一种鉴定康氏木霉纤维素酶系中差异蛋白组分的培养基及其用途

摘要

本发明提供一种用于康氏木霉(Trichoderma koningii)生产纤维素酶系的培养基。还提供一种利用所述的培养基在不同的代谢控制条件下分离并鉴定康氏木霉纤维酶系的差异蛋白的方法，包括培养康氏木霉菌株以生产纤维酶系的差异蛋白、采用变凝胶梯度双循环电泳来分离纯化纤维素酶系各组分差异蛋白的单一样品、对所得的活性差异蛋白进行功能鉴定，以鉴定所得的差异蛋白组分是否属于β-葡萄糖苷酶、外切酶或内切酶。本发明作用在于提供一种新的纤维素酶系分类法，对传统的纤维素酶系分类提出挑战，为深入研究该菌株的基因组学和蛋白质组学提供理论依据，同时为微生物多酶体系的分离纯化提供具体可行方案。

说明书

本发明涉及一种用于康氏木霉(Trichoderma koningii)生产纤维素酶系的培养基，和利用该培养基鉴定康氏木霉纤维素酶中差异蛋白组分的用途，通过比较分析胞外蛋白在电泳胶块中的差异，从而鉴定该康氏木霉的纤维素酶酶系的组成。本发明属发酵工程与蛋白质酶工程的生物技术领域。

背景技术

纤维素(Cellulose)是地球上最丰富的有机物质，植物界中碳素的一半以上存在于纤维素中。植物通过光合作用，生产世界上最丰富、最廉价的纤维素资源，全世界每年植物体生成量高达1,500亿吨干物质，其中纤维素及半纤维素的总量为850亿吨^[1]。由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造，其外围又被木质素层包围，要把它水解成可利用的葡萄糖相当困难。所以，到目前为止纤维素仍没有得到很好地利用。纤维素是由D-葡萄糖以β-1，4糖苷键联结而成，直链状大分子纤维素折迭起来，形成具有高结晶的基本构成单位，由这种基本构成单位集中起来构成微小的结构单位，再由众多的微小单位构成纤维素^[2-5]。

1纤维素酶的组成

纤维素酶(cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系。迄今，已有很多关于纤维素酶生产菌的报道，纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能产生纤维素酶；但对纤维素作用较强的菌株多是木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、Pellienlalia属和枝顶孢霉属(Acremonium)的菌株，特别是绿色木霉(Trichoderma virde)及其近缘的菌株^[6-9]。

1950年，Reesei等曾阐明，没有一种纤维素酶生产菌能生产出分解棉花中的天然纤维素的酶，但发现有的菌株生产的酶能分解膨润的纤维素或纤维素诱导体等非晶体性纤维素，因而提出了由于天然纤维素的特异性而必须以不同的酶协同作用才能分解的C₁-Cx假说^[10]。这个假说认为：当纤维素酶作用时，首先对纤维素的C₁组分起作用，继而使Cx组分变成纤维低聚糖，再由β-葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。

关于C₁-Cx酶的假说尚有争议^[10]。目前比较公认的，纤维素酶系分为以下三大类^[11-12]：(1)葡聚糖内切酶(1，4-β-D-glucan giucanohydrolase，E.C 3.2.1.4，Cx酶或CMC酶，简称EG)，这类酶一般作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。通常，β-葡萄糖苷酶是将纤维二糖的水解为葡萄糖一类水解酶，其底物还可以是对硝基葡萄糖苷；(2)葡聚糖外切酶(1，4-β-D-glucan cellobiohydrolase E.C 3.2.1.91，也称C₁酶或外切纤维二糖水解酶，简称CBH)，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)。通常，外切酶是将纤维素水解产生纤维二糖的一类水解酶，其底物可以是纤维素，还可以是对硝基纤维二糖苷；(3)β-葡聚糖苷酶(β-glucosidase，E.C 3.2.1.21，纤维二糖酶，简称BG)，这类酶一般将纤维二糖水解成葡萄糖分子。通常，β-葡萄糖苷酶是将纤维二糖的水解为葡萄糖一类水解酶，其底物还可以是对硝基葡萄糖苷。

2.纤维素酶的作用方式

因纤维素酶组分多，酶系复杂，纤维素酶降解纤维素为葡萄糖的细节至今仍然不清楚，许多研究者提出了不同的看法，主要有：

(1)C₁-C_X假说

Reesei提出的C₁-Cx假说，通过对大量的微生物比较研究，认为C₁酶首先作用于结晶纤维素，使其改变成可被Cx酶作用的形式；Cx酶随机水解非结晶纤维素、可溶性纤维素衍生物和葡萄糖的β-1，4-寡聚物；β-葡萄糖苷酶将纤维二糖、纤维三糖水解成葡萄糖。但是在随后几十年的研究中，Reesei提出的C₁-Cx酶分阶段水解纤维素的设想在实验中并未得到证实。

(2)顺序作用模式

Pettersson等人^[24]报道，在水解天然纤维素中，起关键作用的C₁酶实际上是外切型β-1，4-葡聚糖纤维二糖水解酶，并提出天然纤维素的水解是从内切型β-1，4-葡聚糖酶(Cx)开始的。Cx酶首先在微纤维上一些特定的薄弱位置把纤维素分子链打开，C₁酶接着深入到纤维素分子链内把氢键断开，这样就使一段段纤维断片从微纤维上脱落下来，脱落的纤维素断片再经Cx酶和β-葡萄糖苷酶作用，形成葡萄糖。

(3)协同作用模式

Mandels等^[13-14]作了如下推测，认为首先由C₁和Cx酶形成复合体，共同对纤维素进行水解，生成物放出时复合物解离，然后一个酶单独吸附到纤维素上，这种酶就不再有活性了。Wood等^[15]还报道了好气真菌纤维二糖水解酶与厌氧真菌和厌氧细菌纤维素酶间的协同作用。中国科学院微生物所纤维素酶组报道^[16]，对于排列越是紧密的天然纤维素，C₁-Cx酶的协同作用就越显著。对棉花的协同效果为8倍，微晶纤维素3.4倍，而对磷酸膨胀纤维素则为1.7倍。关于纤维素酶协同作用，近些年有较多的研究和报道，认为纤维素酶酶系各组分共同作用时能将纤维素降解水溶性产物，若将各组分分开便失去这种能力，若将分离的各组分再按比例又可恢复这种能力。

因此，目前最易接受的纤维素酶水解机理见图6。

3.纤维素酶的研究进展

纤维素酶的发现比较早，1906年Silliere在蜗牛的消化液中发现有纤维素酶，能分解天然纤维素。1933年Grassman等研究了一种真菌的纤维素酶系，分辨出两个组分。1940～1950年对纤维素酶产生菌进行了大量的筛选分离工作。建立了比较完整的分离筛选方法。至1950年Reesei等提出了纤维素酶作用方式的C₁-Cx假说以后，开始转入纤维素酶的基础研究，包括纤维素酶的性质，作用方式，培养条件和测定方法等。1960年后，由于分离技术的发展，推动了纤维素酶的分离纯化方法，对纤维素酶的组分、作用方式以及诱导作用等方面的研究进展比较快，并实现了纤维素酶制剂的工业生产，在应用上也取得了一定的成绩。目前有许多国家在进行纤维素酶的研究，其中美国、日本、德国和英国等国家发展比较快，以纤维素转化成糖为主要目标，纤维素酶制剂的产量逐年增加。

70年代以来，基因重组技术的迅速发展，纤维素酶的研究日新月异。由于丝状真菌木霉属能产生大量的胞外酸性纤维素酶，酶系较完全，并且对结晶纤维素有较好的酶解活性，其中对里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶基因研究比较透彻，cbh I、cbh II、cbh III、cbh IV、eg I、eg III、bg 7个基因得到了克隆^[17]，但是纤维素酶在E.coli中的分泌表达水平很低。Godbole等将T.reesei cbh I在酵母Pichiapastoris中成功转化并表达。细菌主要产中性纤维素酶和碱性纤维素酶。由于酶的耐热性在生产中具有实用意义，所以耐热细菌是研究的热点。Kim等^[18]克隆了Aquifex aeolicus VF5编码EG的cel8Y基因，在E.coli XL1-Blue中表达成功。酶CEL8Y有很好的耐热性，最适作用温度和pH分别为80℃和7.0。而碱性纤维素酶由于在洗涤剂工业中有很好的应用价值，所以对其的研究也是热点之一，其产生菌主要集中在芽孢杆菌属。Hakamada等^[19]对Bacillus.circulans KSM-N257进行了研究，运用盒式连接介导PCR和反向PCR克隆了编码Egl-257的基因egl-257，对egl-257全长基因序列分析表明，egl-257包含一个长度为1221bp的开放读码框架，核苷酸链248位为ATG起始密码子，1469位TAA终止密码子。Shou Takashima等^[20]用麦芽糖作为主要碳源和诱导物，利用米曲霉Taka-amylase的启动子，建立一个米曲霉Aspergillus oryzae宿主表达系统，使里氏木霉Trichoderma reesei的纤维素酶基因(cbh1，cbh2，egl1，egl3，egl5，bgl1)在该启动子控制之下并得以过量表达。

我国研究纤维素酶有几十年的历史，1960-1990年主要进行菌种筛选和纤维素酶的分离纯化工作，做了酶制剂的生产实验。纤维素酶在食品加工、酿酒、饲料、纤维素糖化等方面的应用取得了一定的成绩。肖壮志等^[21]采用刚果红染色法从T.reesei cDNA文库中筛选到EGIII基因，转化到酿酒酵母中成功表达，比较了酿酒酵母的蛋白质分泌系统组分SSO2和SEB1对EGIII分泌的影响，研究结果显示T.reesei eg III在酿酒酵母细胞中表达时，其mRNA5’端先导序列中可能存在影响该基因表达水平的调控序列。中科院微生物所和山东大学等单位还进行了大量的纤维素酶的基础理论研究。

4.纤维素酶的应用

工业酶制剂的应用中相当普遍，尤其是稳定性好、活性高、特异性强的酶制剂更受欢迎，其发展相当迅速。1995年世界工业酶制剂市场有10亿美元的市场份额，2000年达16亿美元，2010年预计超过100亿美元。60％的酶制剂由欧洲生产，40％产自美国和日本。大约75％工业酶制剂是水解酶类。纤维素酶及半纤维素酶的应用始于上世纪80年代初，首先用于动物饲料，其次是食品行业，后来用于纺织、洗涤、造纸行业。近20年来，纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的产量增加迅速，广泛用于纺织、食品、饮料、酿酒和造纸工业，约占整个工业酶制剂市场的20％。这类工业酶制剂主要由木霉属和曲霉属生产^[22-24]。

(1)饲料工业

世界年产动物饲料6,000亿吨，价值500亿美元以上，90％主要用于饲养禽类、猪、和反刍动物，10％用于宠物和鱼类。纤维素酶和纤维素酶产生菌能转化粗饲料如麦秸、稻草、玉米等，把其中一部分纤维素转化为糖、菌体蛋白、脂肪等，降低饲料中粗纤维含量，从而促进动物对饲料的消化吸收，提高了饲料利用价值。目前纤维素酶大多与其它酶制成复合酶，其中含纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等，在农业实践中已取得很大成效。如，朱元招等^[25]添加以纤维素酶为主酶制剂对断奶犊牛生产效果显著，增重提高75％。席兴军等^[26]添加纤维素酶使玉米秸秆青贮饲料中氨态氮与总氮质量比和丁酸与总酸摩尔比分别下降28％和100％，酸性洗涤纤维(ADF)质量分数下降20％，显著提高了玉米秸秆青贮饲料的营养价值。纤维素酶在发酵工业中的另一重要应用为生产单细胞蛋白。

(2)食品发酵工业方面^[27-28]

在食品发酵工业中，纤维素酶可应用于酿酒，先用纤维素酶糖化，再经酵母发酵，可提高酒精和白酒的出酒率，降低醪液的黏度。用纤维素酶和其他细胞裂解酶来抽提茶汁，生产速溶茶，不仅收率高，而且茶叶色、香、味品质较热浸法佳。纤维素酶还在提炼橄榄油，改善烟草品质，改善果蔬汁的口感风味，提高面包质量方面得到应用。此外，纤维素酶还广泛用于生产酱油，加工果酱饮料及其他食品。

(3)纺织业中的应用^[29-30]

纤维素酶应用于纺织业是近十几年来的事情，现已成为纤维素第三大纤维素酶应用行业。纤维素酶可用于纺织业退浆处理、生物磨光、石磨等方面。利用纤维素酶对棉、麻、人造丝等织物进行处理，改善其内在品质和外观。在适当的条件下，纤维素酶仅对织物的表面或伸出织物表面的绒毛状短小纤维起作用，尤其在替代牛仔装的石洗和酸洗时，可克服断纱、磨损和日久发黄的缺点，使产品柔软、滑爽、膨松、丰满。

(4)造纸业上的应用

纤维素酶在造纸工业上可用于酶法废纸脱墨，改善纸浆性能，抑制纸浆泛黄，抑制导管的脱落，漂白、去除碎浆^[31]。

目前，纤维素酶以及纤维素酶与半纤维素酶混合物的脱墨机理尚不完全清楚^[32]。一些学者根据自己的实验结果分别提出了一些推测性的假说，如Franks，Kim等提出水解说，Zeyer的机械摩擦说，Eom的纤维剥离说，Jeffries的间接作用说，Woodward的等效说等。酶法脱墨作为一种新的造纸生物技术，具有以下优点：

首先，酶法脱墨纸浆和化学脱墨纸浆相比具有很高的物理性能，如高白度和低残存墨粉；

其次，从经济上看，酶法脱墨比化学脱墨的费用低，酶法脱墨既可节省能耗，降低生产成本，又可大量减少化学药品的使用，包括减少漂白需求，降低了漂白费用。酶法脱墨后的废水需氧量和毒性也较低。

微生物纤维素酶酶系复杂，很难用一种方法将各组分一一分离开来，致使至今还没有详尽透彻地阐述纤维素酶酶系各组分的功能。尽管纤维素酶系一般分为三大类，而且它们的功能也得到确认，但作为某一特定的菌株的纤维素酶系到底由哪些组分组成？其内切酶、外切酶以及β-葡聚糖苷酶各有几个组分？纤维素酶系中除以上三类之外，还有没有其它组分？至今没有一种直观的方法进行分类和鉴定。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一整套制备、纯化及鉴定纤维素酶系(特别是康氏木霉(Trichoderma koningii)的纤维素酶系)组分及其阻遏蛋白的直观方法、通过进行分类和鉴定，从而准确判断产纤维素酶菌株的纤维素酶系中的组分，对传统的纤维素酶系分类提出挑战，为深入研究该菌株的基因组学和蛋白质组学提供理论依据。同时，本发明为该菌株构建基因工程菌提供可靠信息，为该菌株的纤维素酶代谢调控提供理论指导。此外，本发明还可为其他菌株的纤维素酶系的研究提供参考。

本发明第一个发明目的是提供一种用于康氏木霉(Trichoderma koningii)生产纤维素酶系的培养基，包括

(1)诱导培养基：碳源为稻草粉，氮源为麸皮，水20ml，其中稻草粉作为诱导物；

(2)阻遏培养基：葡萄糖0.5-10g，碳源为稻草粉，氮源为麸皮，水20ml，其中葡萄糖作为阻遏物；

由于在诱导培养基中，诱导物可诱导康氏木霉分泌了大量的纤维素酶，而阻遏培养基中含葡萄糖，作为纤维素酶酶解纤维素的最终产物，葡萄糖通过末端产物阻遏纤维素酶酶系的分泌，使得康氏木霉直接利用环境中的葡萄糖，供给自身生长繁殖的需要。

在一个实施方案中，葡萄糖0.5-1.5g为低阻遏浓度，1.5-4.5g为中阻遏浓度，4.0-10.0g为高阻遏浓度。在一个具体实施方案中，上述培养基的碳源可选自甘蔗渣或秸秆，氮源可选自酵母膏、蛋白胨、硫酸铵或氯化铵，其中，碳源(如稻草粉、秸秆或甘蔗渣)为8.0g，氮源(如麸皮)为4.0g，或者选自0.5-2g的酵母膏、蛋白胨、硫酸铵或氯化铵(以确保物质所含的碳元素∶氮元素量之比为10～30∶1)。其中以上培养基的pH均为自然pH，无需调整。

在另一个具体实施方案中，所述康氏木霉(Trichoderma koningii)菌株可以选用已公开的各种康氏木霉菌株，例如中国专利申请200610155028.8于2007年6月27日公开的康氏木霉(Trichoderma koningii)ZJU-T CGMCC No.18；也可购买商业化菌株，例如购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心、保藏号AS3.2774的菌株；或使用实验室自行保藏的菌株。

本发明第二个发明目的是提供一种利用上述康氏木霉菌株培养基生产纤维素酶诱导相关蛋白组分或纤维素酶系阻遏相关蛋白组分的方法，包括：

(1)无菌条件下，在250ml三角瓶中分别制备上述无菌的纤维素酶诱导培养基或纤维素酶阻遏培养基，再分别接种康氏木霉菌株，在28～30℃发酵4.0～5.0天，每天翻动一次培养基发酵曲以便通风换气；

(2)将诱导培养基、阻遏培养基的发酵曲，分别用100ml pH 4.8缓冲液浸提、过滤；

(3)将滤液以12000g离心，获得粗酶液；

(4)分别用饱和度为20％～80％硫酸铵沉淀粗酶液，并在低于45℃条件下进行Sephadex G25凝胶脱盐；

(5)旋转蒸发浓缩或者低温冻干浓缩，以获得纤维素酶浓缩液，其中浓缩液中富含纤维素酶诱导相关蛋白组分或纤维素酶系阻遏相关蛋白组分；

其中，康氏木霉在诱导培养基中分泌较多、而在阻遏培养基中分泌较少甚至没有的胞外差异蛋白，所述的胞外蛋白为纤维素酶诱导相关蛋白组分；康氏木霉在诱导培养基中分泌较少甚至没有、而在阻遏培养基分泌较多的胞外差异蛋白，所述的胞外蛋白为纤维素酶系阻遏相关蛋白组分。

在一个实施方案中，步骤(2)中用100ml pH4.8缓冲液浸提发酵曲1h，纱布挤压过滤。在另一个实施方案中，步骤(3)中通过旋转蒸发或者低温冻干以浓缩10倍体积。

在上述方案中，所述的纤维素酶浓缩液，其特征为代谢调控固体发酵纤维素酶，即纤维素酶酶解纤维素的末端产物葡萄糖的阻遏及其解除，在不同培养基中控制康氏木霉对纤维素酶的分泌，从而获得纤维素酶诱导相关蛋白组分或纤维素酶系阻遏相关蛋白组分，即纤维素酶的差异蛋白，必要时还结合纤维素酶功能测定来评价所述的诱导或阻遏相关蛋白组分。

本发明第三个发明目的是提供一种在不同的代谢控制条件下鉴定康氏木霉纤维酶系的差异蛋白的方法，包括：

1)根据前述方法，配制诱导或阻遏培养基，并培养康氏木霉菌株，以生产纤维酶系的差异蛋白；

2)采用变凝胶梯度双循环电泳分离法来分离纯化纤维素酶系各组分差异蛋白，即用4％～8％活性梯度胶对纤维素酶粗酶液样品进行电泳、切胶、凝胶染色定位、切分目的蛋白条带、电泳洗脱、透析、冻干，分别获得纤维素酶纯酶液的多种蛋白样品；

3)根据低迁移率的蛋白或高迁移率的待纯化蛋白，以4％～7％的凝胶梯度或5％～10％的凝胶梯度，对步骤2)的样品中的一种蛋白再次进行变凝胶梯度双循环电泳分离，最终获得纯化的单一活性蛋白样品；

4)对所得的活性差异蛋白进行功能鉴定：活性蛋白将纤维二糖的水解为葡萄糖一类水解酶的差异蛋白是β-葡萄糖苷酶，其底物还可以是对硝基葡萄糖苷；活性蛋白将纤维素水解产生纤维二糖的一类水解酶的差异蛋白是外切酶，其底物可以是纤维素；活性蛋白将纤维素水解产生寡聚纤维素或可溶性低聚糖的一类水解酶的差异蛋白是内切酶，其底物可以是纤维素或羧甲基纤维素。

在一个实施方案的步骤4)中，将微克级的已纯化为电泳纯的活性蛋白在50℃催化水解纤维二糖溶液(0.1mM，pH4.8柠檬酸的缓冲液溶解)24小时以上，经薄层色谱定性检测产物，若产物中有葡萄糖，则判定该活性蛋白为β-葡萄糖苷酶(BG)。

在另一个实施方案的步骤4)中，将微克级的已纯化将已纯化为电泳纯的活性蛋白在50℃催化水解对硝基纤维二糖苷或纤维素(0.1mM，pH4.8柠檬酸的缓冲液溶解)24小时以上，经薄层色谱定性检测产物，若产物中只有纤维二糖而没有葡萄糖，则判定该活性蛋白为外切酶。

还在另一个实施方案的步骤4)中，将微克级的已纯化将已纯化为电泳纯的活性蛋白在50℃催化水解纤维素(0.1mM， pH4.8柠檬酸的缓冲液)24小时以上，经薄层色谱定性测定，再经3，5二硝基水杨酸定量检测产物，若产物中有还原糖产生却没有纤维二糖和葡萄糖，则判定该活性蛋白为内切酶。

在其他实施方案中，对于低迁移率的蛋白选用4％～7％的凝胶梯度，对于高迁移率的蛋白选用5％～10％的凝胶梯度进行分离(例如选用5％～8％的凝胶梯度分离康氏木霉的纤维素酶)，其中，用于第1次电泳的浓缩胶的电泳电压为80～100V，电流为20～30mA；用于第2次电泳的分离胶的电压为180～200V，电流＜30mA；电泳缓冲液为pH8.8，12.5mmol/lTris-glycin 96mmol/l，电泳温度优选4℃。在另一个具体实施方案中，分离胶长度150mm，电泳时长10～12h。电泳梯度胶的染色，采用常规的Coomassie brilliant blue R-250染色和固定，以及10％醋酸和20％甲醇脱色剂脱色。

在另一个实施方案中，凝胶的尺寸大小为长×宽×厚，大于或等于150×150×1.0mm，上样孔数量共计20孔/每块胶，如：北京六一仪器化工厂的电泳槽，型号DYCZ-24A；选用pH 8.8，12.5 mmol/l Tris-glycin 96mmol/l的电泳缓冲液，有利于分离康氏木霉纤维素酶系，这个浓度比正常的活性蛋白质电泳低50％^[33-34]；染色及脱色温度为50～60℃。

在上述实施方案中，将凝胶的泳道分为染色组泳道组和蛋白回收组泳道，通过染色组泳道以回收对应于蛋白回收组泳道位置的目的蛋白凝胶，以进行第二次凝胶电泳分离，其中用于染色，染色及脱色温度为50～60℃，时间控制在40分钟以内(尽量防止活性蛋白弥散)，将目的蛋白凝胶分别装进透析袋中、加入适量电极缓冲液，密封，再置入电泳槽的阴极电泳洗脱2～3h，完毕，转入10mM的pH4.8柠檬酸缓冲液中透析，收集透析内液，于-40℃条件下冻干，供第二次循环使用。在第二次循环纯化时，相应调整凝胶梯度，例如对于低迁移率的蛋白选用4％～7％的凝胶梯度，对于高迁移率的蛋白选用5％～10％的凝胶梯度进行分离，其他步骤与第一次循环相同，最后获得电泳纯度的活性蛋白。活性蛋白包括康氏木霉纤维素酶诱导相关蛋白和纤维素酶阻遏相关蛋白，供功能测定使用。

本发明第四个发明目的是提供一种康氏木霉纤维素酶阻遏相关的蛋白R₇，该康氏木霉的蛋白R₇分泌在量上与纤维素酶的分泌存在负相关关系，即蛋白R₇的存在下将影响或抑制纤维素酶的分泌或活性。其中，康氏木霉胞外活性蛋白R₇不具有纤维素酶系中的内切酶、外切酶以及β-葡萄糖苷酶水解特性，但确实为纤维素酶阻遏相关的蛋白。

在一个实施方案中，该R₇蛋白的制备方法如下：如前所述，使用诱导培养基与强阻遏培养基(葡萄糖5.0g)进行培养康氏木霉菌，收集纤维素酶浓缩液后，以4％～8％凝胶梯度进行变凝胶梯度双循环电泳分离，最终得到不具有内切酶、外切酶以及β-葡萄糖苷酶水解特性的纤维素酶阻遏相关的7蛋白，其中该R₇蛋白经SDS-PAGE测定为分子量43KD的单肽链，其分泌在量上与纤维素酶的分泌存在负相关关系。

在另一个具体的实施方案中，若培养基中葡萄糖为0g，R₇含量小于5μg/100ml(粗酶液)，纤维素酶总活力(滤纸酶活力，filter paper activity)大于3.00IU/ml(粗酶液)；若葡萄糖大于4.0g，则R₇含量为大于30μg/100ml，纤维素酶总活力小于0.48IU/ml。

附图说明

附图1，来源于诱导培养基和阻遏培养基(葡萄糖2.0g)的纤维素酶酶系的活性电泳分析。活性凝胶梯度4％～8％，上样量为10μl/孔，Lane1～3为阻遏培养基中纤维素酶浓缩液，Lane4～6为诱导培养基中纤维素酶浓缩液。p₁，p₂，p₃，p₄，p₅，p₆，p₇，p₈以及p₁₀为纤维素酶诱导相关蛋白。

附图2，来源于诱导培养基与阻遏培养基(葡萄糖5.0g，强阻遏)中纤维素酶酶系的活性电泳分析。活性凝胶梯度为4％～8％，上样量为10μl/孔，Lane1～4为诱导培养基中纤维素酶浓缩液，Lane5～8为阻遏培养基中纤维素酶浓缩液，R₇为纤维素酶阻遏相关蛋白。

附图3，“变凝胶梯度双循环电泳分离法”——切胶定位。第一、三、五部分分别为Lane1～2，Lane10～11，Lane19～20，用于染色；第二、四部分分别为Lane3～9，Lane12～18，用于活性蛋白回收。

附图4，“变凝胶梯度双循环电泳分离法”——切胶回收活性蛋白，第一、三、五部分分别为Lane1～2，Lane10～11，Lane19～20，用于染色；第二、四部分分别为Lane3～9，Lane12～18，用于活性蛋白回收。

附图5，活性蛋白的水解性能薄层色谱分析——β-葡萄糖苷酶测定。LaneM标样分别为：G1葡萄糖，G2纤维二糖，G3纤维三糖，G4纤维四糖。Lane1～10依次为p₁～p₁₀水解纤维二糖的水解产物。薄层色谱展层液为：正丁醇∶醋酸∶水＝2∶1∶1(体积比)，喷雾苯胺和二苯胺100℃显色。

附图6，纤维素酶水解机理。

技术效果

1.本发明提供一种新的纤维素酶系分类法，对传统的纤维素酶系分类提出挑战，为深入研究该菌株的基因组学和蛋白质组学提供理论依据；

2.本发明为该菌株构建基因工程菌提供可靠信息，为该菌株的纤维素酶代谢调控提供理论指导；

3.本发明还可为其他菌株的纤维素酶系的研究提供参考；

4.本发明为微生物多酶体系的分离纯化提供具体可行方案。

具体实施方案

下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

实施例1：康氏木霉(Trichoderma koningii)的获得，

康氏木霉(Trichoderma koningii)可以选用已公开的各种康氏木霉菌株，例如中国专利申请200610155028.8于2007年6月27日公开的康氏木霉(Trichoderma koningii)ZJU-TCGMCC No.18；也可购买商业化菌株，例如购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该菌株保藏号：AS3.2774；或使用实验室自行保藏的菌株。

实施例2：康氏木霉(Trichoderma koningii)纤维素酶的代谢调控固体发酵纤维素酶。

无菌条件下，将康氏木霉分别接种于诱导培养基(配方为：碳源(稻草粉8.0g，诱导物)，氮源(麸皮4.0g)，水20ml，自然pH)、阻遏培养基1^#(配方为：碳源(稻草粉8.0g)，氮源(麸皮4.0g)，葡萄糖2.0g(阻遏物)，水20ml，自然pH)、阻遏培养基2^#(配方为：碳源(秸秆粉8.0g)，氮源(麸皮4.0g)，葡萄糖5.0g(阻遏物)，水20ml，自然pH)中，在28～30℃固体发酵4.0～5.0天，每天翻动一次发酵曲(无菌操作)，以便通风换气，获得3组不同代谢调控下的纤维素酶。

实施例3：纤维素酶的提取。

将诱导培养基以及阻遏培养基的发酵曲，分别用100ml pH4.8柠檬酸缓冲液浸提1小时，纱布挤压过滤，滤液用12000g离心力离心20分钟，获得粗酶液。然后分别用饱和度为20％～80％硫酸铵沉淀，G25凝胶脱盐，温度低于45℃条件下，旋转蒸发浓缩10倍或者低温冻干浓缩，获得3组不同代谢调控下的纤维素酶浓缩液。

实施例4：康氏木霉纤维素酶系组分的确定。

将纤维素酶浓缩液(包括诱导与阻遏)。分别上样4％～8％的凝胶梯度，每孔10μl样品，使用北京六一仪器化工厂的DYCZ-24A电泳系统，凝胶的尺寸大小为长×宽×厚，大于或等于150×150×1.0mm，上样孔数量共计每块20孔，在4℃条件下，浓缩胶电泳的电压为80～100V，电流为20～30mA；分离胶的电压为180～200V，电流＜30mA；电泳缓冲液为pH8.8，12.5mmol/l Tris-glycin 96mmol/l；电泳时长10～12h，电泳胶用Coomassiebrilliant blue R-250染色和固定，以及10％醋酸和20％甲醇脱色剂脱色。

经上述电泳分离，获得一组纤维素酶酶系差异条带，如附图1所示，Lane 1～3为阻遏培养基(葡萄糖2.0g)的胞外电泳条带，Lane 4～6为诱导培养基的胞外蛋白电泳条带。

在阻遏培养基中，由于阻遏培养基中含2％的葡萄糖，作为纤维素酶酶解纤维素的最终产物，葡萄糖通过末端产物阻遏纤维素酶酶系的分泌，康氏木霉直接利用环境中的葡萄糖，供给自身生长繁殖的需要。附图1所示Lane 4～6为诱导培养基的胞外蛋白电泳条带，在诱导培养基中，稻草粉诱导康氏木霉分泌了大量的纤维素酶。比较分析二者的差异，诱导培养基的胞外蛋白p₁，p₂，p₃，p₄，p₅，p₆，p₇，p₈以及p₁₀共9个组分比阻遏培养基的胞外电泳条带明显，而p₉却没有差异，由此可以确认p₁，p₂，p₃，p₄，p₅，p₆，p₇，p₈以及p₁₀为康氏木霉的纤维素酶系诱导相关组分，各组分的功能在后续实验中确认。

实施例5：纤维素酶系阻遏相关蛋白组分的确定。

如附图2所示，Lane 1～4为诱导培养基的胞外电泳条带，Lane5～8为阻遏培养基(葡萄糖5.0g，强阻遏)的胞外蛋白电泳条带，其他实验方法如上。

在诱导培养基中，由于稻草粉中含有纤维素，诱导康氏木霉分泌大量的纤维素酶。而在阻遏培养基中，由于阻遏培养基中含5％的葡萄糖，葡萄糖作为纤维素酶酶解纤维素的最终产物，通过末端产物阻遏纤维素酶酶系的分泌，康氏木霉直接利用环境中的葡萄糖，供给自身生长繁殖的需要。比较分析二者的差异，阻遏培养基的胞外蛋白R7，比诱导培养基的胞外电泳条带明显，由此可以初步确认R₇为康氏木霉纤维素酶系阻遏相关的蛋白组分，其功能尚须进一步确认。

实施例6：康氏木霉的纤维素酶相关蛋白逐个纯化

按图3所示对纤维素酶浓缩液(诱导)进行电泳分离，每孔上样10μl，第一循环中采用4％～8％活性梯度胶电泳，电泳结束后将凝胶纵向切为五个部分，各相邻胶片间斜向切下若干切痕标记定位(考虑到染色后凝胶会明显变长，以消除误差)。第一、三、五部分分别为Lane1～2，Lane10～11，Lane19～20，用于染色，染色及脱色温度为50～60℃，时间控制在40分钟以内(尽量缩短时间，防止蛋白条带弥散)。第二、四部分分别为Lane3～9，Lane12～18，用于活性蛋白回收。蛋白质回收的具体操作是将已染色的第一、三、五部分的胶条拼回第二、四部分胶条中，对齐斜向切口，依次横向切下相应蛋白条带(如附图4)，胶条分别装进透析袋中、加入适量电极缓冲液，密封，置入电泳槽的阴极进行电泳洗脱2-3h，完毕，用10mM，pH4.8柠檬酸缓冲液透析，收集透析内液，于-40℃条件下冻干，供第二次循环使用。在第二次循环纯化时，应调整凝胶梯度，如p₁，p₂，p₃以及p₄使用4％～7％梯度胶，而p₇，p₈以及p₁₀使用5％～10％梯度胶，其他操作同第一次循环的步骤。此法适用于阻遏蛋白R₇的分离纯化。最后获得电泳纯度的康氏木霉胞外活性蛋白，包括纤维素酶诱导相关蛋白和纤维素酶阻遏相关蛋白。

实施例7：康氏木霉纤维素酶酶系的确定和功能鉴定。

(1)β-葡萄糖苷酶(BG)功能的确定，将已纯化为电泳纯的康氏木霉纤维素酶诱导相关蛋白p₁，p₂，p₃，p₄，p₅，p₆，p₇，p₈以及p₁₀(微克级)分别在50℃催化水解纤维二糖溶液(0.1mM，pH4.8柠檬酸的缓冲液溶解)24小时以上，经薄层色谱定性检测产物，若产物中有葡萄糖，则判定该活性蛋白为β-葡萄糖苷酶(BG)，结果如附图5所示p₃，p₄，p₇，分别为BG₁，BG₂，BG₃。

(2)外切酶(CBH)功能确定，将已纯化为电泳纯的康氏木霉纤维素酶诱导相关蛋白p₁，p₂，p₃，p₄，p₅，p₆，p₇，p₈以及p₁₀(微克级)分别在50℃催化水解对硝基纤维二糖苷或纤维素(0.1mM，pH4.8柠檬酸的缓冲液溶解)24小时以上，经薄层色谱定性检测产物，若产物中只有纤维二糖而没有葡萄糖，则判定该活性蛋白为外切酶，结果表明，p₈、p₁₀为外切酶，分别为CBH₁，CBH₂。

(3)内切酶(EG)的功能确定，将已纯化为电泳纯的康氏木霉纤维素酶诱导相关蛋白p₁，p₂，p₃，p₄，p₅，p₆，p₇，p₈以及p₁₀(微克级)分别在50℃催化水解纤维素(0.1mM，pH4.8柠檬酸的缓冲液)24小时以上，经薄层色谱定性测定，再经3，5二硝基水杨酸定量检测产物，若产物中有还原糖产生却没有纤维二糖和葡萄糖产生，则判定该活性蛋白为内切酶，结果表明，p₅，p₆为内切酶，分别为EG₁，EG₂。

(4)其他纤维素酶诱导相关蛋白的测定，按本实例中纤维素酶水解性能鉴定方法测定，p₁，p₂的纤维素酶系中的内切酶、外切酶以及β-葡萄糖苷酶水解特性不明显，但确实为纤维素酶诱导相关的蛋白。

(5)纤维素酶阻遏蛋白的鉴定，经纤维素酶水解性能测定，R₇不具有纤维素酶系中的内切酶、外切酶以及β-葡萄糖苷酶水解特性，但确实为纤维素酶阻遏相关的蛋白，命名为纤维素酶阻遏蛋白R₇。该蛋白经SDS-PAGE测定，该蛋白为单肽链，分子量为43KD，康氏木霉的R₇分泌在量上与纤维素酶的分泌存在负相关关系。

实施例8：蛋白R₇分泌在量上与纤维素酶的分泌存在负相关的功能鉴定

无菌条件下，将康氏木霉分别接种于诱导培养基(配方为：碳源(稻草粉8.0g，诱导物)，氮源(麸皮4.0g)，水20ml，自然pH)，阻遏培养基(配方为：碳源(稻草粉8.0g)，氮源(麸皮4.0g)，葡萄糖≥2.0g(阻遏物)，水20ml，自然pH)，在28～30℃固体发酵4.0～5.0天，每天翻动一次发酵曲(无菌操作)，以便通风换气，获得不同代谢调控下的纤维素酶。

根据前述方法，通过在不同葡萄糖浓度的阻遏培养基和相同诱导培养基中获得的纤维素酶液，进行酶活性测试，以鉴定蛋白R₇分泌在量上与纤维素酶的分泌存在负相关的功能。

表1：粗酶液中R₇含量和纤维素酶总活力

  阻遏培养基的  葡萄糖量(g)  粗酶液中R₇ 含量(μg/100ml)  纤维素酶  总活力(IU/ml)   0   3   3.58   2   13   1.81   5   34   0.48

结果如表1所示，使用常规方法(Filter paper activity)检测不同代谢调控下获得的不同R₇含量和纤维素酶总活力的关系，其中随着酶液中R₇含量的增加，纤维素酶总活力出现线性下降，表明，该康氏木霉的蛋白R₇分泌在量上与纤维素酶的分泌存在负相关关系，即蛋白R₇的存在下将影响或抑制纤维素酶的分泌或活性，进一步证明了康氏木霉胞外活性蛋白R₇不具有纤维素酶系中的内切酶、外切酶以及β-葡萄糖苷酶水解特性，但确实为纤维素酶阻遏相关的蛋白。

参考文献：

[1]Meisel C.et al.Food Biotechnology.1989(3)，145～155.

[2]高洁等，纤维素科学，北京，科学出版社，1996.

[3]Percival E.et al.Structural Carbohydratel Chem，London，Garnet Miller Ltd，1962，1～63.

[4]Durette P.et al.Advan.Carboh.Chem.1971(26)，490～502.

[5]Marchessault R.H.et al.Advan.Carboh.Chem.1967(22)，421.

[6]Selby K.Advan.Chem.Ser.1969(95)，34～50.

[7]Wood T.M.et al.Biotech.Bioeng.Symp.1975(5)，111～137.

[8]Wood T.M.et al.Biochem.J.1972(128)，1183～1192.

[9]Erikaaon K.E.et al.Biotech.Bioeng.1978(20)，317～332.

[10]Reesei E.T.Biotech.Bioeng.Symp.1976(6)，9～20.

[11]钟发刚，王新华，饲用纤维素酶研究进展.中国微生态学杂志.2002(5)，308～309.

[12].Pettersson L.et al.Proceedings of the 4th International Fermentation Symposium：Fermentation technology，Japan.1972：727～729.

[13]Mandels，M.J.et al.Appl.Microbiol.1971，21：152.

[14]Mandels M.et al.Growth and Cellulase Production by Trichoderma.Technical.Res.Cent.1975：81～110

[15].Wood，T.M.Biotechnol.Bioemg.symp.No.5：1975，111～137.

[16]中国科学院微生物所纤维素酶组.微生物学报.1976(3)，240～248.

[17]汪天虹，吴静，邹玉霞，氏木霉分子生物学研究进展[J].菌物系统.2000，19(1)，147～152.

[18]Kim J.O.et al.Cloning and characterization of thermostable endoglucanase(Cel8Y)fromthe hypert thermophilic Aquifex aeolicus VF5[J].Biochem.Biophy.Res.Commu.2000，279(2)，420～426.

[19]Hakamada Y.，Endo K.，Takizawa S.，et al.Enzymatic properties，crystallization，anddeduced amino acid sequence of an alkaline endoglucanase from Bacillus circulans[J].Biochim.Biophy.Acta.2002，1570：174～180.

[20]Shou T.Overproduction of recombinant Trichoderma reesei cellulases by Aspergillusoryzae and their enzymatic properties.J.Biotech.1998(65)，163～71.

[21]肖志壮，王婷，汪天虹，等.瑞氏木霉内切葡聚糖酶III基因的克隆及在酿酒酵母中的表达[J].微生物学.2001，41(4)，391～396.

[22]Bhat M.K.Cellulases and related enzymes in biotechnology.Biotech.Advan.2000(18)，355～383

[23]周正红，贾宗剑，高孔荣，纤维素酶在食品发酵工业的应用及前景.暨南大学学报.1998(5)，125～130.

[24]云秀芳，纤维素酶在酱油生产中的应用研究.中国调味品.2001(3)，15-19

[25]朱元招，刘亚力，陈宏等.补饲不同配方酶制剂对断奶犊牛生产性能的影响.中国草食动物.2001(3)121～125.

[26]席兴军，韩鲁佳，原慎一郎等.添加乳酸菌和纤维素酶对玉米秸秆青贮饲料品质的影响.中国农业大学学报.2003，8(2)，21～24.

[27]林开江，阮丽娟，王龙英等.纤维素酶及其在生物抛光上的应用.生物技术.1996(3)，45～48.

[28]费云山，梅卓然，王荣生.酶洗涤中纤维素酶的作用方式与途径的探讨.印染.1994(9)，5～10.

[29]赵玉林，陈中豪，王福君.纤维素酶在造纸工业中的应用研究进展纤维素酶在造纸工业中的应用研究进展.生物技术.2003(3)，64～66

[30]陈冠军，秦梦华，曲音波等.纤维素酶脱墨机理的研究进展.生物工程进展.2001(3)，17～22.

[31]杜宗军.色葡萄状穗霉纤维素酶的纯化和性质[J]，青岛海洋大学学报.2002，32(1)，79～84.

[32]李军辉.糖蜜酒精废液诱导产生纤维素酶及其诱导活性因子的分离鉴定.广西大学论文集.2001，5.

[33]Hermann Schagger.Electrophoretic Isolation of Membrane Proteins from AcrylamideGels.Appl.Biochem.Biotech.1994(48)，185～203.

[34]David A.et al.Preparative Purification of Trichoderma reesei.Native and‘Core’Cellobiohydrolase by Electrophoresis and Chromatofocusing.Appl.Biochem.Biotech.1991(28/29)386～376.