一种抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸及应用

摘要

本发明提供一种抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸及应用，它包含序列表1所示的核苷酸序列为：TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG，能抑制STAT1、STAT4的磷酸化而调节Th1细胞分化，能抑制STAT3的磷酸化而调节Th17细胞分化。经过硫代修饰增加其在细胞内的稳定性，或使用其它核酸载体，如脂质体或多价阳离子聚合物，以及经过靶向修饰的核酸载体携带该序列的复合物。所述的寡聚脱氧核苷酸的安全有效剂量与药学上可接受的药物组合物可在多种免疫性疾病中应用，以恢复免疫失衡，优于特异性的细胞因子拮抗剂。该ODN与哺乳动物端粒区的结构类似，与其他免疫调节剂相比对人体更安全。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸及应用，属于免疫学和生物技术药物的交叉研究领域。具体涉及一种具有免疫调节作用的化合物，即一种抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸，在临床上可用于Th1和/或Th17过度激活的自身免疫性和其它炎症性疾病。本发明还具体的涉及该免疫调节性寡聚脱氧核苷酸的作用机制，即抑制STAT1，3，4(STATs，Signal transducer and activator oftranscription)的磷酸化。

背景技术

免疫系统的过度激活和持续的炎症反应导致了各种自身免疫性疾病和炎症性疾病的发生。T淋巴细胞是介导特异性免疫应答的主要免疫细胞，按照其功能不同可以分为多种亚群，其中Th1/Th2和Th17/CD4⁺CD25⁺调节性T细胞(Treg)细胞功能失衡被证实参与多种自身免疫性疾病的启动和发展。

早年的许多研究指出Th1细胞及其相关的细胞因子所介导的炎症反应和组织损伤在自身免疫性疾病的发病机制中起了至关重要的作用。例如Th1细胞的过继转输加剧了1型糖尿病和自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发生，多发性硬化(MS)患者给予Th1关键性的细胞因子IFN-γ会使病情加剧。另外一些慢性炎症性疾病如动脉粥样硬化也被认为是Th1占优势的疾病。

然而，IFN-γ作为Th1的效应分子，在IFN-γ缺陷鼠或IFN-γR缺陷鼠无IFN-γ信号，仍可发生自身免疫病，甚至对自身免疫病更易感。这说明除Th1细胞外还有其他Th细胞亚群参与诱导自身免疫病。新近证实这是一种能特异性产生IL-17的Th细胞亚群，被命名为Th17细胞。Th17代表一类不同于Th1或Th2的CD4⁺Th细胞亚群，具有很强的促炎症作用，并与多种自身免疫病的发生和发展有关。EAE和胶原诱导的关节(CIA)传统上被认为由IL-12诱导Th1细胞介导，近年在上述疾病模型中均发现IL-17含量增高，过继转输Th17诱发严重的EAE，而IL-17-/-小鼠表现出对上述疾病的明显抵抗，证实上述疾病实际上主要由Th17诱导。此外，Th17介导的炎症反应还参与了哮喘、炎症性肠病和器官移植排斥反应等疾病的发生。

现在普遍认为Th1和Th17均参与了自身免疫的炎症过程，它们单独或协同诱导炎症反应和组织损伤的过程。因此在继Th1之后，Th17成为抗炎和免疫调节治疗的新靶点。

寡聚脱氧核糖核苷酸(oligodeoxynucleoside，ODN)对免疫系统有着复杂的作用。研究表明，人工合成的包含有非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)基序的寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)可以刺激B细胞、NK细胞等增殖、成熟，促进Th1型细胞因子的分泌。而包含TTAGGG序列的ODN(ODNA151)不仅可以抑制CpG-ODN诱导的免疫刺激作用，而且可以通过调节T细胞亚群的分化改善多种自身免疫性疾病的进展和预后，因此被称之为抑制性ODN(Suppressive ODN)。研究发现，抑制性ODNA151可以与STAT1和STAT4结合并阻止其磷酸化，从而抑制下游转录因子T-bet(Th1细胞分化特征性转录因子)的表达，而对Th2细胞分化的信号通路STAT6-GATA3没有影响，因此可用于治疗Th1细胞占优势的自身免疫性疾病。我们的研究发现，应用抑制性ODNA151在体干预ApoE-/-自发性动脉粥样硬化小鼠，可以显著抑制STAT1/4和T-bet通路，抑制Th1细胞功能而减少动脉粥样硬化斑块面积。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸(ODN)，即调节性ODN(regulatory oligodeoxynucleoside)。此调节性ODN能有效的抑制IFN-γ的分泌，抑制Th1的转录因子STAT1和STAT4，从而调节Th1的分化；此调节性ODN还能有效的抑制IL-17的分泌，抑制Th17的转录因子STAT3的磷酸化，从而调节Th17的分化。本发明还具体提供该免疫调节性寡聚脱氧核苷酸的作用机制，即抑制STAT1，3，4的磷酸化。

本发明的技术方案：本发明提供了一种抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODN R01，它包含序列表<210>1所示的核苷酸序列。

所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNR01，能抑制STAT1、STAT4的磷酸化而调节Th1细胞分化的寡聚脱氧核苷酸，其核苷酸序列为：TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG。

所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNR01，能抑制STAT3的磷酸化而调节Th17细胞分化的寡聚脱氧核苷酸，其核苷酸序列为：TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG。

所述的根据权利要求1所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODN R01，经过硫代修饰增加其在细胞内的稳定性，或使用其它核酸载体，如脂质体或多价阳离子聚合物，以及经过靶向修饰的核酸载体携带该序列的复合物。

所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNR01，可应用在体外调节Th1和Th17细胞的分化。

所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNR01，可应用于筛选其它的免疫调节剂。

所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNR01的应用，其安全有效剂量与药学上可接受的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODN R01的药物组合物。

所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNR01在治疗和/或预防下列表1和表2所述的多种疾病中的应用：

表1部分Th1占优势的疾病

表2部分已明确的Th17来源的细胞因子起致病作用的疾病

所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNR01的应用，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的所述的核苷酸序列或其药用组合物。

本发明的优点：免疫反应介导的炎症性损伤实际上是一种免疫失衡，包括T细胞亚群功能的失衡，本发明的调节性ODN通过调节Th1和Th17的分化，以恢复免疫失衡，因此优于特异性的细胞因子拮抗剂。该ODN与哺乳动物端粒区的结构类似，与其他免疫调节剂相比对人体更安全。在我们自行设计的几种调节性ODN中，ODN R01对Th1和Th17的抑制作用最强，对STAT1，3，4的磷酸化的抑制作用也是最强的，并且优于ODN A151，也就是说ODN R01能更好的调节Th1和Th17的分化。

附图说明

图1是G-tetrad和G-quadruplex的结构。富含鸟嘌呤的单链DNA在一定的条件下可以形成G-quadruplex的结构，这是一种热力学和动力学性质都很稳定的四链体DNA结构，G-quadruplex的基本结构单位即是G-tetrad。G-tetrad由鸟嘌呤通过分子间Hoogsteen氢键形成，M⁺代表单价阳离子，稳定G-tetrad的结构。

图2是ODN R01的结构。ODN R01通过分子间Hoogsteen氢键形成G-quadruplex。

图3是调节性ODN抑制IFN-γ的分泌。用ConA活化脾细胞，与ODN共培养，ELISA检测上清中IFN-γ的浓度，以此筛选我们自行设计的几种调节性ODN。

图4是调节性ODN抑制IL-17的分泌。用ConA活化脾细胞，与ODN共培养，ELISA检测上清中IL-17的浓度，以此筛选我们自行设计的几种调节性ODN。

图5，6，7是ODN R01在极化条件下抑制Th1分化。用ConA活化脾细胞，在Th1(以IL-12，anti-IL-4诱导Th1的分化)极化条件下与ODN共培养。用ELISA和流式细胞术(FACS)进行检测。

图5是ODN R01抑制Th1分化的ELISA结果。

图6是ODN R01抑制Th1分化的FACS散点图。a为同型对照，b为空白对照，c为ODN1612，d为ODN R01，e为ODNA151。

图7是ODN R01抑制Th1分化的FACS结果的数据统计，Th1细胞(IFN-γ⁺CD4⁺)/CD4⁺T细胞的比例。

图8，9，10是ODN R01在极化条件下抑制Th17的分化。用ConA活化脾细胞，在Th17(以IL-6，IL-21，IL-23，TGF-β1，anti-IL-4，anti-IFN-γ诱导Th17的分化)极化条件下与ODN共培养，用ELISA和FACS进行检测。

图8是ODN R01抑制Th17分化的ELISA结果。

图9是ODN R01抑制Th17分化的FACS散点图。a～e为流式细胞术散点图：a为同型对照，b为空白对照，c为ODN1612，d为ODN A151，e为ODNR01。

图10是ODN R01抑制Th17分化的FACS结果的数据统计，Th17细胞(IL-17⁺CD4⁺)/CD4⁺T细胞的比例。

图11是ODN R01抑制STAT1，3，4的磷酸化。将小鼠的脾细胞与ODN共孵育1h，再分别用IFN-γ，IL-12或IL-6刺激20min，使STAT1，3，4磷酸化。然后用Western blot检测STAT1^phox/STAT1，STAT4^phox/STAT4，STAT3^phox/STAT3的表达水平。

图12是ODN R01抑制STAT1，3，4磷酸化的半定量分析。将Western blot图片用Totallab 100图像分析软件分析后，将各组磷酸化蛋白的水平与对照组对比，以其相对表达水平来进行统计学分析。

注：*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

具体实施方式

本发明提供了一种抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODN R01，它包含序列表<210>1所示的核苷酸序列。

所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNR01，能抑制STAT1、STAT4的磷酸化而调节Th1细胞分化的寡聚脱氧核苷酸，其核苷酸序列为：TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG。

所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNR01，能抑制STAT3的磷酸化而调节Th17细胞分化的寡聚脱氧核苷酸，其核苷酸序列为：TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG。

所述的根据权利要求1所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODN R01，经过硫代修饰增加其在细胞内的稳定性，或使用其它核酸载体，如脂质体或多价阳离子聚合物，以及经过靶向修饰的核酸载体携带该序列的复合物。

所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNR01，可应用在体外调节Th1和Th17细胞的分化。

所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNR01，它应用于筛选其它的免疫调节剂。

所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNR01的应用，其安全有效剂量与药学上可接受的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODN R01的药物组合物。

所述的抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸-ODNR01的应用，包括给有需要的患者施用治疗或预防有效量的所述的核苷酸序列或其药用组合物。

本发明中所提到的寡聚脱氧核苷酸可用各种该领域常用的oligo DNA合成方法合成。该ODN是鸟嘌呤丰富的序列，倾向于形成G-quadruplex的结构(图1)。该ODN经过硫代修饰使其在细胞内稳定，防止细胞内的核酸酶降解。本发明还包括用其它核酸载体如脂质体或多价阳离子聚合物等，以及经过靶向修饰的核酸载体携带该序列的复合物。

实验报告一：调节性ODN抑制Th1和Th17的分化

Th1细胞及其分泌的细胞因子能启动级联的促炎性反应，导致持续的自身免疫性组织损伤。ODN A151能选择性的减少Th1型细胞因子的产生，并促进Th2型的免疫应答。这是因为抑制性ODN能阻断IFN-γ和IL-12介导的信号通路，从而阻止初始CD4⁺T细胞向Th1细胞分化。虽然抑制性ODN不能直接促进Th2的分化，IFN-γ的产生减少强烈的促进了Th2型的免疫应答。ODNA151通过通过调节体内Th1/Th2的平衡，抑制病理性的过度炎症反应，已被证明能有效的预防和治疗Th1型的某些自身免疫性疾病。

Th17主要介导防御胞外病原微生物的感染，参与自身免疫和炎症反应。IL-17是一种致炎因子，它可以通过诱导其他炎症细胞因子如IL-6，TNF-α以及趋化因子如MCP-1，MIP-2等的表达，介导炎症细胞到局部的浸润及组织损伤，通过不同机制发挥致炎作用。给实验性自身免疫性眼葡萄膜炎的小鼠腹腔注射ODNA151，能明显缓解病情，并且能抑制抗原特异性的淋巴细胞分泌IFN-γ以及IL-17和IL-22。ODN A151作为一种免疫调节剂已被成功的用于多种疾病模型，其有效性除了通过Th1介导以外，也可能是通过Th17介导。ODN究竟是否能影响Th17的分化，目前还无这方面的研究。

本研究采用我们自行设计的几种寡聚核苷酸序列，通过体外实验，探讨其能否调节Th1及Th17的分化。

1材料与方法

1.1实验动物

材料清洁级近交系C57BL/6J小鼠，雄性，6-8周龄，体重22g左右。由华中科技大学同济医学院动物实验动物中心提供。

1.2主要仪器

流式细胞仪：FACS Calibur型，Becton Dickinson，美国

全自动酶标仪：ELX800型，Bio-tek，美国

1.3主要试剂

ODN：化学合成，全链硫代磷酸化修饰，PAGE纯化，invitrogen，其序列为

调节性ODN ODN R01 TAGGGTAGGGTAGGGTAGGG(SEQ ID NO：1)

调节性ODN ODN R02 TTTAGGGTTAGGGTTAGGG(SEQ ID NO：2)

调节性ODN ODN R03 TCAGGGTCAGGGTCAGGGTCAGGG(SEQ ID NO：3)

调节性ODN ODN R04 TAAGGGTAAGGGTAAGGGTAAGGG(SEQ ID NO：4)

阳性对照ODN A151 TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG

阴性对照ODN1612 GCTAGAGCTTAGGCT

诱导分化细胞因子：

a)小鼠IL-12，小鼠IL-6，小鼠IL-21，人TGF-β1，均购自PeproTech，英国。

b)小鼠IL-23，小鼠anti-IL-4，小鼠anti-IFN-γ，均购自ebioscience，美国。

细胞因子ELISA检测试剂盒：IFN-γ，IL-17A，Bender，德国。

流式细胞术检测：

a)抗体：FITC标记的抗小鼠CD4单抗，PE标记的抗小鼠IFN-γ单抗，IL-17单抗，相应的同型对照抗体，均购自ebioscience，美国。

b)刺激剂及膜抑制剂：佛波醇乙酯(PMA)，离子霉素(Ionomycin)，莫能霉素(Monensin)，均购自BD Pharmingen，美国。

c)FACS破膜剂：BD Biosciences，美国。

d)FACS固定剂：ebioscience，美国。

1.4细胞培养

取C57BL/6J小鼠脾脏用密度梯度离心法分离单个核细胞，分为未刺激组，空白对照组，ODN1612组，ODN A151组，ODN R01～R04组，除未刺激组外均以ConA 2.5μg/ml刺激，后6组分别加入相应的ODN 5μM，如有必要，IL-12 10ng/ml，anti-IL-410ug/ml诱导Th1的分化，以IL-650ng/ml，IL-21 50ng/ml，IL-23 50ng/ml，TGF-β1 2.5ng/ml，anti-IL-410μg/ml，anti-IFN-γ10μg/ml诱导Th17的分化。细胞置于37℃、5％CO₂培养72小时，收集上清用于细胞因子ELISA检测。

1.5细胞培养上清细胞因子ELISA检测

IFN-γ(灵敏度：7.8pg/ml)，IL-17A(灵敏度：7.8pg/ml)：根据试剂盒说明书进行检测。每个样本设置3个复孔，于酶标仪450nm波长处测光密度值；根据标准曲线测出标本细胞因子含量。

1.6流式细胞术检测Th1细胞和Th17细胞

分别将小鼠脾细胞在Th1(IL-1210ng/ml，anti-IL-410μg/ml)和Th17(IL-650ng/ml，IL-2150ng/ml，IL-2350ng/ml，TGF-β12.5ng/ml，anti-IL-410μg/ml，anti-IFN-γ10μg/ml)的极化条件下进行培养。刺激剂及分组情况同上，细胞置于37℃、5％CO₂培养72小时。培养的细胞以PMA 50ng/ml，Ionomycin 1μg/ml再刺激，同时加入蛋白转运抑制剂Monensin 1μg/ml，置于37℃、5％CO₂再培养4h。收集细胞后，依次进行表面抗原染色(FITC标记的抗小鼠CD4单抗)，将细胞固定，破膜，进行胞内细胞因子染色(PE标记的抗小鼠IFN-γ单抗，IL-17单抗)。流式细胞仪上应用Cell Quest软件进行分析。

1.7统计学分析采用SPSS13.0统计软件，数值变量以均数±标准差表示。两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，方差齐者行Student Newman Keuls(S-N-K)检验，方差不齐者行Games-Howell检验。P＜0.05为差异具有显著性意义，P＜0.01为差异有极显著性意义。

2结果

2.1ODN R01降低Th1型细胞因子的分泌C57BL/6J小鼠的脾细胞在ConA刺激下，与ODN共孵育后ELISA检测培养上清液中细胞因子。在我们自行设计的几种ODN中，ODN R01，R03，R04与对照组相比，均能抑制Th1细胞因子的分泌，明显减少上清中IFN-γ含量，ODN R02的作用不明显。其中ODN R01的抑制作用最强(R01vs对照：100.04±26.24vs 495.77±102.46pg/ml，P＜0.01)，且比ODN A151(254.00±71.42pg/ml，P＜0.01)的作用更明显，而ODN 1612对细胞因子的分泌没有明显作用(见图3)。

2.2ODN R01降低Th17型细胞因子的分泌用同样的方法检测ODN处理后细胞培养上清液中IL-17的含量。我们同样发现ODN R01，R03，R04与对照组相比，均能抑制Th17细胞因子的分泌，明显减少上清中IL-17含量，ODN R02的作用不明显。其中ODN R01的抑制作用同样最强(R01 vs对照：11.30±2.20vs 36.89±5.13pg/ml，P＜0.01)，且优于ODNA151(22.51±5.08pg/ml，P＜0.01)，而ODN 1612对细胞因子的分泌没有明显作用(见图4)。

2.3ODN R01抑制Th1的分化由于ODN R01能明显减少IFN-γ和IL-17的分泌，且其抑制作用优于ODN A151，因此我们选择ODN R01进行深入研究，探讨其在极化条件下对T细胞分化的影响。用IL-12，anti-IL-4诱导Th1的分化，与ODN共孵育，ELISA检测上清中IFN-γ的浓度。与中性的培养条件一样，ODN R01能明显减少IFN-γ的分泌(302.09±32.98vs 1582.44±158.69pg/ml，P＜0.01，见图5)。同时用流式细胞术检测Th1细胞的比例，其结果与ELISA一致，ODN R01能明显减少CD4⁺IFN-γ⁺细胞的比例(5.33±1.38vs 2.65±3.21％，P＜0.01，见图6，7)。另外ODN R01对Th1分化的抑制作用比ODN A151更明显(ELISA：302.09±32.98vs627.99±139.01pg/ml，P＜0.05；FACS：5.33±1.38vs 10.02±1.24％，P＜0.05)。

2.4ODN R01抑制Th17的分化为了进一步阐明ODN R01对Th17细胞分化的影响，用IL-6，IL-21，IL-23，TGF-β1，anti-IL-4，anti-IFN-γ诱导Th17的分化，与ODN共孵育，ELISA检测上清中IL-17的浓度。与中性的培养条件一样，ODN R01能明显减少IL-17的分泌(315.79±76.66vs 1830.73±537.35pg/ml，P＜0.01，见图8)。同时用流式细胞术检测Th17细胞的比例，其结果与ELISA一致，ODN R01能明显减少CD4⁺IL-17⁺细胞的比例(5.01±1.59vs 19.96±4.15％，P＜0.05，见图9，10)。同样，与ODN A151相比，ODN R01对Th17有更好的抑制作用(ELISA：315.79±76.66vs 1003.53±159.12pg/ml，P＜0.05；FACS：5.01±1.59vs 9.95±2.20％，P＜0.05)。

实验报告二调节性ODN通过抑制STAT1，3，4的磷酸化调节Th1和Th17细胞分化

细胞因子通过JAK-STAT信号途径促进Th细胞的分化，IL-12和IFN-γ分别通过激活STAT1和STAT4促进Th1的分化，而IL6-STAT3信号通路则通过调节Th17特异性的转录因子RORγt促进Th17的分化。ODNA151进入细胞后能诱导胞浆中STAT1和STAT4向内涵体中移行，并直接与其绑定，抑制二者的磷酸化，从而揭示了ODN A151调节Th1分化的具体机制。在我们自行设计的几种ODN中，ODN R01不仅能抑制Th1和Th17的分化，且作用强于ODN A151，我们推测它也可能是通过STAT途径起作用。

1材料与方法

1.1实验动物

材料清洁级近交系C57BL/6J小鼠，雄性，6-8周龄，体重22g左右。由华中科技大学同济医学院动物实验动物中心提供。

1.2主要试剂

STAT1^phox/STAT1，STAT4^phox/STAT4，STAT3^phox/STAT3(Cell SignalTechnology)，GADPH抗体(碧云天)，山羊抗兔IgG，兔抗小鼠IgG(signalway antibody，美国)，ECL发光试剂盒(pierce，美国)

1.3Western blots检测STATs^phox/STATs

取C57BL/6J小鼠脾脏用密度梯度离心法分离单个核细胞，与ODN共同孵育1h，分别用IFN-γ，IL-12或IL-6刺激20min，使STAT1，STAT3，STAT4磷酸化。裂解细胞提取蛋白，进行Western blots分析，检测STAT1^phox/STAT1，STAT3^phox/STAT3，STAT4^phox/STAT4的表达水平。

1.4图像分析

Totallab 100图像分析软件进行图像分析分别以STAT1^phox/STAT1，STAT3^phox/STAT3，STAT4^phox/STAT4，与GADPH条带的吸光面积积分比值来评定STAT1^phox/STAT1，STAT3^phox/STAT3，STAT4^phox/STAT4蛋白表达水平。

1.5统计学分析统计学分析采用SPSS13.0统计软件，数值变量以均数±标准差表示。两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，方差齐者行Student Newman Keuls(S-N-K)检验，方差不齐者行Games-Howell检验。P＜0.05为差异具有显著性意义，P＜0.01为差异有极显著性意义。

2结果ODN R01抑制STAT1，3，4的磷酸化

ODN A151通过抑制STAT1，3，4的磷酸化发挥免疫调节作用。ODNR01与ODN A151一样，均能抑制磷酸化STAT1，3，4的表达，而ODN1612对磷酸化STATs的表达无影响。所有ODN均不影响非磷酸STATs的表达。将Western blots结果用totallab 100软件进行分析，ODN R01处理组磷酸化蛋白的表达水平明显低于阴性对照组(P＜0.01)，亦低于ODN A151(P＜0.05)。这可能就是ODN R01能更好抑制Th1和Th17分化的原因(见图11，12)。

讨论

T淋巴细胞介导的免疫反应在感染、炎症、自身免疫和肿瘤等疾病中起重要作用。Th17和Th1介导的免疫应答在外来病原体入侵时起保护作用，然而在自身免疫和许多慢性炎症性疾病中，Th17和Th1分泌的炎性因子则会介导组织损伤，加剧病情的进展，甚至成为其迁延不愈的原因之一，因此T淋巴细胞成为免疫调节治疗的重要靶点。人们曾尝试各种方法调节Th1/Th2之间的平衡，下调病理性Th优势应答，促进向保护性Th优势应答类型的转变。近年来随着对Th17认识的不断深入，尤其是它在炎症反应及自身免疫性疾病中的作用引起了广泛关注。治疗自身免疫性疾病和移植排斥反应的西罗莫斯和环孢素A均能抑制Th17的分化，而青蒿素衍生物S M905和半乳凝素-9治疗胶原诱导性关节炎也被认为以抑制Th17为基础，用来治疗银屑病，类风湿性关节炎，Crohn′s病的IL-17的单克隆抗体AIN457已经进入II期临床试验，Th17已经成为了药物治疗的新靶点。

治疗性核酸作为一种新型的生物技术药，发展势头良好。反义核酸，DNA疫苗，小分子干扰RNA，Decoy核酸均已进入临床研究，部分药物已投入使用。而近年来具有免疫调节作用的寡聚核苷酸也受到越来越多的关注。细菌DNA中非甲基化的CpG基序具有免疫刺激活性，能激活机体的天然免疫和适应性免疫应答。CpG ODN作为一种免疫增强剂已被用于感染，肿瘤，哮喘，过敏等疾病的治疗，并且作为疫苗的佐剂使用。例如抗肿瘤药物CpG ODN Oblimersen(Genasense/G3139；Genta Inc)已经完成了III期临床试验，正在申请投入使用。与之相对应的便是具有免疫抑制作用的suppressive/inhibitory ODN，ODN A151是其典型代表。ODN A151中的TTAGGG基序是哺乳动物端粒区中的典型序列，当组织损伤时便从细胞中释放出来。人工合成的包含这种基序的ODN能下调促炎性细胞因子尤其是Th1型细胞因子的产生。这种抑制性ODN已被用于CpG诱导的炎症性关节炎，CIA，EAE，狼疮肾炎，内毒素性休克，实验室自身免疫性眼葡萄膜炎等动物模型的治疗，均取得了良好的疗效。我们的研究也表明抑制性ODN能减小ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积。抑制性ODN对于自身免疫性疾病及慢性炎症性疾病表现了良好的治疗前景。

本发明所述之调节性ODN具有与ODN A151相似的免疫调节作用。我们的体外实验表明ODN R01通过抑制STAT1，4的磷酸化调节Th1的分化，抑制STAT3的磷酸化调节Th17的分化，并且抑制作用更优于ODNA151。因此有理由相信ODN R01作为一种免疫调节剂可被应用于Th1和Th17起致病性作用的各种自身免疫性和慢性炎症性疾病。

STATs是胞浆中的一类转录因子家族，哺乳动物的STAT蛋白包括STAT1，2，3，4，5a，5b和6，参与细胞的增殖，分化和凋亡。STAT蛋白能够被多种配体激活，尤其是细胞因子和生长因子，在T细胞的分化中起着举足轻重的作用。除了参与Th17分化的调节以外，STAT3在肿瘤细胞中能够被组成性的活化，进而转录激活编码凋亡抑制剂，细胞周期调节剂和血管生成诱导剂的基因的表达，促进肿瘤的生长，目前已有很多种靶向STAT3的抗肿瘤药物，其中包括一种G-quartet ODN(GQ-ODN，其序列为GGGCGGGCGGGCGGGC)。这种GQ-ODN靶向作用于STAT3的SH2结构域，抑制STAT3被活化的受体复合物募集以及二聚化，从而抑制STAT3的活化。GQ-ODN已被成功的用于前列腺癌，乳腺癌，头颈部肿瘤等多种动物模型。这种GQ-ODN也是鸟嘌呤丰富的序列，通过Hoogsteen氢键形成四链体DNA的结构。本发明所述的ODN R01也具有类似的结构，在我们的研究中也证实ODN R01能抑制STAT3的磷酸化。因此作为靶向STAT3的药物ODN R01还可用于肿瘤的治疗。

本发明可在治疗和/或预防下列表1和表2所述的多种疾病中的应用：

表1部分Th1占优势的疾病

表2部分已明确的Th17来源的细胞因子起致病作用的疾病

SEQUENCE LISTING

<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院

程，翔

廖，玉华

夏，霓

肖，宏

唐，婷婷

严，欣欣

谢，江娇

姚，瑞

廖，梦阳

<120>一种抑制Th1和Th17分化的免疫调节性寡聚脱氧核苷酸

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>免疫调节性寡聚脱氧核苷酸

<400>1

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<210>2

<211>19

<212>DNA

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<223>免疫调节性寡聚脱氧核苷酸

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<223>免疫调节性寡聚脱氧核苷酸

<400>3

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<223>免疫调节性寡聚脱氧核苷酸

<400>4

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