例子

在下文中，在不脱离本发明的范围的情况下，将本发明的例子与比较例进行比较，以具体地扫描本发明的效果。应该注意，本发明绝不局限于下面描述的例子。在本例子中，通过使用在图1中示出的测量细胞的物理性质值的方法，测量具有各种形状的细胞的细胞质电导率κ_i和膜电容C_m。

首先，对兔子保存血(由KOHJINBIO Co.，Ltd.制造)进行离心处理，从而仅仅提取红细胞。此外，将这样提取的红细胞分散到正常的盐溶液中，该盐溶液的浓度被调整为具有pH5.3，从而制备球形红细胞(spherocyte)的样品(No.1)。将这样提取的红细胞分散到正常的盐溶液中，该盐溶液的浓度被调整为具有pH8.5，从而制备盘状红细胞的样品(No.2)。此外，将这样提取的红细胞分散到正常的盐溶液中，该盐溶液的浓度被调整为具有pH7.7，从而制备刺毛状红细胞的样品(No.3)。应该注意，尽管出于获得球形红细胞的目的，一般来说，通过利用渗透压差来制备样品，但是，在本例子中，为了使血细胞的形状一致，通过使用上述的技术来制备样品。另外，使用显微镜观察每一个样品，结果，均具有作为测量对象的形状的红细胞与红细胞总数之比按数量的百分率计是90％或更大。而且，在本例子中，出于参考的目的，还通过将正常红细胞分散到磷酸盐缓冲液(PBS)中来制备样品(No.4)。

接下来，针对使用上述方法制备的每一种样品，在使用阻抗分析仪(由Agilent Technologies，Inc.制造的4294A)将电极极化抑制在10kHz至110MHz的范围的同时，测量电容率。此外，对于球形红细胞的样品(No.1)，使用已知值，即，相对电容率ε_a＝78.3、电导率κ_a＝1.67S/m、外水相(outer aqueous phase)的细胞膜电导率κ_m＝1×10^-7S/m，并且，将薄壳的麦克斯韦-瓦格纳方程应用于通过测量获得的介电谱，从而获得体积百分率P、细胞膜的每单位面积的膜电容C_m(＝ε_m·ε₀/d_m，其中d_m是膜厚度，ε_m是膜的相对电容率，ε₀是真空的相对电容率)、以及红细胞的内水相(inner aqueous phase)的电容率ε_i和电导率κ_i。

另一方面，关于盘状红细胞和刺毛状红细胞，通过使用椭圆形模型和球形模型来计算体积百分率P，并且使用三维有限差分方法通过模拟来获得复数电容率。请注意，使用光显微镜来测量盘状红细胞的长轴的长度，结果，证明是大约7.9μm，该长度与人类的红细胞(RBC)的形状的长度近似相等。然后，通过参考人类的RBC的表达式，对盘状红细胞进行模拟。另外，尽管刺毛状红细胞在突出体(protrusion)的数目方面也具有多样性，因此存在具有多种形状的刺毛状红细胞，但是在本例子中，基于使用光显微镜进行的观察的结果来进行模拟。图2是示出盘状红细胞的模拟结果的视图，图3是示出刺毛状红细胞的模拟结果的视图。

在对稀释度(diluteness)的假设在正常形状中成立时，在主轴的方向与电场彼此垂直地相交或者彼此平行的情况中获得分辨率，并且用要平均的概率密度对它们进行加权，从而使得获得复数电容率成为可能。然后，用小体积百分率P(P≤0.04％)进行计算，使得对稀释度的假设成立，并且，用在下面示出的表达式4和表达式5中示出的P对计算结果(ε’，ε”)进行归一化。请注意，在下面示出的表达式5中的κ_l是低频率极限中的电导率。

[表达式4]

ε’＝(ε-ε_a)/P

[表达式5]

ε”＝(κ-κ_l)/(ε_v ×ω×P)

接下来，在膜电容C_m和细胞质电导率κ_i彼此独立地被改变的同时，针对盘状红细胞和刺毛状红细胞，在总共25种条件下针对这些形状进行数值计算，从而分别针对盘状红细胞和刺毛状红细胞计算介电谱。其后，出于容易表征通过计算获得的介电谱的目的，通过使用表达式1中示出的Cole-Cole型弛豫表达式来对各个时间点进行拟合，从而计算相对电容率的增量Δε和弛豫时间τ。此外，对关于这25种条件的计算结果进行多元回归分析，从而确定上述的表达式2和表达式3中的常数a、b和c。结果，在盘状红细胞的情况中，获得这些值：a＝1.10×10⁶m²/F、b＝2.86×10^-2m/S、c＝4.52×10^-6m、以及d＝1.19×10^-6m²/S。另外，在刺毛状红细胞的情况中，获得这些值：a＝2.08×10⁶m²/F、b＝5.26×10^-3m/S、c＝1.02×10^-5m、以及d＝2.16×10^-6m²/S。图4(a)和(b)分别是示出盘状红细胞的回归曲面的视图。图4(a)是关于相对电容率的增量Δε的3D曲面，图4(a)是关于弛豫时间τ的3D曲面。另外，图5(a)和(b)分别是示出刺毛状红细胞的回归曲面的视图。图5(a)是关于相对电容率的增量Δε的3D曲面，图5(a)是关于弛豫时间τ的3D曲面。

接下来，对于No.2和No.3的样品的介电谱(实际测量的值)，类似地，使用上述表达式1中示出的Cole-Cole型弛豫表达式来对其复数电容率的实部(ε’)进行拟合，从而计算弛豫参数(Δε_exp，τ_exp)，在No.2和No.3的样品中的每一个中，细胞质电导率κ_i和膜电容C_m是未知的。此外，分别获得曲面即在图4和图5中示出的回归曲面，其中，共同具有Δε＝Δε_exp且τ＝τ_exp。图6是示出通过对盘状红细胞的计算而获得的值与实际测量的值之间的关系的图形表示，其中，细胞质电导率κ_i被描绘在横轴上，膜电容C_m被描绘在纵轴上，图7是示出通过对刺毛状红细胞的计算而获得的值与实际测量的值之间的关系的图形表示，其中，细胞质电导率κ_i被描绘在横轴上，膜电容C_m被描绘在纵轴上。请注意，图6一同示出盘状红细胞的情况中的关系以及正常红细胞的值。此外，根据图6和图7中示出的每两条曲线之间的相交点确定测量样品(No.2和No.3)中的每一个的膜电容C_m，exp和细胞质电导率κ_i，exp。在表1中共同示出根据上述过程确定的No.1至No.4的样品的膜电容C_m，exp和细胞质电导率κ_i，exp的值。

(表1)

另外，出于确认这样确定的值是否再现实际测量的介电色散的目的，使用从图6和图7获得的值，通过有限差分方法再次计算盘状红细胞和刺毛状红细胞的介电色散。图8是示出盘状红细胞的介电色散的图形表示，其中，频率被描绘在横轴上，复数电容率(ε’，ε”)被描绘在纵轴上，图9是示出刺毛状红细胞的介电色散的图形表示，其中，频率被描绘在横轴上，复数电容率(ε’，ε”)被描绘在纵轴上。如图8和图9所示，在盘状红细胞和刺毛状红细胞的任意一个中，计算结果再现了实际测量的值。特别地，尽管实际测量的值表现出了不能由通常应用于这样情况的Cole-Cole表达式表达的“笨拙(awkward)”的谱，但是，关于盘状红细胞的计算结果正确地再现了实际测量的值。由此，确定了对相常数(phase constant)的上述的简单的估计过程是有效的。