鉴别小麦高分子谷蛋白Dx5和Dx2亚基的共显性标记方法

摘要

本发明公开了一种鉴别小麦高分子谷蛋白Dx5和Dx2亚基的共显性标记方法，本发明基于共显性标记的特点从而设计出PCR扩增引物(上游引物P1：5’-CCAGCACAAGTGCAACAA-3’下游引物P2：5’-TGTCCTAGCTGCAACGGAG-3’)，并用PCR扩增引物来鉴别小麦高分谷蛋白Dx5和Dx2亚基，本发明简单稳定易行，可以准确的鉴定出Dx5优质亚基，同时也能鉴定出Dx2亚基以及两者的杂合型。

说明书

技术领域

本发明是一种基于共显性标记的特点设计出的PCR扩增引物及其用来鉴别小麦高分谷蛋白Dx5和Dx2亚基的方法，属于农业生物技术工程领域。

背景技术

小麦贮藏蛋白是决定小麦加工品质的重要因素，其中醇溶蛋白对形成而团的延伸性起主要作用，而麦谷蛋白是影响面团弹性的重要因素，决定面包烘烤品质，尤其是高分子量谷蛋白亚基(HMW-Glu)与小麦面包烘烤品质的关系更为密切，普通小麦品种通常只含有3～5个HMW谷蛋白亚基。HMW-GS的编码基因位于普通小麦第一组部分同源染色体1A、1B、1D长臂的Glu-1位点，分别命名为Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1。Glu-D1位点是一致被公认为对小麦品质贡献最大的位点(Payne，1981；王瑞，1995)，该位点具有广泛的变异类型，其命名一般根据HMW-GS的SDS-PAGE图谱进行“数字命名”(Payne，1980)。比较常见的有Dx5、Dx2，其中Dx5亚基与面包烘烤品质成正相关，是公认的优质亚基类型，Dx2与面包烘烤品质呈负相关。

目前用来鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的常规方法是种子贮藏蛋白的变性聚丙烯胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)。这个方法的缺点是一是不够精确，二是实验步骤繁琐、电泳时间长，不利于规模鉴定，三是必须要等到下一代种子收获以后才能进行检测和筛选工作，大大影响了育种的速率。后来随着多种高分子量谷蛋白亚基DNA序列的公布，近年来发展出了一种基于SNPs标记的等位特异PCR的方法，该方法曾一度流行，且被认为是一种比SDS-PAGE更精确更快捷的方法，克服了SDS-PAGE的一些缺点，其通过设计特异引物可将优质亚基Dx5鉴别出来。但是这个方法仍然存在以下缺点：一是等位特异PCR的引物设计的灵活度不大，只能根据SNPs位点的位置设计引物；二是等位特异PCR反应体系以及扩增程序比较苛刻，在一般环境下难于严格控制，给特异性扩增增加了难度和成本，这是因为等位特异性引物与其对立的等位位点只存在一个核苷酸的差异；三是等位特异PCR标记仅是优质亚基Dx5的一种显性标记，这是一个很大的缺点，因为它不能区分杂合和纯合基因型，这对MAS育种工作带来了诸多不便。

发明内容

本发明就是针对上述问题，发明出一种简单稳定易行的，具有共显性标记特点的用于鉴别小麦高分谷蛋白Dx5和Dx2亚基的方法及其引物。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明是根据Dx5亚基和Dx2亚基DNA序列的中间重复区重复数目的不同，通过序列比较发现Dx2亚基序列在近C-端的重复区存在几个重复序列的缺失，并在其两端设计引物，使得Dx5和Dx2亚基具有不同大小的PCR产物，从而达到鉴别Dx2和Dx5杂合基因型的目的。

用于鉴别小麦高分子谷蛋白Dx5和Dx2亚基所用的PCR引物为：

上游引物P1：5’-CCAGCACAAGTGCAACAA-3’

下游引物P2：5’-TGTCCTAGCTGCAACGGAG-3’

该引物在对Dx5亚基进行扩增时产生340bp的条带，对Dx2亚基进行扩增时产生320bp的条带，两个大小的片段需要使用PAGE胶将其区分开来；当Dx2和Dx5杂合基因型时，可同时产生320bp和340bp的条带。

本发明使用的聚合酶链式扩增反应体系为常规PCR体系，不需要任何特殊的PCR反应仪和特殊的试剂，任何公司的生产的PCR反应仪和任何生物试剂公司生产的试剂均可使用而达到本发明的目的。

本发明所设计的引物位于高分子谷蛋白亚基的近C-端的中央重复区，鉴于在中央重复区设计的引物容易在整个中央重复区内形成多个引物结合位点而导致形成很多杂带，因此本发明的一大特点就是在重复区内找到引物结合专一性位置，将目标区段准确扩增出来，不含有杂带，从而达到共显的目的。对于在重复区内设计的引物，本发明使用较高的PCR退火温度，以消除一些杂带。

鉴别小麦高分子谷蛋白Dx5和Dx2亚基的方法包括下列步骤：

a.用CTAB微量提取法从小麦中提取其基因组DNA；

b.用如权利要求1所述的引物对步骤a中的基因组DNA进行PCR扩增，

PCR反应条件、扩增体系如下：扩增体系为20ul体系：

                        1×PCR缓冲液

                        模板1.5ul

        25mM浓度的镁离子1.2ul，体系Mg²⁺浓度为1.5mM

        2.5mM浓度dNTP加1.2ul，体系dNTP的0.2mM

0.3ul+0.3ul≤10uM引物≤0.4ul+0.4ul，体系引物浓度为0.2uM

      5U/ul rTaq酶0.16ul，体系rTaq浓度为1U/25ul，

              加无菌去离子水或ddH₂O水至20ul

PCR程序为：

            1)94℃预变性5min

2)降落PCR程序共8个循环每一循环降低0.5℃

              94℃，45秒

              66℃，45秒

              72℃，45秒

        3)常规PCR程序32个循环

              94℃，45秒

             61.5℃，45秒

              72℃，45秒

        4)最后一部扩增：72℃，10分钟

c.将步骤b所得的扩增产物进行电泳检测：

将步骤b所得的扩增产物采用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，其中丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝39∶1，6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上样量为5-8ul；开始电泳时电压为50伏，待样品进入凝胶后电压改为150伏，共60分钟；

所得凝胶采用0.1％的硝酸银银染4分钟，然后用2％的NaOH和1.5％甲醛显影；

d.照相、分析。

本发明中，使用较高的退火温度以及降落PCR程序以避免引物产生多个非特异结合位点，这是所设计的引物中有一般左右的序列与中央重复区的重复序列一致，进而作者还提倡配合使用较小的上样量和较短的银染时间，这样可以消除杂带对结果分析的干扰。

本发明可以鉴别普通小麦Dx2和Dx5亚基，同时应用该引物可以将来自节节麦Dtx5与节节麦Dtx2以及普通小麦Dx2同时区分开。

本发明简单、高效，能更精确快捷的鉴别小麦高分谷蛋白Dx5和Dx2亚基。

附图说明

图1是引物P1+P2设计说明图

图2是实施例的P1+P2引物扩增产物的PAGE图

图2中：泳道1-48为川麦38、川麦42，以及川麦38与川麦42杂交的F₂植株的电泳带型；其中：泳道14为川麦38的Dx2亚基电泳带型；泳道14为川麦42的Dx5亚基电泳带型；泳道1、4、6、12、13、17、18、27-29、37、39、40、44-48为纯合Dx2亚基电泳带型；泳道3、5、20、24、25、35、43为纯合Dx5亚基电泳带型；泳道2、7、9-11、16、19、21-23、26、30-34、36、38、41、42为Dx2和Dx5的杂合亚基电泳带型；泳道49为DNA分子量大小Marker(M)。

具体实施方式

1.材料：

川麦38(含有Dx2亚基)与川麦42(含有Dx5亚基)杂交F₂代100株

2.方法：

2.1用CTAB微量提取法提取其基因组DNA

2.2利用引物P1+P2对其进行扩增，扩增体系与程序如下：

扩增体系为20ul体系：

                       1×PCR缓冲液

                       模板1.5ul

       25mM浓度的镁离子1.2ul，体系Mg²⁺浓度为1.5mM

        2.5mM浓度dNTP加1.2ul，体系dNTP的0.2mM

0.3ul+0.3ul≤10uM引物≤0.4ul+0.4ul，体系引物浓度为0.2uM

        5U/ul rTaq酶0.16ul，体系rTaq浓度为1U/25ul，

               加无菌去离子水或ddH₂O水至20ul

PCR程序为：

            1)94℃预变性5min

      2)降落PCR程序共8个循环每一循环降低0.5℃

               94℃，45秒

               66℃，45秒

               72℃，45秒

           3)常规PCR程序32个循环

               94℃，45秒

               61.5℃，45秒

               72℃，45秒

           4)最后一部扩增：72℃，10分钟

将上述步骤所得的扩增产物采用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，其中丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝39∶1，6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上样量为5-8ul；开始电泳时电压为50伏，待样品进入凝胶后电压改为150伏，共60分钟；

所得凝胶采用0.1％的硝酸银银染4分钟，然后用2％的NaOH和1.5％甲醛显影；照相、分析。

3.结果：

利用引物P1+P2扩增出清晰的目标条带见图2，从图中我们可以区分出Dx5、Dx2杂合的植株以及纯合的植株，只具有320bp片段的植株含有纯合的Dx2亚基，只具有340bp片段的植株含有纯合的Dx5亚基，同时具有两个条带的植株则为杂合型，卡方检验结果符合(Dx2∶Dx5∶Dx2/Dx5＝1∶1∶2)。该方法可以准确的鉴定出Dx5优质亚基，同时也能鉴定出Dx2亚基以及两者的杂合型；而目前广泛应用的经典Dx5优质亚基特异AS-PCR引物，只能检测Dx5优质亚基的有无，无法鉴定出Dx5与Dx2亚基的杂合型。