具有增强的效应子活性的遗传重组抗体组合物

摘要

本发明涉及重组抗体组合物，它是人类IgG1抗体，含有CH2结构域，该结构域中由Kabat等中的EU索引指示的276位和339位的氨基酸被其它氨基酸替代，并且与含有氨基酸被替代前的CH2结构域的抗体相比，具有进一步改进的补体依赖性细胞毒活性；包含在重组抗体组合物中的抗体分子或抗体分子重链恒定区的编码DNA；通过将DNA导入宿主细胞可获得的转化体；使用转化体生产重组抗体组合物的方法；以及含有重组抗体组合物作为活性成分的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及重组抗体组合物，它是人类IgG1抗体，含有CH2结构域，该结构域中由Kabat等中的EU索引指示的276位和339位氨基酸被其它氨基酸替代，并且与含有氨基酸被替代前的CH2结构域的抗体相比，具有进一步改进的补体依赖性细胞毒活性；包含在重组抗体组合物中的抗体分子或抗体分子的重链恒定区的编码DNA；可通过将DNA导入宿主细胞而获得的转化体；使用转化体生产重组抗体组合物的方法；以及含有重组抗体组合物作为活性成分的药物。

技术背景

因为抗体是对靶分子(抗原)具有高度结合活性和结合特异性、并且在血液中高度稳定的蛋白分子，因此已经尝试将其应用到各种人类疾病的诊断、预防和治疗药剂中(非专利文献1)。虽然抗体通常是通过将抗原施用(免疫)非人类动物而产生的，但从非人类动物获得的抗体具有物种特异性的氨基酸序列，并且由于抗体在人体中被识别成外来物质而引起副作用。因此，已经使用基因重组技术从人类之外的动物(非人类动物)的抗体制备了人类嵌合抗体或人源化抗体(非专利文献2到5)。

人类嵌合抗体和人源化抗体解决了非人类动物抗体例如小鼠抗体所具有的问题，例如免疫原性高、效应子功能低和血液半衰期短，通过使用它们，使得将单克隆抗体应用于药物制剂成为可能(非专利文献6到9)。例如，在美国，多种人源化抗体已经被批准用作癌症治疗的抗体，并在市场上销售(非专利文献10)。

这些人类嵌合抗体和人源化抗体的确在临床水平上显示出了某种程度的效果，但是需要效用较高的治疗性抗体。例如，在单次施用针对CD20的人类嵌合抗体美罗华(Rituxan)(非专利文献11)(由IDEC/Roche/Genentech制造)的情况下，在III期临床试验中已经报道，它对复发性低恶性非何杰金淋巴瘤患者的响应率不超过48％(完全缓解6％，部分缓解42％)，并且它的平均响应时期是12个月(非专利文献12)。在组合使用美罗华和化疗(CHOP：环磷酰胺、多柔比星、长春新碱)的情况下，已经报道，在II期临床试验中它对复发性低恶性和滤泡性非何杰金淋巴瘤患者的响应率是95％(完全缓解55％，部分缓解45％)，但是发现了由于CHOP引起的副作用(非专利文献13)。在单次施用针对HER2的人源化抗体赫赛汀(Herceptin)(由Genentech制造)的情况下，已经报道它在III期临床试验中对转移性乳腺癌患者的响应率仅仅为15％，它的平均响应时期是9.1个月(非专利文献14)。

人类抗体分子也被称为免疫球蛋白(后文称为Ig)，根据其分子结构分类成IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM同种型。氨基酸序列具有相对高同源性的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4被遗传上称为IgG。人类IgG主要被用作治疗性抗体。

抗体分子包含两种多肽，即重链(后文称为H链)和轻链(后文称为L链)。人类IgG抗体分子含有两条H链和两条L链。此外，H链含有H链可变区(后文称为VH)和H链恒定区(后文称为CH)，L链含有L链可变区(后文称为VL)和L链恒定区(后文称为CL)。H链恒定区含有4个结构域，它们从接近位于重链N-末端的VH的结构域开始，依次分别被称为CH1、铰链区、CH2和CH3结构域。此外，CH2结构域和CH3结构域被合称为Fc。

抗体通过含有VH和VL的抗原结合区(后文称为Fv)与抗原结合，通过H链恒定区与免疫系统中的效应分子例如受体或补体结合。在与免疫系统中的效应分子结合的介导下，抗体诱发了效应子活性，例如补体依赖性细胞介导的细胞毒活性(后文称为CDC活性)、抗体依赖性细胞性细胞毒活性(后文称为ADCC活性)或吞噬活性，从而消除抗原或表达抗原的细胞(病原体或肿瘤细胞)。

为了诱导ADCC活性或吞噬活性，重要的是抗体与表达在各种白细胞例如自然杀伤细胞(后文称为NK细胞)、单核细胞、巨噬细胞或粒细胞表面上的Fcγ受体(后文称为FcγR)家族的成员结合。FcγR家族包括活化型FcγR和调节型FcγR。FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIIb属于活化型FcγR，FcγRIIb属于调节型FcγR。人类IgG抗体与这样的受体强结合，从而诱导了白细胞的ADCC活性或吞噬活性。

ADCC活性是在抗体的介导下白细胞例如NK细胞主要裂解靶细胞的反应。抗体通过Fv与靶细胞表面上的抗原结合，并通过Fc与NK细胞表面上的FcγRIIIa结合。结果，NK细胞释放细胞毒性分子例如穿孔素或粒酶，并进而裂解靶细胞(非专利文献15和16)。

CDC活性是在抗体的介导下一组被称为补体的血清蛋白裂解靶细胞的反应。补体被分类成C1到C9蛋白，它们进行链式反应从而诱导CDC活性。每种补体蛋白通过与特定的补体蛋白反应而被激活，然后与后续的补体蛋白发生反应。这些链式反应随着第一个补体成分C1通过组成C1的蛋白之一C1q与抗体的Fc结合而开始，该抗体已经通过Fv与靶细胞表面上的抗原键合。最后，C5到C9的复合体聚合在一起，在靶细胞的细胞膜中形成孔洞，这导致靶细胞的裂解(非专利文献15和16)。

除了铰链区显示出广泛的变化性之外，四种人类IgG同种型(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)在H链恒定区的氨基酸序列中彼此高度同源。但是，这些同种型诱导不同强度的效应子活性(非专利文献17)。总的来说，ADCC活性按照下面的次序降低：IgG1＞IgG3＞IgG4≥IgG2(非专利文献18和19)，而CDC活性按照下面的次序降低：正如上面讨论的，抗体与C1q的结合对于诱导CDC活性是重要的。C1q与人类IgG同种型，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的单体抗体分子结合的结合常数(Ka)分别为1.2×10⁴、0.64×10⁴、2.9×10⁴和0.44×10⁴(非专利文献20)，反映出这些同种型之间CDC活性的差别。

就临床应用的抗体药物的药物作用机制来说，ADCC和CDC活性的重要性特别吸引公众注意。据报道，上面描述的美罗华，作为IgG1同种型的人类嵌合抗体，在体外显示出ADCC和CDC活性(非专利文献21)。就美罗华的临床效果来说，据报道，美罗华对于表现出具有高ADCC活性的基因型的患者展现出高度治疗效果(非专利文献22)，在其施用之后，血液中的补体成分被快速消耗(非专利文献23)，在其施用之后，遭到复发的患者的癌细胞中CDC活性调节剂CD59的表达显示出增加(非专利文献24)，等等。这些报道表明，美罗华确实在患者的体内执行效应子功能。同样有报道，上述的赫赛汀，作为IgG1亚类的人源化抗体，在体外显示出ADCC活性(非专利文献25)。

尽管人类IgG1和人类IgG3是具有极好的ADCC和CDC活性的同种型，但已知人类IgG3抗体在血液中的半衰期比其它人类IgG同种型更短，因此在施用后从血液中快速消失(非专利文献26)。还已知人类IgG3与其它人类IgG同种型不同，不具有蛋白A结合活性(非专利文献27)。在工业规模的抗体生产中，使用蛋白A的纯化工艺是占优势的，其它例如使用蛋白G的工艺有一些问题，例如纯化成本高。

已知蛋白A与人类IgG抗体分子结合(非专利文献28)。当通过Kabat等的EU索引标注时(非专利文献29)，根据X-射线晶体学分析的结果指出，含有252到254位氨基酸的环、由308到312位氨基酸构成的环、以及含有433到436位氨基酸的环是重要的(非专利文献28)。根据核磁共振(NMR)分析的结果，进一步表明在IgG1的Fc中，Ile253、Ser254、His310、Gln311、His433、His435和His436是特别重要的(非专利文献30)。此外，Kim等发现，通过用来自IgG3的Arg435代替人类IgG1的His435，蛋白A结合活性减弱(非专利文献31)。后文中，抗体分子的氨基酸序列中的氨基酸位置，都是根据Kabat等的EU索引(非专利文献29)表示的。

基于上述，可以说人类IgG1抗体是最适合作为抗体药物的同种型，因为它具有比其它同种型更高的ADCC和CDC活性，能够使用蛋白A纯化，在血液中显示出长半衰期，并具有生产成本角度上的优点。尽管人类IgG1抗体如上所述已经在实践中用作药物，但现有的抗体药物展示出的药物作用仍不充分。因此，对作用改进的抗体药物一直存在着需求。为了满足这种需求，对于具有增强的效应子活性的抗体进行了研究。正如上面讨论的，抗体的效应子活性反映了H链恒定区与免疫系统中的效应分子的结合活性。因此，抗体的效应子活性能够通过增强H链恒定区与免疫系统中的效应分子的结合活性来加强。

为了分析人类抗体的效应子活性，对含有两种人类同种型氨基酸序列的抗体进行了研究，所述抗体是通过在具有不同效应子活性的两种人类同种型抗体之间，对重链恒定区中的氨基酸序列进行部分交换而制备的(专利文献1和非专利文献32和33)。在1980年代后期，Morrison等指出，通过在具有高效应子活性的IgG1和具有低效应子活性的IgG4之间、或在具有低效应子活性的IgG2和具有高效应子活性的IgG3之间，对重链恒定区中的个体结构域(CH1、CH2、CH3和铰链区)进行交换而制备的抗体分子，能够作为重组蛋白来表达(专利文献1)。作为对这些抗体分子的后续分析的结果，他们阐明了CH2结构域的C-末端侧在IgG1的CDC活性中是重要的，而CH2结构域在IgG3的CDC活性中是重要的(非专利文献32)；CH2结构域和铰链区在IgG1和IgG3与FcγRI的结合中是重要的(非专利文献33)；等等。

如上所述，CH2结构域在CDC活性中是重要的。已经分析了具有高CDC活性的人类IgG1抗体和人类IgG3抗体的氨基酸序列。对于CH2的氨基酸序列来说，已知Leu235(非专利文献34)、Asp270、Lys322、Pro329和Pro331(非专利文献35)在人类IgG1的CDC活性中是重要的；而Gly233、Leu234、Leu235、Gly236(非专利文献36)和Lys322(非专利文献37)在人类IgG3的CDC活性中是重要的。Brekke等分析了通过将具有高CDC活性的人类IgG1抗体和人类IgG3抗体的CH2结构域氨基酸序列所共有的氨基酸残基、或几个与具有非常低CDC活性的人类IgG4抗体不同的氨基酸残基移植到人类IgG4抗体中而制备的各种抗体分子。结果，他们发现，通过将人类IgG4中的Ser331交换成人类IgG1和人类IgG3共有的Pro331，增加了人类IGg4抗体的CDC活性(非专利文献38)。

此外，已经进行了尝试，通过将具有最高CDC活性的人类IgG同种型——人类IgG3抗体的重链恒定区氨基酸序列的一部分，与源于另一种人类IgG同种型的氨基酸序列进行交换，来增加CDC活性。对于每个IgG同种型的铰链区长度来说，IgG1具有15个氨基酸残基，IgG2具有12个氨基酸残基，IgG3具有62个氨基酸残基，和IgG4具有12个氨基酸残基。因此，人类IgG的结构特征是具有比其它IgG3同种型更长的铰链区(非专利文献1)。由62个氨基酸组成的人类IgG3抗体的铰链区由基因上的4个外显子编码。Michaelsen等报道，通过在N-末端侧缺失掉这四个外显子中的三个外显子而将铰链区缩短到15个氨基酸残基的人类IgG3抗体，其CDC活性高于IgG3和IgG1(非专利文献39)。Norderhang等报道，通过将上述缩短的铰链区的氨基酸序列与IgG4铰链区的氨基酸序列进行交换，CDC活性进一步增加。此外Brekke等报道，当人类IgG3抗体的铰链区被人类IgG1抗体的铰链区交换时，得到的抗体的CDC活性高于IgG3，与IgG1相似或更高(非专利文献41)。

另一方面，对于通过将人类IgG1抗体的重链恒定区氨基酸序列替代成在天然不存在的人工氨基酸序列而制备的抗体进行了研究，这种替代是为了增加Clq结合活性并进而增强CDC活性(非专利文献42和专利文献2到5)。如上所述，CDC活性由构成补体蛋白C1的蛋白之一Clq与抗体分子的Fc结合所诱导。Idusogie等报道，通过用其它氨基酸代替上面所述的美罗华(人类IgG1嵌合抗体)的CH2结构域中的Lys326或Glu333，CDC活性最高增加两倍(非专利文献42，专利文献2)。此外，Idusogie等指出，通过用其它氨基酸代替IgG2中的Lys326或Glu333，IgG2的CDC活性，原本只相当于IgG1的CDC活性的几百分之一，增加到了IgG1的大约二十五分之一(专利文献3到5)。

但是，这种通过替代天然不存在的氨基酸序列替代而制备的抗体，具有在人体内被识别成外来物质并从而诱导与上面讨论的非人类动物抗体相似的副作用的风险。另一方面，通过在人类同种型之间交换氨基酸序列而制备的抗体的氨基酸序列，是人类本身携带的抗体的氨基酸序列的组合。

在治疗性抗体的治疗作用中，由抗体的Fc区与FcγR结合而诱导的ADCC和吞噬活性、以及由抗体与Clq结合而介导的CDC活性都是重要的。但是，抗体与Clq的结合和与FcγR的结合都是由Fc介导的，因此，恐怕目的在于增强CDC活性的氨基酸修饰可能会损害ADCC活性。在实践中，Idusogie等报道，通过将人类IgG1抗体的Fc用人造氨基酸序列替代而增强了CDC活性的抗体，显示出ADCC活性的严重降低(非专利文献42)。

至于氨基酸序列替代之外的增强抗体的效应子活性的方法，可以提及与抗体恒定区连接的糖链的调控。已知人类IgG抗体的ADCC活性，是根据与Fc中297位天冬酰胺相连接的复合物型N-糖苷连接的糖链的结构(图1显示了其模型图)而变化(专利文献6)。也已报道，抗体的ADCC活性根据该糖链中包含的半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺的量而变化(非专利文献43到46)。但是，ADCC活性最主要受到通过α1，6-键结合到糖链还原末端的N-乙酰葡萄糖胺上的岩藻糖的影响。即，IgG抗体，其具有的复合型N-糖苷连接的糖链中，岩藻糖没有结合到糖链还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺上，与所具有的复合型N-糖苷连接的糖链中，岩藻糖结合到糖链还原末端的N-乙酰葡萄糖胺上的IgG抗体相比，显示出明显更高的ADCC和FcγRIIIa结合活性(非专利文献47、48和49，以及专利文献7)。虽然糖链中没有岩藻糖的抗体分子在体内以天然类型存在，但已经知道，α1，6-岩藻糖基转移酶基因敲除的细胞，能够作为专门生产下述抗体组合物的细胞：所述抗体组合物具有的复合型N-糖苷连接的糖链中，岩藻糖没有结合到糖链还原末端的N-乙酰葡萄糖胺上(专利文献7和8)。

非专利文献1：《单克隆抗体：原理与应用》，Monoclonal Antibodies：Principles and Applications，Wiley-Liss，Inc.(1995)

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非专利文献17：《单克隆抗体：原理与应用》，MonoclonalAntibodies：Principles and Applications，Wiley-Liss，Inc.(1995)

非专利文献18：Nature，332，323(1988)

非专利文献19：Journal of Experimental Medicine，166，1351(1987)

非专利文献20：Biochemistry，15，5175(1976)

非专利文献21：Oncogene，22，7359(2003)

非专利文献22：Blood，99，754(2002)

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非专利文献26：Cancer Res.，58，3905(1998)

非专利文献27：Scand.J.Immunol.，15，275(1982)

非专利文献28：Biochemistry，20，2361(1981)

非专利文献29：《免疫学重要的蛋白的序列》第五版，Sequence ofProteins of Immunological Interest，Fifth Edition(1991)

非专利文献30：FEBS Lett.，328，49(1993)

非专利文献31：Eur.J.Immunol.，29，2819(1999)

非专利文献32：Journal of Experimental Medicine，173，1025(1991)

非专利文献33：Journal of Experimental Medicine，173，1483(1991)

非专利文献34：Immunology，86，319(1995)

非专利文献35：J.Immunol.，164，4178(2000)

非专利文献36：Mol.Immunol.，34，1019(1997)

非专利文献37：Mol.Immunol.，37，995(2000)

非专利文献38：Eur.J.Immunol.，24，2542(1994)

非专利文献39：Scand.J.Immunol.，32，517(1990)

非专利文献40：Eur.J.Immunol.，21，2379(1991)

非专利文献41：Mol.Immunol.，30，1419(1993)

非专利文献42：J.Immunol.，166，2571(2001)

非专利文献43：Human Antib Hybrid，5，143(1994)

非专利文献44：Hum Antib Hybrid，6，82(1995)

非专利文献45：Nat.Biotechnol.，17，176(1999)

非专利文献46：Biotechnol.Bioeng.，74，288(2001)

非专利文献47：Clin.Cancer.Res.，10，6248(2004)

非专利文献48：J.Biol.Chem.，277，26733(2002)

非专利文献49：J.Biol.Chem.，278，3466(2003)

专利文献1：US2003/0158389A1

专利文献2：WO00/42072

专利文献3：US2004/0132101A1

专利文献4：US2005/0054832A1

专利文献5：WO00/61739

专利文献6：WO02/31140

专利文献7：WO03/85107

发明的公开内容

本发明拟解决的问题

本发明的目标是提供一种抗体，其具有增强的效应子功能例如CDC活性和ADCC活性，具有改进的治疗效果而不损失其它效应子功能，并具有抗原性。此外，是为了提供能够作为药物生产的抗体，例如，具有蛋白A结合活性的抗体。

本发明提供了重组抗体组合物，它是人类IgG1抗体，含有CH2结构域，该结构域中由Kabat等中的EU索引指示的276位和339位氨基酸被其它氨基酸替代，并且与含有氨基酸被替代前的CH2结构域的抗体相比，具有进一步改进的补体依赖性细胞毒活性；包含在重组抗体组合物中的抗体分子或抗体分子重链恒定区的编码DNA；可通过将DNA导入宿主细胞而获得的转化体；使用转化体生产重组抗体组合物的方法；以及含有重组抗体组合物作为活性成分的药物。

解决问题的方法

优选地，本发明涉及下面的(1)到(24)：

(1)重组抗体组合物，它是人类IgG1抗体，含有CH2结构域，该结构域中由Kabat等中的EU索引指示的276位和339位氨基酸被其它氨基酸替代，并且与含有氨基酸被替代前的CH2结构域的抗体相比，具有进一步改进的补体依赖性细胞毒活性。

(2)上述(1)的重组抗体组合物，它是人类IgG1抗体，其中由Kabat等中的EU索引指示的276位和339位氨基酸分别被赖氨酸和苏氨酸替代。

(3)上述(1)或(2)的重组抗体组合物，其中Fc区的CH3结构域中包含的多肽，是含有对应于人类IgG3抗体中由EU索引指示的同样位置的氨基酸的多肽。

(4)上述(1)到(3)任一项的重组抗体组合物，含有在Fc区中具有复合型N-糖苷连接的糖链的人类IgG1抗体分子，其中在组合物中包含的与Fc区结合的全部复合型N-糖苷连接的糖链中，岩藻糖没有结合到糖链还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺上的糖链的比率是20％或以上。

(5)上述(1)到(3)任一项的重组抗体组合物，含有在Fc区中具有复合型N-糖苷连接的糖链的人类IgG1抗体分子，其中与抗体的Fc区结合的复合型N-糖苷连接的糖链，是其中岩藻糖没有结合到糖链还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺上的糖链。

(6)上述(1)到(3)任一项中描述的重组抗体组合物中包含的抗体分子的编码DNA。

(7)上述(1)到(3)任一项中描述的重组抗体组合物中包含的抗体分子的重链恒定区的编码DNA。

(8)可通过将上述(6)中描述的DNA导入宿主细胞而获得的转化体。

(9)上述(8)的转化体，其中宿主细胞是对外源凝集素具有抗性的细胞，该外源凝集素识别的糖链结构中，岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

(10)上述(8)的转化体，其中当编码抗体分子的基因被导入到宿主细胞中时，宿主细胞能够产生的抗体组合物所含有的抗体分子在Fc区中具有复合型N-糖苷连接的糖链，其中在组合物中包含的与Fc区结合的全部复合型N-糖苷连接的糖链中，岩藻糖没有结合到糖链还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺上的糖链比率是20％或以上。

(11)上述(10)的转化体，其中岩藻糖没有结合的糖链，是岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的糖链。

(12)上述(8)的转化体，其中宿主细胞是下述细胞：其中基因组被修饰，使得与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶活性降低或缺失，所述糖链修饰中，岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

(13)上述(8)的转化体，其中宿主细胞是下述细胞：其中基因组上编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的所有等位基因均被敲除，所述糖链修饰中，岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

(14)上述(12)或(13)的转化体，其中与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶，选自GDP-甘露糖-4，6-脱水酶(GMD)和GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶(Fx)。

(15)上述(14)的转化体，其中GDP-甘露糖-4，6-脱水酶是由选自下面(a)和(b)的DNA编码的蛋白：

(a)含有SEQ ID NO：18所表示的核苷酸序列的DNA；

(b)与由SEQ ID NO：18所表示的核苷酸序列构成的DNA在严紧条件下杂交、并编码具有GDP-甘露糖-4，6-脱水酶活性的蛋白的DNA。

(16)上述(14)的转化体，其中GDP-甘露糖-4，6-脱水酶是选自下面(a)到(c)的蛋白：

(a)含有SEQ ID NO：19所表示的氨基酸序列的蛋白；

(b)由其中SEQ ID NO：19所表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖-4，6-脱水酶活性的蛋白；

(c)由与SEQ ID NO：19所表示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖-4，6-脱水酶活性的蛋白。

(17)上述(14)的转化体，其中GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶是由选自下面(a)和(b)的DNA编码的蛋白：

(a)含有SEQ ID NO：20所表示的核苷酸序列的DNA；

(b)与由SEQ ID NO：20所表示的核苷酸序列组成的DNA在严紧条件下杂交、并编码具有GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶活性的蛋白的DNA。

(18)上述(14)的转化体，其中GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶是选自下面(a)到(c)的蛋白：

(a)含有SEQ ID NO：21所表示的氨基酸序列的蛋白；

(b)由其中在SEQ ID NO：21所表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列组成、并具有GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶活性的蛋白；

(c)由与SEQ ID NO：21所表示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列组成、并具有GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶活性的蛋白。

(19)上述(12)或(13)的转化体，其中与糖链修饰有关的酶是α1，6-岩藻糖基转移酶，所述糖链修饰中，岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

(20)(19)的转化体，其中α1，6-岩藻糖基转移酶是由选自下面(a)到(d)的DNA编码的蛋白：

(a)含有SEQ ID NO：22所表示的核苷酸序列的DNA；

(b)含有SEQ ID NO：23所表示的核苷酸序列的DNA；

(c)与由SEQ ID NO：22所表示的核苷酸序列组成的DNA在严紧条件下杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA；

(d)与由SEQ ID NO：23所表示的核苷酸序列组成的DNA在严紧条件下杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA。

(21)上述(19)的转化体，其中α1，6-岩藻糖基转移酶是选自下面(a)到(f)的蛋白：

(a)含有SEQ ID NO：24所表示的氨基酸序列的蛋白；

(b)含有SEQ ID NO：25所表示的氨基酸序列的蛋白；

(c)由其中在SEQ ID NO：24所表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白；

(d)由其中在SEQ ID NO：25所表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白；

(e)由与SEQ ID NO：24所表示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白；

(f)由与SEQ ID NO：25所表示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白。

(22)上述(8)到(21)任一项的转化体，其中宿主细胞是选自下面(a)到(i)的细胞：

(a)源于中华仓鼠卵巢组织的CHO细胞；

(b)大鼠骨髓瘤细胞系，YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞；

(c)小鼠骨髓瘤细胞系，NS0细胞；

(d)小鼠骨髓瘤细胞系，SP2/0-Ag14细胞；

(e)源于叙利亚仓鼠肾脏组织的BHK细胞；

(f)产生抗体的杂交瘤细胞；

(g)人类白血病细胞系，Namalwa细胞；

(h)胚胎干细胞；

(i)受精卵细胞。

(23)生产重组抗体组合物的方法，包括将上面(8)到(22)任一项中描述的转化体在培养基中培养，以在培养物中形成和积累抗体组合物；以及从培养物中回收和纯化抗体组合物。

(24)含有上面(1)到(5)任一项中描述的重组抗体组合物作为活性成分的药物组合物。

发明效果

本发明提供了重组抗体组合物，它是人类IgG1抗体，含有CH2结构域，该结构域中由Kabat等中的EU索引指示的276位和339位的氨基酸被其它的氨基酸替代，并且与含有氨基酸被替代前的CH2结构域的抗体相比，具有进一步改进的补体依赖性细胞毒活性；包含在重组抗体组合物中的抗体分子或抗体分子的重链恒定区的编码DNA；可通过将DNA导入宿主细胞而获得的转化体；使用转化体生产重组抗体组合物的方法；以及含有重组抗体组合物作为活性成分的药物。

附图简述

图1是示意图，显示了与IgG抗体重链中297位的天冬酰胺结合的复合型N-连接的糖链的结构。

图2是示意图，显示了人类IgG1抗体、人类IgG3抗体、1133型嵌合同种型和3311型嵌合同种型的结构域结构。

图3显示了质粒pKANTEX2B8γ3的构建步骤。

图4显示了质粒pKTX93/1133的构建步骤。

图5显示了质粒pKTX93/3311的构建步骤。

图6显示了抗CD20人类IgG1抗体、抗CD20人类IgG3抗体、1133型抗CD20嵌合同种型抗体和3311型抗CD20嵌合同种型抗体与抗CD20抗体CD20-IgG1(+F)在竞争性抑制分析中与Daudi细胞的结合活性。横坐标显示样品的浓度，纵坐标显示每种样品浓度下的结合抑制率。在图中，△和▲对于图A到H来说是共同的，显示了阴性对照抗Her2抗体赫赛汀(△)和抗CCR4抗体KM3060(▲)。对于图中的○和●来说，在每个图中对应的样品是不同的，图A显示了CD20-IgG1(+F)(○)和CD20-IgG1(-F)(●)，图B显示了CD20-IgG3(+F)(○)和CD20-IgG3(-F)(●)，图C显示了1133(+F)(○)和1133(-F)(●)，图D显示了3311(+F)(○)和3311(-F)(●)。

图7显示了抗CD20人类IgG1抗体、抗CD20人类IgG3抗体、1133型抗CD20嵌合同种型抗体和3311型抗CD20嵌合同种型抗体对Daudi细胞的CDC活性。横坐标显示样品名称，纵坐标显示CDC活性。图显示了每种样品在0.3μg/ml的浓度下的CDC活性。

图8显示了抗CD20人类IgG1抗体、抗CD20人类IgG3抗体和1133型抗CD20嵌合同种型抗体对ST 486细胞(A)或Raji细胞(B)的CDC活性。横坐标显示抗体浓度，纵坐标显示每种抗体浓度下的CDC活性。在图中，□显示CD20-IgG1(+F)，■显示CD20-IgG1(-F)，△显示CD20-IgG3(+F)，▲显示CD20-IgG3(-F)，○显示1133(+F)，●显示1133(-F)。

图9显示了抗CD20人类IgG1抗体、抗CD20人类IgG3抗体、1133型抗CD20嵌合同种型抗体和3311型抗CD20嵌合同种型抗体对Daudi细胞的ADCC活性。横坐标显示抗体浓度，纵坐标显示每种抗体浓度下的ADCC活性。对于图中的○和●来说，每个图中对应的样品是不同的，图A显示了CD20-IgG1(+F)(○)和CD20-IgG1(-F)(●)，图B显示了CD20-IgG3(+F)(○)和CD20-IgG3(-F)(●)，图C显示了1133(+F)(○)和1133(-F)(●)，图D显示了3311(+F)(○)和3311(-F)(●)。

图10显示了在不存在抗原CD20的ELISA中，抗CD20人类IgG1抗体、抗CD20人类IgG3抗体和1133型抗CD20嵌合同种型抗体与可溶性人类FcγRIIa(缬氨酸类型)(A到C)或可溶性人类FcγRIIa(苯丙氨酸类型)(D到F)的结合活性。横坐标显示抗体浓度，纵坐标显示每种抗体浓度下的吸光度。针对可溶性人类FcγRIIa(缬氨酸类型)(A到C)或可溶性人类FcγRIIa(苯丙氨酸类型)(D到F)，图A和D显示了CD20-IgG1(-F)(●)和CD20-IgG1(+F)(○)的结合活性，图B和E显示了CD20-IgG3(-F)(●)和CD20-IgG3(+F)(○)的结合活性，图C和F显示了1133(-F)(●)和1133(+F)(○)的结合活性。

图11是示意图，显示了人类IgG1抗体、人类IgG3抗体、1133型嵌合同种型、1131型嵌合同种型和1113型嵌合同种型的结构域结构。

图12显示了质粒pKTX93/1131的构建步骤。

图13显示了质粒pKTX93/1113的构建步骤。

图14显示了纯化的抗CD20人类IgG1抗体、抗CD20人类IgG3抗体、1133型抗CD20嵌合同种型抗体、1131型抗CD20嵌合同种型抗体和1113型抗CD20嵌合同种型抗体的SDS-PAGE电泳图形。蛋白染色用考马斯亮蓝(CBB)进行。第1道对应于分子量标记物，第2道对应于CD20-IgG1(-F)，第3道对应于CD20-IgG(-F)，第4道对应于1133(-F)，第5道对应于1113(-F)，第6道对应于1131(-F)。

图15显示了抗CD20人类IgG1抗体、抗CD20人类IgG3抗体、1133型抗CD20嵌合同种型抗体、1131型抗CD20嵌合同种型抗体和1113型抗CD20嵌合同种型抗体对ST 486细胞(A)或Raji细胞(B)的CDC活性。横坐标显示抗体浓度，纵坐标显示每种抗体浓度下细胞毒性的比率。在图中，■显示CD20-IgG1(-F)，▲显示CD20-IgG3(-F)，●显示1133(-F)，×显示1113(-F)，◆显示1131(-F)。

图16显示了抗CD20人类IgG1抗体、抗CD20人类IgG3抗体、1133型抗CD20嵌合同种型抗体、1131型抗CD20嵌合同种型抗体和1113型抗CD20嵌合同种型抗体对Daudi细胞的ADCC活性。横坐标显示抗体浓度，纵坐标显示每种抗体浓度下细胞毒性的比率。在图中，■显示CD20-IgG1(-F)，▲显示CD20-IgG3(-F)，●显示1133(-F)，×显示1113(-F)，◆显示1131(-F)。

图17显示了通过ELISA分析测量的抗CD20人类IgG1抗体、抗CD20人类IgG3抗体、1133型抗CD20嵌合同种型抗体、1131型抗CD20嵌合同种型抗体和1113型抗CD20嵌合同种型抗体与蛋白A的结合活性的测量结果。在图中，■显示CD20-IgG1(-F)，▲显示CD20-IgG3(-F)，●显示1133(-F)，×显示1113(-F)，◆显示1131(-F)。

图18是示意图，显示了人类IgG1抗体和人类IgG3抗体的CH结构域的氨基酸序列的比较。每个氨基酸序列的位置是基于Kabat等的EU索引。在图中，*显示了在人类IgG1抗体和人类IgG3抗体之间氨基酸序列不同的位置。

图19显示了质粒pKTX93/1133(274-IgG1)、pKTX93/1133(276-IgG1)、pKTX93/1133(296-IgG1)、pKTX93/1133(300-IgG1)和pKTX93/1133(339-IgG1)的构建步骤。

图20显示了各种纯化的抗体的SDS-PAGE电泳图形。蛋白染色用考马斯亮蓝(CBB)进行。第1道对应于分子量标记物，第2道对应于CD20-IgG1(-F)，第3道对应于1133(-F)，第4道对应于1131(-F)，第5道对应于1113(-F)，第6道对应于1133(274-IgG1)(-F)，第7道对应于1133(276-IgG1)(-F)，第8道对应于1133(296-IgG1)(-F)，第9道对应于1133(300-IgG1)(-F)，第10道对应于1133(339-IgG1)(-F)。

图21显示了各种抗CD20抗体对Raii细胞的CDC活性。横坐标显示抗体浓度，纵坐标显示每种抗体浓度下细胞毒性的比率。在图中，■显示CD20-IgG1(-F)，●显示1133(-F)，▲显示1131(-F)，□显示1133(274-IgG1)(-F)，○显示1133(276-IgG1)(-F)，◇显示1133(296-IgG1)(-F)，×显示1133(300-IgG1)(-F)，△显示1133(339-IgG1)(-F)。

图22显示了质粒pKTX93/1131(296/300-IgG1)、pKTX93/1131(274/296/300-IgG1)、pKTX93/1131(274/276/296/300-IgG1)、pKTX93/1131(274/296/300/339-IgG1)和pKTX93/1131(276/296/300/339-IgG1)的构建步骤。

图23显示了各种纯化的抗体的SDS-PAGE电泳图形。蛋白染色用考马斯亮蓝(CBB)进行。第1道对应于分子量标记物，第2道对应于1131(296/300-IgG1)(-F)，第3道对应于1131(274/296/300-IgG1)(-F)，第4道对应于1131(274/276/296/300-IgG1)(-F)，第5道对应于1131(274/296/300/339-IgG1)(-F)，第6道对应于1131(276/296/300/339-IgG1)(-F)。

图24显示了各种抗CD20抗体对Raji细胞的CDC活性。横坐标显示抗体浓度，纵坐标显示每种抗体浓度下的CDC活性。在图中，■显示CD20-IgG1(-F)，□显示CD20-IgG3(-F)，▲显示1133(-F)，△显示1131(-F)，●显示1131(296/300-IgG1)(-F)，○显示1131(274/296/300-IgG1)(-F)，◆显示1131(274/276/296/300-IgG1)(-F)，◇显示1131(274/296/300/339-IgG1)(-F)，×显示1131(276/296/300/339-IgG1)(-F)。

图25显示了通过ELISA分析测量的各种抗CD20抗体与蛋白A的结合活性的测量结果。横坐标显示抗体浓度，纵坐标显示每种抗体浓度下与蛋白A的结合活性(吸光度)。在图中，●显示CD20-IgG1(-F)，○显示CD20-IgG3(-F)，▲显示1131(274/296/300/339-IgG1)(-F)，△显示1131(274/276/296/300-IgG1)(-F)，■显示1131(274/296/300-IgG1)(-F)，□显示1131(-F)，×显示1133(-F)。

图26显示了质粒pKTX93/Campath-1133的构建步骤。

图27显示了质粒pKTX93/Campath-IgG1的构建步骤。

图28显示了质粒pKTX93/Campath-1131的构建步骤。

图29显示了抗Campath人类IgG1抗体和1131型抗Campath嵌合同种型抗体对MEC-1细胞(A)、MEC-2细胞(B)或EHEB细胞(C)的CDC活性。横坐标显示抗体浓度，纵坐标显示每种抗体浓度下细胞毒性的比率。在图中，●显示Campath1H-1131(-F)，○显示Campath1H-IgG1(-F)。

执行本发明的最佳方式

下面将对本发明进行详细描述。

抗体分子也被称为免疫球蛋白(后文称为Ig)，人类抗体被分类成IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM同种型。在氨基酸序列中具有相对高同源性的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4被统称为IgG。

抗体分子由被称为重链(也称为H链)和轻链(也称为L链)的多肽构成。此外，H链从其N-末端开始由H链可变区(也称为VH)和H链恒定区(也称为CH)构成，L链从其N-末端开始由L链可变区(也称为VL)和L链恒定区(也称为CL)构成。CH进一步由结构域CH1结构域、铰链区结构域、CH2结构域和CH3结构域构成。结构域是指在抗体分子中构成每个多肽的功能性组成单位。此外，CH2结构域和CH3结构域被合称为Fc区。

本发明中的CH1结构域、铰链区结构域、CH2结构域、CH3结构域和Fc区，按照在Kabat等《免疫学重要的蛋白序列》(第五版)[Sequence of Proteins of Immunological Interest，5th Edition(1991)]中EU索引所标明的从N-末端开始的氨基酸残基的位置来定义。具体来说，CH1被定义为EU索引标明的118到215位氨基酸序列，铰链区被定义为EU索引标明的216到230位氨基酸序列，CH2被定义为EU索引标明的231到340位氨基酸序列，CH3被定义为EU索引标明的341到447位氨基酸序列(下面显示的氨基酸残基的编号是基于EU索引)。

本发明的重组抗体组合物包括了这样的重组抗体组合物，它是人类IgG1抗体，含有CH2结构域，该结构域中由Kabat等中的EU索引指示的276位和339位氨基酸被其它氨基酸替代，并且与含有氨基酸被替代前的CH2结构域的抗体相比，具有进一步改进的补体依赖性细胞毒活性。

其它氨基酸可以是任何氨基酸，只要它们是与含有氨基酸被取代前的CH2结构域的抗体相比，增加了CDC活性的氨基酸就行。优选，276位的氨基酸是选自天冬氨酸、亮氨酸、丝氨酸或赖氨酸的氨基酸，339位的氨基酸是选自天冬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸和苏氨酸的氨基酸。

更优选，其它氨基酸是对应于IgG3抗体的CH2结构域的氨基酸。

其它氨基酸最优选赖氨酸作为276位氨基酸，苏氨酸作为339位氨基酸。

此外，本发明的重组抗体组合物包括这样的重组抗体组合物，其中在Fc区的CH3结构域中包含的多肽，是含有的氨基酸对应于EU索引指示的人类IgG3抗体中同样位置的多肽。

具体的例子包括这样的重组抗体组合物，其中含有Fc区中CH3结构域的多肽是选自下列(a)到(h)的多肽：

(a)在EU索引中，341到447位源于人类IgG1；

(b)在EU索引中，341到356位源于人类IgG3，357到447位源于人类IgG1；

(c)在EU索引中，341到358位源于人类IgG3，359到447位源于人类IgG1；

(d)在EU索引中，341到384位源于人类IgG3，385到447位源于人类IgG1；

(e)在EU索引中，341到392位源于人类IgG3，393到447位源于人类IgG1；

(f)在EU索引中，341到397位源于人类IgG3，398到447位源于人类IgG1；

(g)在EU索引中，341到422位源于人类IgG3，423到447位源于人类IgG1；

(h)在EU索引中，341到434位和436到447位源于人类IgG3，435位源于人类IgG1。

本发明重组抗体组合物中的CL区的氨基酸序列可以是人类抗体的氨基酸序列或非人类动物的氨基酸序列，优选是人类抗体氨基酸序列中的Cκ或Cλ。

在本发明中，嵌合同种型是指重链恒定区含有的两种或多种人类同种型的氨基酸序列中，人类同种型重链恒定区的氨基酸序列的一部分换成不同的人类同种型中相应部分的氨基酸序列。后文中，嵌合同种型重组抗体是指其中重链恒定区是嵌合同种型的重组抗体。

本发明的重组抗体组合物也可以是任何重组抗体组合物，只要它是具有Fc和与靶分子有结合活性的抗体、或与靶分子有结合活性的具有Fc的融合蛋白即可。

具有与靶分子的结合活性的抗体包括人类嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体。

具有Fc并与靶分子有结合活性的融合蛋白，包括与靶分子有结合活性的分子与Fc的融合蛋白、与靶分子有结合活性的抗体与Fc的融合蛋白、与靶分子有结合活性的抗体片段与Fc的融合蛋白，等等。

Fc融合蛋白的具体例子包括其中受体或配体与Fc区融合的Fc融合蛋白、其中多个Fc区与抗体的Fc区融合的Fc融合蛋白，等等。

与靶分子有结合活性的抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、scFv、双抗体、dsFv、含有CDR的肽，等等。

Fab是分子量为大约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段，其中在用蛋白酶——木瓜蛋白酶(切割H链第224位的氨基酸残基)处理IgG抗体而获得的片段中，H链N-末端侧的大约一半与整个L链通过二硫键(S-S键)被连接在一起。

在用蛋白酶——胃蛋白酶(切割H链第234位的氨基酸残基)处理IgG而获得的片段中，F(ab′)₂是具有抗原结合活性的抗体片段，分子量为大约100,000，略大于Fab通过铰链区中的S-S键连接起来的片段。

Fab′是分子量为大约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段，它通过切开F(ab′)₂的铰链区中的S-S键而获得。

scFv是VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其中使用具有12个以上残基的适合的肽接头(P)将一条链的VH和一条链的VL连接起来，它是具有抗原结合活性的抗体片段。

双抗体是一种抗体片段，其中具有相同或不同抗原结合特异性的scFvs形成二聚体，并具有针对同样抗原的二价抗原结合活性，或针对不同抗原的两种特异性抗原结合活性。

dsFv是通过将其中每个VH和VL的一个氨基酸残基用半胱氨酸残基替代的多肽，通过半胱氨酸残基之间的S-S键连接起来而获得的。

含有CDR的肽是通过包含VH或VL的CDRs的至少一个区或多个而构建成的。含有多个CDRs的肽可以通过直接连接或通过适当的肽接头连接来产生。

人类嵌合抗体是含有源于人类之外的动物(非人类动物)的抗体的VH和VL、以及人类抗体的CH和CL的抗体。非人类动物可以是任何动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠或兔，只要可以从其制备杂交瘤即可。

杂交瘤是产生具有所需免疫特异性的单克隆抗体的细胞，其是通过将用抗原免疫非人类动物获得的B细胞与源于小鼠等的骨髓瘤细胞进行细胞融合而获得的。因此，构成通过杂交瘤生产的抗体的可变区，含有非人类动物抗体的氨基酸序列。

人类嵌合抗体的生产可以通过从源于非人类动物的产生单克隆抗体的杂交瘤获得编码VH和VL的cDNAs，将它们插入到含有编码人类抗体的CH和CL的DNAs的用于动物细胞的表达载体中，从而构建人类嵌合抗体表达载体，然后将载体导入动物细胞以表达抗体来进行。

对于人类嵌合抗体的CH来说，可以使用任何CH，只要它属于人类免疫球蛋白(hIg)即可，其中属于hIgG类型的是优选的，并可以使用属于hIgG类别的任何一种亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)和γ4(IgG4)。对于人类嵌合抗体的CL来说，可以使用任何CL，只要它属于hIg类型即可，并可以使用属于κ类(Cκ)或λ类(Cλ)的CL。

人源化抗体是其中非人类动物抗体的VH和VL的CDRs的氨基酸序列被嫁接到人类抗体的VH和VL的适当位置中的抗体。VH和VL的CDRs之外的区被称为框架区(在后文中称为FR)。

人源化抗体的生产可以通过构建非人类动物的VH中CDRs的氨基酸序列和含有人类抗体的VH中FR的氨基酸序列的VH的氨基酸序列的编码cDNA，以及非人类动物的VL中CDRs的氨基酸序列和含有人类抗体的VL中FR的氨基酸序列的VL的氨基酸序列的编码cDNA；将它们插入到含有编码人类抗体的CH和CL的DNAs的用于动物细胞的表达载体中，从而构建人源化抗体表达载体；然后将表达载体导入到动物细胞中以表达人源化抗体来进行。

对于人源化抗体的CH来说，可以使用任何CH，只要它属于hIg即可，其中hIgG的CH的是优选的，并可以使用属于hIgG类别的任何一种亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)和γ4(IgG4)。对于人类CDR嫁接的抗体的CL来说，可以使用任何CL，只要它属于hIg类型即可，可以使用属于Cκ或Cλ的CL。

人类抗体是在人体中本来天然存在的抗体，但是它也包括从人类抗体噬菌体文库或产生人类抗体的转基因动物获得的抗体，这是根据遗传工程、细胞工程和发育工程技术的最新进展制备的。

人体中存在的抗体可以如下制备：例如分离人类外周血淋巴细胞，通过用EB病毒等感染而使它永生化，然后将它克隆以获得能够产生抗体的淋巴细胞，将这样获得的淋巴细胞进行培养，并从培养物中纯化抗体。

人类抗体噬菌体文库是其中通过将编码从人类B细胞制备的抗体的基因插入到噬菌体基因中，使抗体片段例如Fab和scFv表达在噬菌体表面上的文库。表达具有所需抗原结合活性的抗体片段的噬菌体，可以利用它与固定了抗原的基质的结合活性作为指标，从文库中回收。抗体片段可以通过遗传工程技术进一步转变成含有两个完整的H链和两个完整的L链的人类抗体分子。

产生人类抗体的转基因动物是其中人类抗体基因被整合到细胞中的动物。具体来说，产生人类抗体的转基因动物可以如下制备：将编码人类抗体的基因导入到小鼠ES细胞中，将ES细胞嫁接到其它小鼠的早期胚胎中，然后使其发育。人类抗体是从产生人类抗体的转基因非人类动物制备的，这是通过在非人类哺乳动物中通常进行的杂交瘤制备方法来获得产生人类抗体的杂交瘤，对获得的杂交瘤进行培养，在培养物中形成和积累人类抗体而成。

本发明的重组抗体组合物中CL的氨基酸序列可以是人类抗体的氨基酸序列或来自非人类动物的氨基酸序列，但是它优选是人类抗体的Cκ或Cλ的氨基酸序列。

在本发明的重组抗体组合物中，VH和VL的氨基酸序列可以是人类抗体中VH和VL的氨基酸序列、非人类动物抗体中VH和VL的氨基酸序列、或其中非人类动物的CDRs被嫁接到人类抗体的框架中的人源化抗体的氨基酸序列中的任何一种。具体的例子包括通过杂交瘤产生的非人类动物抗体的VH和VL的氨基酸序列、人源化抗体的VH和VL的氨基酸序列、人类抗体的VH和VL的氨基酸序列，等等。

本发明的重组抗体组合物包括具有任何特异性的抗体，优选是识别肿瘤相关抗原的抗体、识别过敏或炎症相关抗原的抗体、识别与心血管疾病相关的抗原的抗体、识别与自身免疫疾病相关的抗原的抗体、或识别与病毒或细菌感染相关的抗原的抗体，更优选是识别肿瘤相关抗原的抗体。

肿瘤相关抗原包括CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD9、CD10、CD13、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD30、CD32、CD33、CD38、CD40、CD40配体(CD40L)、CD44、CD45、CD46、CD47、CD52、CD54、CD55、CD55、CD59、CD63、CD64、CD66b、CD69、CD70、CD74、CD80、CD89、CD95、CD105、CD134、CD137、CD138、CD147、CD158、CD160、CD162、CD164、CD200、CD227、肾上腺髓质素、血管生成素相关蛋白4(ARP4)、aurora、B7-H1、B7-DC、integlin、骨髓基质抗原2(BST2)、CA125、CA19.9、钙粘着蛋白、cc-趋化因子受体(CCR)4、CCR7、癌胚抗原(CEA)、富含半胱氨酸的成纤维细胞生长因子受体-1(CFR-1)、c-Met、c-Myc、胶原蛋白、CTA、结缔组织生长因子(CTGF)、CTLA-4、细胞角蛋白-18、DF3、E-catherin、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFRvIII、EGFR2(HER2)、EGFR3(HER3)、EGFR4(HER4)、内皮糖蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、内皮蛋白C受体(EPCR)、肝配蛋白、肝配蛋白受体(Eph)、EphA2、endotheliase-2(ET2)、FAM3D、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fc受体类似物1(FcRH1)、铁蛋白、成纤维细胞生长因子-8(FGF-8)、FGF8受体、碱性FGF(bFGF)、bFGF受体、FGF受体(FGFR)3、FGFR4、FLT1、FLT3、叶酸受体、卷曲蛋白10(FZD10)、卷曲蛋白(frizzled)受体4(FZD-4)、G250、G-CSF受体、神经节苷脂(例如GD2、GD3、GM2和GM3)、globo H、gp75、gp88、GPR-9-6、乙酰肝素酶I、肝细胞生长因子(HGF)、HGF受体、HLA抗原(例如HLA-DR)、HM1.24、人类乳脂球(HMFG)、hRS7、热休克蛋白90(hsp90)、独特型表位、胰岛素样生长因子(IGF)、IGF受体(IGFR)、白细胞介素(例如IL-6和IL-15)、白介素受体(例如IL-6R和IL-15R)、整合素、免疫受体易位相关因子-4(IRTA-4)、激肽释放酶1、KDR、KIR2DL1、KIR2DL2/3、KS1/4、lamp-1、lamp-2、层粘连蛋白-5、Lewis y、唾液酸化的Lewis x、淋巴毒素-β受体(LTBR)、LUNX、黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、间皮素、MICA、苗勒抑制物质II型受体(MISIIR)、粘蛋白、神经细胞粘附分子(NCAM)、Necl-5、Notchl、骨桥蛋白、血小板衍生的生长因子(PDGF)、PDGF受体、血小板因子-4(PF-4)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异抗原(PSA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、甲状旁腺激素相关蛋白/肽(PTHrP)、NF-κB配体的受体激活剂(RANKL)、透明质酸介导活动性的受体(RHAMM)、ROBO1、SART3、semaphorin 4B(SEMA4B)、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)、SM5-1、鞘氨醇-1-磷酸、肿瘤相关的糖蛋白-72(TAG-72)、转铁蛋白受体(TfR)、TGF-β、Thy-1、Tie-1、Tie2受体、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域1(TIM-1)、人类组织因子(hTF)、Tn抗原、肿瘤坏死因子(TNF)、Thomsen-Friedenreich抗原(TF抗原)、TNF受体、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、TRAIL受体(例如DR4和DR5)、trkC、TROP-2、TWEAK受体Fn14、IV型胶原酶、尿激酶受体、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体(VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3)、波形蛋白、VLA-4，等等。

识别肿瘤相关抗原的抗体包括抗GD2抗体[Anticancer Res.，13，331(1993)]、抗GD3抗体[Cancer Immunol.Immunother.，36，260(1993)]、抗GM2抗体[Cancer Res.，54，1511(1994)]、抗HER2抗体[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，4285(1992)]、抗CD52抗体[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，4285(1992)]、抗MAGE抗体[British J.Cancer，83，493(2000)]、抗HM1.24抗体[Molecular Immunol.，36，387(1999)]、抗甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)抗体[Cancer，88，2909(2000)]、抗碱性成纤维细胞生长因子抗体、抗成纤维细胞生长因子8抗体[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，9911(1989)]、抗碱性成纤维细胞生长因子受体抗体、抗成纤维细胞生长因子8受体抗体[J.Biol.Chem.，265，16455(1990)]、抗胰岛素样生长因子抗体[J.Neurosci.Res.，40，647(1995)]、抗胰岛素样生长因子受体抗体[J.Neurosci.Res.，40，647(1995)]、抗PMSA抗体[J.Urology，160，2396(1998)]、抗血管内皮细胞生长因子抗体[Cancer Res.，57，4593(1997)]、抗血管内皮细胞生长因子受体抗体[Oncogene，19，2138(2000)]、抗CD20抗体[Curr.Opin.Oncol.，10，548(1998)]、抗Her2抗体、抗CD10抗体，等等。

识别过敏或炎症相关抗原的抗体包括抗白介素6抗体[Immunol.Rev.，127，5(1992)]、抗白介素6受体抗体[Molecular Immunol.，31，371(1994)]、抗白介素5抗体[Immunol.Rev.，127，5(1992)]、抗白介素5受体抗体、抗白介素4抗体[Cytokine，3，562(1991)]、抗白介素4受体抗体[J.Immunol.Meth.，217，41(1998)]、抗肿瘤坏死因子抗体[Hybridoma，13，183(1994)]、抗肿瘤坏死因子受体抗体[Molecular Pharmacol.，58，237(2000)]、抗CCR4抗体[Nature，400，776(1999)]、抗趋化因子抗体[Peri等，J.Immuno.Meth.，174，249-257(1994)]、抗趋化因子受体抗体[J.Exp.Med.，186，1373(1997)]，等等。识别心血管疾病相关抗原的抗体包括抗GpIIb/IIIa抗体[J.Immunol.，152，2968(1994)]、抗血小板衍生生长因子抗体[Science，253，1129(1991)]、抗血小板衍生生长因子受体抗体[J.Biol.Chem.，272，17400(1997)]、抗凝血因子抗体[Circulation，101，1158(2000)]，等等。

识别病毒或细菌感染相关抗原的抗体包括抗gp120抗体[Structure，8，385(2000)]、抗CD4抗体[J.Rheumatology，25，2065(1998)]、抗CCR5抗体、抗vero细胞毒素抗体[J.Clin.Microbiol.，37，396(1999)]，等等。

此外，本发明涉及与蛋白A具有结合活性的重组抗体组合物。

与蛋白A具有结合活性是指重组抗体组合物可以通过使用蛋白A进行纯化。

与蛋白A的结合活性可以通过ELISA、表面等离子体共振等进行测量。具体来说，使抗体组合物与在板上作为固相的蛋白A反应，然后使其进一步与识别各种标记抗体的抗体进行反应，并通过测定与蛋白A结合的抗体组合物来测量结合活性。

蛋白A结合活性与IgG1抗体相似是指，当测量本发明的抗体或IgG1抗体与蛋白A的结合活性或亲和性时，结合活性或具有亲和性的活性与IgG1抗体基本上相似。

同样，使抗体组合物与结合在载体例如琼脂糖上的蛋白A在高pH条件例如大约5到8的pH下进行反应，接着清洗，然后可以通过测定在低pH条件例如大约2到5的pH下洗脱的抗体组合物来测量结合活性。

抗体分子具有Fc，N-糖苷连接的糖链结合在其区上。因此，每个抗体分子结合两个糖链。

N-糖苷连接的糖链包括复合型糖链，其中核心结构的非还原末端侧含有一个或多个平行的半乳糖-N-乙酰葡萄糖胺(后文称为“Gal-GlcNAc”)侧链，Gal-GlcNAc的非还原末端侧还含有唾液酸、等分的N-乙酰葡萄糖胺等结构。

在本发明中，复合型N-糖苷连接的糖链由下式表示：

在本发明的重组抗体组合物中，含有的抗体分子在Fc中具有N-糖苷连接的糖链的重组抗体组合物，可以含有具有相同糖链结构的抗体分子或具有不同糖链结构的抗体分子，只要它具有上述糖链结构即可。也就是说，本发明的重组抗体组合物是指含有具有相同或不同糖链结构的重组抗体分子的组合物。

此外，在本发明的重组抗体中，含有的抗体分子在Fc中具有复合型N-糖苷连接的糖链的抗体组合物，其中在组合物中包含的与Fc结合的全部复合型N-糖苷连接的糖链中，岩藻糖没有与糖链还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺结合的糖链的比率，除了CDC活性之外，还具有高ADCC活性。

对于其中岩藻糖没有与抗体还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺结合的糖链比率来说，可以包括具有任何比率的抗体，只要ADCC活性以及CDC活性增加即可。比率优选为20％以上，更优选为51％到100％，更加优选为80％到100％，特别优选为90％到99％，最优选为100％。

在本发明中，其中没有结合岩藻糖的糖链在还原末端可以具有任何糖链结构，只要岩藻糖没有结合到上式的还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺上即可。

在本发明中，岩藻糖没有结合到糖链还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺上的情况，是指基本上没有结合岩藻糖。其中基本上没有结合岩藻糖的抗体组合物，特别是指其中基本检测不到岩藻糖的抗体组合物，即，当对糖链进行下面第4项描述的分析时，岩藻糖含量低于检测极限。其中在所有糖链的还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺上没有结合岩藻糖的重组抗体组合物，具有最高的ADCC活性。

所具有糖链中的岩藻糖没有与组合物中包含的糖链还原末端的N-乙酰葡萄糖胺结合的抗体分子的比率，所述组合物含有在Fc中具有复合型N-糖苷连接的糖链的抗体分子，可以通过使用已知的方法例如肼解作用或酶法消化[《生物化学实验方法23-研究糖蛋白糖链的方法》(日本科学学会出版社)，Biochemical Experimentation Methods23-Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain(Japan ScientificSocieties Press)，Reiko Takahashi主编(1989)]，从抗体分子上释放糖链，对释放的糖链进行荧光标记或放射性同位素标记，然后通过层析分离标记的糖链来进行测定。释放的糖链也可以通过用HPAED-PAD方法[J.Liq.Chromatogr.，6，1577(1983)]，对它进行分析来测定。

产生本发明的重组抗体组合物的转化体，可以通过将其中插入了编码抗体分子可变区和恒定区的DNAs的重组抗体组合物表达载体导入到动物细胞中来获得。

重组抗体组合物表达载体的构建如下所述。

将每种上述的编码CH和CL的DNAs导入到用于表达重组抗体的载体中，以产生用于动物细胞的重组抗体组合物表达载体。

用于表达重组抗体的载体包括pAGE107(日本公布的未审查专利申请No.22979/91；Miyaji H.等，Cytotechnology，3，133-140(1990))、pAGE103(Mizukami T.和Itoh S.，J.Biochem.，101，1307-1310(1987))、pHSG274(Brady G.等，Gene，27，223-232(1984))、pKCR(O′Hare K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，78，1527-1531(1981))、pSG1βd2-4(Miyaji H.等，Cytotechnology，4，173-180(1990))，等等。用于表达重组抗体的载体的启动子和增强子包括SV40早期启动子和增强子(Mizukami T.和Itoh S.，J.Biochem.，101，1307-1310(1987))、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子(Kuwana Y.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，149，960-968(1987))、免疫球蛋白H链启动子(Mason J.O.等，Cell，41，479-487(1985))和增强子(Gillies S.D.等，Cell，33，717-728(1983))，等等。

用于表达重组抗体组合物的载体可以是其中编码H链和L链的基因存在于分开的载体上的类型，或是这两个基因存在于相同载体上的类型(串联型)。就构建重组抗体组合物表达载体的容易性、导入动物细胞的容易性、以及抗体的H和L链在动物细胞中表达量之间的平衡来说，串联型的表达重组抗体组合物的载体更加优选(Shitara K.等，J.Immunol.Methods，167，271-278(1994))。串联型的表达重组抗体组合物的载体包括pKANTEX93(WO97/10354)、pEE18(Bentley K.J.等，Hybridoma，17，559-567(1998))，等等。

将编码针对各种抗原的抗体的VH和VL的cDNAs克隆到用于表达重组抗体组合物的构建载体中编码CH和CL的DNAs的上游，从而构建重组抗体组合物表达载体。

将表达载体导入宿主细胞的方法包括电穿孔(日本公布的未经审查的专利申请No.257891-90；Miyaji H.等，Cytotechnology，3，133-140(1990))，等等。

产生本发明的重组抗体组合物的宿主细胞可以是在生产重组蛋白中通常使用的任何宿主细胞，例如动物细胞、植物细胞或微生物。

产生本发明的重组抗体组合物的宿主细胞包括源自中华仓鼠卵巢组织的CHO细胞、大鼠骨髓瘤细胞系YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞、小鼠骨髓瘤细胞系NS0细胞、小鼠骨髓瘤SP2/0-Ag14细胞、源自叙利亚仓鼠肾脏组织的BHK细胞、人类白血病细胞系Namalwa细胞、使用骨髓瘤和任何B细胞产生的杂交瘤细胞、通过用抗原免疫使用胚胎干细胞或受精卵细胞产生的转基因非人类动物而获得的B细胞和任何骨髓瘤细胞产生的杂交瘤细胞、上述的骨髓瘤细胞与抗原免疫使用胚胎干细胞或受精卵细胞等等产生的转基因非人类动物进行免疫而获得的B细胞产生的杂交瘤细胞。

能够表达具有高度ADCC活性以及CDC活性的重组抗体组合物的宿主细胞，包括对外源凝集素具有抗性的宿主细胞，所述外源凝集素能够识别的糖链结构中，岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，例如能够产生的抗体组合物所含有的抗体分子在Fc区中具有复合型N-糖苷连接的糖链的宿主细胞，其中在组合物中包含的与Fc区结合的全部复合型N-糖苷连接的糖链中，岩藻糖没有与糖链还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺结合的糖链比率是20％以上。例子包括其中至少一种下面描述的蛋白的活性被降低或缺失的细胞，等等：

(a)与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶；

(b)与糖链的修饰有关的酶，所述糖链修饰中，岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合；

(c)与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖运输到高尔基体有关的蛋白。

上述宿主细胞优选宿主细胞中编码α1，6-岩藻糖基转移酶的基因被敲除的宿主细胞(WO02/31140，WO03/85107)。

与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶可以是任何酶，只要它是与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶即可，GDP-岩藻糖是向糖链供应岩藻糖的来源。与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶包括对细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有影响的酶，等等。

细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖由从头合成途径或补救合成途径提供。因此，所有与合成途径有关的酶都包含在与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶中。

与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的从头合成途径有关的酶包括GDP-甘露糖4，6-脱水酶(在后文中称为“GMD”)、GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3，5-差向异构酶、4，6-还原酶(在后文中称为“Fx”)，等等。

与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的补救合成途径有关的酶包括GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶(在后文中称为“GFPP”)、岩藻糖激酶，等等。

至于对细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有影响的酶，还包括对上述的与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成途径有关的酶的活性有影响的酶，以及对作为酶底物的物质的结构有影响的酶。

GDP-甘露糖4，6-脱水酶包括：

(a)含有SEQ ID NO：18所表示的核苷酸序列的DNA；

(b)与由SEQ ID NO：18所表示的核苷酸序列组成的DNA在严紧条件下杂交、并编码具有GDP-甘露糖-4，6-脱水酶活性的蛋白的DNA；

等等。

GDP-甘露糖4，6-脱水酶包括：

(a)含有SEQ ID NO：19所表示的氨基酸序列的蛋白；

(b)由在SEQ ID NO：19所表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖-4，6-脱水酶活性的蛋白；

(c)由与SEQ ID NO：19所表示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列组成、并具有GDP-甘露糖-4，6-脱水酶活性的蛋白；

等等。

GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶包括：

(a)含有SEQ ID NO：20所表示的核苷酸序列的DNA；

(b)与由SEQ ID NO：20所表示的核苷酸序列组成的DNA在严紧条件下杂交、并编码具有GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶活性的蛋白的DNA；

等等。

GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶包括：

(a)含有SEQ ID NO：21所表示的氨基酸序列的蛋白；

(b)由在SEQ ID NO：21所表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列组成、并具有GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶活性的蛋白；

(c)由与SEQ ID NO：21所表示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列组成、并具有GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶活性的蛋白；

等等。

与糖链的修饰有关的酶包括任何酶，所述糖链修饰中，岩藻糖的1-位在复合型N-糖苷连接的糖链中通过α-键与还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位连接，只要该酶是与岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的反应有关的酶即可。与岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的反应有关的酶，包括对岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的反应有影响的酶。例子包括α1，6-岩藻糖基转移酶、α-L-岩藻糖苷酶，等等。

此外，与岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的反应有关的酶，包括对岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的反应有关的酶的活性有影响的酶，以及对作为酶底物的物质的结构有影响的酶。

在本发明中，α1，6-岩藻糖基转移酶是由下面(a)、(b)、(c)或(d)的DNA编码的蛋白：

(a)含有SEQ ID NO：22所表示的核苷酸序列的DNA；

(b)含有SEQ ID NO：23所表示的核苷酸序列的DNA；

(c)与由SEQ ID NO：22所表示的核苷酸序列组成的DNA在严紧条件下杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA；

(d)与由SEQ ID NO：23所表示的核苷酸序列组成的DNA在严紧条件下杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA；或

(e)含有SEQ ID NO：24所表示的氨基酸序列的蛋白；

(f)含有SEQ ID NO：25所表示的氨基酸序列的蛋白；

(g)由在SEQ ID NO：24所表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白；

(h)由在SEQ ID NO：25所表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白；

(i)由与SEQ ID NO：24所表示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白；

(j)由与SEQ ID NO：25所表示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列组成、并具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白；

等等。

与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的运输有关的蛋白可以是任何蛋白，只要它是与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的运输有关的蛋白、或对细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的运输反应有影响的蛋白即可。与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的运输有关的蛋白包括GDP-岩藻糖转运蛋白等。

此外，对细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的运输反应有影响的蛋白，包括对上述与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的运输有关的蛋白的活性有影响的蛋白，或对其表达有影响的蛋白。

编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶的氨基酸序列的DNA，包括含有SEQ ID NO：18或20所表示的核苷酸序列的DNA；与由SEQ ID NO：18或20所表示的核苷酸序列组成的DNA在严紧条件下杂交、并编码具有与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶活性蛋白的DNA；等等。

编码α1，6-岩藻糖基转移酶的氨基酸序列的DNA，包括含有SEQ IDNO：22或23所表示的核苷酸序列的DNA；与由SEQ ID NO：22或23所表示的核苷酸序列组成的DNA在严紧条件下杂交、并编码具有α1，6-岩藻糖基转移酶活性的蛋白的DNA；等等。

在本发明中，在严紧条件下杂交的DNA，是指使用例如由上述SEQID NOs任何一个所表示的核苷酸序列组成的DNA或其片段作为探针，通过菌落杂交、噬斑杂交、Southern杂交等获得的DNA。这样的DNA的具体例子是可以如下鉴定到的DNA：使用其上固定有源于菌落或噬斑的DNA的滤膜，在0.7到1.0M氯化钠的存在下在65℃进行杂交，然后用0.1到2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液：150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠)在65℃清洗滤膜。杂交可以按照在《分子克隆实验指南》(第二版)(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989))(在后文中称为《分子克隆第二版》″Molecular Cloning，Second Edition″)、《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(1987-1997))(在后文中称为《分子生物学现代方法》″Current Protocolsin Molecular Biology″)、《DNA克隆1：核心技术，实用方法》(第二版)(DNA Cloning 1.Core Techniques，A Practical Approach，SecondEdition，Oxford University(1995))等中描述的方法来进行。具体来说，能够在严紧条件下杂交的DNA包括与上述SEQ ID NOs任何一个所表示的核苷酸序列具有至少60％或以上同源性、优选70％或以上同源性、更优选80％或以上同源性、更加优选90％或以上同源性、特别优选95％或以上同源性、最优选98％或以上同源性的DNA。

在本发明中，由在上述SEQ ID NOs任何一个所表示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列组成、并具有上述活性的蛋白，可以通过例如位点定向诱变，在具有上述SEQ ID NOs任何一个所表示的氨基酸序列的蛋白的编码DNA中引入位点定向突变来获得，位点定向诱变描述在《分子克隆第二版》(Molecular Cloning，Second Edition)、《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology(1987-1997))、Nucleic AcidsResearch，10，6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、Nucleic Acids Research，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci USA，82，488(1985)等中。被缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸残基的数量是一个或多个，没有具体的限制，但是在通过已知的方法例如上述的位点定向诱变可能发生的缺失、取代、插入和/或添加的范围之内。适合的数量是1到几十个，优选为1到20个，更优选为1到10个，更加优选为1到5个。

此外，在本发明中，为了使蛋白具有上述的活性，当使用分析软件例如BLAST [J.Mol.Biol.，215，403(1990)]或FASTA[Methods inEnzymology，183，63(1990)]进行计算时，它优选与上述SEQ ID NOs任何一个所表示的氨基酸序列具有至少80％或以上的同源性、优选85％或以上的同源性、更优选90％或以上的同源性、更加优选95％或以上的同源性、特别优选97％或以上的同源性、最优选99％或以上的同源性。

用于获得其中上述酶活性被降低或缺失的细胞的方法可以是任何方法，只要它是降低或缺失目标酶活性的方法即可。例子包括：

(a)靶向编码酶的基因的基因破坏；

(b)导入编码酶的基因的显性失活突变体；

(c)在酶中引入突变；

(d)抑制编码酶的基因的转录或翻译；

(e)选择对外源凝集素具有抗性的细胞系，该外源凝集素识别岩藻糖的1-位通过α-键与N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的糖链结构；等等。

至于识别岩藻糖的1-位通过α-键与N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的糖链结构的外源凝集素来说，可以使用任何能够识别糖链结构的外源凝集素。具体的例子包括小扁豆外源凝集素LCA(源于扁豆(Lens culinaris)的小扁豆凝集素)、豌豆外源凝集素PSA(源于豌豆(Pisum sativum)的豌豆外源凝集素)、蚕豆外源凝集素VFA(源于蚕豆(Vicia faba)的凝集素)、橙黄网孢盘菌(Aleuria aurantia)外源凝集素AAL(源于橙黄网孢盘菌的外源凝集素)，等等。

“对外源凝集素具有抗性的细胞”是指在存在有效浓度的外源凝集素的情况下，生长不受抑制的细胞。“有效浓度”是比不允许基因组修饰前的细胞(在后文中也称为亲本细胞系)正常生长的浓度更高的浓度，优选等于不允许基因组修饰前的细胞正常生长的浓度，更优选为不允许基因组基因修饰前的细胞正常生长的浓度的2-5倍、更优选为10倍、最优选为20倍以上。

不抑制生长的外源凝集素的有效浓度可以根据每个细胞系适当确定。它通常为10μg/ml到10mg/ml，优选为0.5mg/ml到2.0mg/ml。

下面，将对用于生产本发明的重组抗体组合物的方法进行详细描述。

1.生产重组抗体组合物的方法

本发明的重组抗体组合物可以通过例如将它在宿主细胞中进行表达来获得，使用的方法描述在《分子克隆第二版》(Molecular Cloning，Second Edition)、《分子生物学现代方法》(Current Protocols inMolecular Biology)、《抗体实验指南》(Antibodies，A Laboratorymanual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))(在下文中称为《抗体》Antibodies)、《单克隆抗体：原理和实践》(第三版)(MonoclonalAntibodies：principles和practice，Third Edition，Acad.Press(1993))(在后文中称为《单克隆抗体》Monoclonal Antibodies)、《抗体工程，实用方法》(Antibody Engineering，A Practical Approach，IRL Press atOxford University Press，1996)(在后文中称为《抗体工程》AntibodyEngineering)等中，方式如下。

(1)本发明的重组抗体组合物表达载体的构建

本发明的重组抗体组合物表达载体是用于动物细胞的表达载体，其中引入了包含在本发明的重组抗体组合物中的抗体分子的H链和L链恒定区的编码基因。用于表达重组抗体组合物的载体，可以通过将包含在重组抗体组合物中的抗体分子的H链和L链恒定区的每种编码基因克隆到用于动物细胞表达的载体中来进行构建。

包含在本发明重组抗体组合物中的抗体分子的H链恒定区编码基因可以通过克隆IgG1抗体的H链恒定区编码基因，然后将编码所需氨基酸序列的基因片段进行连接来产生。也可以通过使用合成的DNAs来合成总DNA，合成也可以使用PCR来进行(《分子克隆第二版》，Molecular Cloning，Second Edition)。此外，可以通过这些技术的组合来生产。

用于动物细胞的表达载体可以是任何载体，只要上述编码抗体分子的恒定区的基因可以被导入并表达即可。例子包括pKANTEX93[Mol.Immunol.，37，1035(2000)]、pAGE107[Cytotechnology，3，133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.，101，1307(1987)]、pHSG274[Gene，27，223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，78，1527(1981)]、pSG1βd2-4[Cytotechnology，4，173(1990)]，等等。用于动物细胞表达载体的启动子和增强子包括SV40早期启动子和增强子[J.Biochem.，101，1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒的LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.，149，960(1987)]、免疫球蛋白H链启动子[Cell，41，479(1985)]和增强子[Cell，33，717(1983)]，等等。

用于表达本发明的重组抗体组合物的载体可以是其中编码H链和L链的基因存在于分开的载体上的类型，或是这两种基因存在于相同载体上的类型(在后文中称为串联类型)。就构建本发明的重组抗体组合物表达载体的容易性、导入动物细胞的容易性、以及抗体的H链和L链在动物细胞中的表达量之间的平衡来说，串联类型的用于表达人源化抗体的载体更加优选(J.Immunol.Methods，167，271(1994))。

所构建的本发明的重组抗体组合物表达载体可用于在动物细胞中表达人类嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体。

(2)获得编码非人类动物抗体的V区的cDNA

以下面的方式，可以获得编码非人类动物抗体例如小鼠抗体的H链可变区(在后文中称为“VH”)和L链可变区(在后文中称为“VL”)的cDNAs。

通过使用从产生任何抗体的杂交瘤细胞提取的mRNA作为探针，合成了cDNA。将合成的cDNA克隆到载体例如噬菌体或质粒中，以获得cDNA文库。使用编码已知的小鼠抗体的C区和V区的cDNA作为探针，从文库中分离了每个含有编码VH的cDNA的重组噬菌体或重组质粒，和每个含有编码L链V区的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。测定重组噬菌体或重组质粒上目标小鼠抗体的VH和VL的全长核苷酸序列，并从核苷酸序列推导出VH和VL的全长氨基酸序列。

产生任何非人类动物来源的抗体的杂交瘤细胞，可以通过用与抗体结合的抗原免疫非人类动物，按照已知的方法[《分子克隆第二版》Molecular Cloning，Second Edition；《分子生物学现代方法》CurrentProtocols in Molecular Biology；《抗体实验指南》Antibodies，ALaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)(在后文中称为《抗体》Antibodies)；《单克隆抗体：原理与实践》(第三版)Monoclonal Antibodies：principles和practice，Third Edition，Acad.Press(1993)(在后文中称为《单克隆抗体》Monoclonal Antibodies)；《抗体工程，实用方法》Antibody Engineering，A Practical Approach，IRLPress at Oxford University Press(1996)(在后文中称为《抗体工程》Antibody Engineering)]从被免疫的动物的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞制备杂交瘤，筛选克隆的杂交瘤，培养选出的杂交瘤，以及从培养上清液中纯化细胞来获得。

至于非人类动物，可以使用任何动物，只要可以从动物制备杂交瘤细胞即可。适合的动物包括小鼠、大鼠、仓鼠和兔。

从杂交瘤细胞制备总RNA的方法包括异硫氰酸胍-三氟乙酸铯方法[Methods in Enzymol.，154，3(1987)]，以及从总RNA中制备mRNA的方法，包括固定有寡聚(dT)的纤维素柱的方法[《分子克隆实验指南》Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.Press(1989)]。从杂交瘤细胞制备mRNA的试剂盒的例子包括Fast TrackmRNA分离试剂盒(Invitrogen制造)和Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)。

合成cDNA和制备cDNA文库的方法包括常规方法[《分子克隆实验指南》Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLab.Press(1989)，《分子生物学现代方法》Current Protocols inMolecular Biology，附录1-34]，或使用可商购试剂盒的方法，例如用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScript^TM质粒系统(GIBCO BRL制造)和ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene制造)。

在cDNA文库的制备中，用于整合使用从杂交瘤细胞提取的mRNA作为模板合成的cDNA的载体，可以是任何载体，只要可以整合cDNA即可。适合的载体的例子包括ZAP表达载体[Strategies，5，58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research，17，9494(1989)]、λZAP II(STRATAGENE制造)、λgt10、λgt11[《DNA克隆：实用方法》DNA Cloning：A Practical Approach，I，49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech制造)、λExCell、pT7T3 18U(Pharmacia制造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.，3，280(1983)]、pUC18[Gene，33，103(1985)]，等等。

至于用于导入用噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌(Escherichia coli)，可以使用任何大肠杆菌，只要可以导入、表达并维持cDNA文库即可。适合的大肠杆菌的例子包括XL1-Blue MRF′[Strategies，5，81(1992)]、C600[Genetics，39，440(1954)]、Y1088、Y1090[Science，222，778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.，166，1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.，16，118(1966)]、JM105[Gene，38，275(1985)]，等等。

从cDNA文库中筛选编码源于非人类动物的抗体的VH和VL的cDNA克隆的方法，包括使用同位素或荧光标记探针的菌落杂交或噬斑杂交[《分子克隆实验指南》Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press New York(1989)]。也可以通过制备引物、并使用cDNA或cDNA文库作为模板进行PCR[《分子克隆实验指南》Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press New York(1989)，《分子生物学现代方法》CurrentProtocols in Molecular Biology，附录1-34]，来制备编码VH和VL的cDNAs。

通过上述方法筛选的cDNAs的核苷酸序列可如下确定：用适当的限制性酶裂解cDNAs，将片段克隆到质粒例如pBluescript SK(-)(STRATAGENE制造)中，然后通过常用的核苷酸序列分析方法例如Sanger等的双脱氧方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977)]、或通过使用核苷酸序列分析仪例如ABI PRISM 377DNA测序仪(AppliedBiosystems制造)来分析序列。

VH和VL的全长氨基酸序列从确定的核苷酸序列推导，并与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列进行比较[《免疫学重要的蛋白的序列》，Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Health和Human Services(1991)]，由此可以证实所获得的cDNAs编码的氨基酸序列完整地含有包括分泌信号序列的抗体的VH和VL。

此外，当抗体可变区的氨基酸序列或编码可变区的DNA的核苷酸序列已知时，可以通过下面方法获得DNA。

当氨基酸序列已知时，可以通过考虑密码子使用纳入考虑[《免疫学重要的蛋白序列》，Sequences of Proteins of Immunological Interest，USDept.Health和Human Services(1991)]来设计编码可变区的DNA序列，根据设计的DNA序列合成几个含有大约100个核苷酸的合成DNAs，并使用合成DNAs进行PCR来获得DNA。当核苷酸序列已知时，可以通过根据核苷酸序列信息合成几个含有大约100个核苷酸的合成DNAs，并使用合成DNAs进行PCR来获得DNA。

(3)非人类动物抗体的V区氨基酸序列分析

通过将包括分泌信号序列的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列与已知抗体的VH和VL的氨基酸序列进行比较[《免疫学重要的蛋白的序列》，Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Health和Human Services(1991)]，有可能推导出分泌信号序列和N-末端氨基酸序列的长度，并进一步了解抗体所属的亚类。此外，VH和VL的CDRs的氨基酸序列能够以类似的方式推导。

(4)人类嵌合抗体表达载体的构建

人类嵌合抗体表达载体可以通过将编码非人类动物抗体的VH和VL的cDNAs，插入到上面1(1)中描述的用于表达重组抗体组合物的载体中编码人类抗体CH和CL的基因上游的位点中来进行构建。例如，构建人类嵌合抗体表达载体可以如下进行：将编码非人类动物抗体的VH和VL的cDNAs，与含有非人类动物抗体的VH和VL的3’-末端核苷酸序列和人类抗体的CH和CL的5’-末端核苷酸序列、并在两端也具有适合的限制性酶识别序列的合成cDNAs分别进行连接，并将它们插入到上面1(1)中描述的用于表达重组抗体组合物的载体中编码人类抗体的CH和CL的基因上游的位点中，从而以适当的形式表达它们。

(5)编码人源化抗体的V区的cDNA的构建

编码人源化抗体的VH和VL的cDNAs能够以下面的方式进行构建。首先，选择人类抗体的VH和VL的FRs的氨基酸序列，用于嫁接非人类动物来源的抗体的VH和VL的CDRs。人类抗体的VH和VL的FRs的氨基酸序列可以是任何来自人类抗体的序列。适合的序列包括在数据库例如蛋白数据库(Protein Data Bank)登记的人类抗体的VHs和VLs的FRs的氨基酸序列，以及人类抗体VHs和VLs的FRs的亚型共有的氨基酸序列[《免疫学重要的蛋白的序列》，Sequences ofProteins of Immunological Interest，US Dept.Health and Human Services(1991)]。为了制备具有足够活性的人源化抗体，优选选择的氨基酸序列与所需的非人类动物来源的抗体的VH和VL的FRs的氨基酸序列具有尽可能高(至少60％以上)的同源性。

接下来，将所需的非人类动物来源的抗体的VH和VL的CDRs的氨基酸序列嫁接到选定的人类抗体的VH和VL的FRs的氨基酸序列中，以设计人源化抗体的VH和VL的氨基酸序列。考虑到抗体基因的核苷酸序列中密码子使用的频率[《免疫学重要的蛋白的序列》，Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Dept.Health andHuman Services(1991)]，将设计的氨基酸序列转变成DNA序列，从而设计了编码人源化抗体的VH和VL的氨基酸序列的DNA序列。根据设计的DNA序列合成几个具有大约100个核苷酸的合成DNAs，并使用合成DNAs进行PCR。优选根据PCR的反应效率和可以被合成的DNAs的长度，对于每个H链和L链设计4到6个合成DNAs。

克隆到上面1(1)中构建的用于本发明的重组抗体组合物表达的载体中，可以通过在两端存在的合成DNAs的5’-末端导入适当的限制性酶的识别序列，来容易地进行。在PCR后，将扩增产物克隆到质粒例如pBluescript SK(-)(STRATAGENE制造)中，通过在上面1(2)中描述的方法测定核苷酸序列，以获得带有编码所需人源化抗体的VH和VL的氨基酸序列的DNA序列的质粒。

(6)人源化抗体V区的氨基酸序列的修饰

已经知道，仅仅通过将非人类动物来源的抗体的VH和VL的CDRs嫁接到人类抗体的VH和VL的FRs中而制备的人源化抗体，与原始的非人类动物来源的抗体相比，抗原结合活性较低[BIO/TECHNOLOGY，9，266(1991)]。这可能是因为在原始的非人类动物来源的抗体的VH和VL中，不仅CDRs、而且FRs中的某些氨基酸残基也直接或间接地参与了抗原结合活性，而这些氨基酸残基通过CDR嫁接被人类抗体的VH和VL的FRs的氨基酸残基替代了。为了解决这个问题，已经在制备人源化抗体中进行了尝试，通过鉴定人类抗体的VH和VL的FRs的氨基酸序列中直接与抗原结合相关、或者通过与CDRs中的氨基酸残基相互作用或维持抗体的三维结构而间接与抗原的结合相关的氨基酸残基，并将这样的氨基酸残基修饰成来自原始非人类动物来源的抗体的氨基酸残基，来提高被降低的抗原结合活性[BIO/TECHNOLOGY，9，266(1991)]。

在人源化抗体的制备中，最重要的是有效地鉴定FR中与抗原结合活性有关的氨基酸残基。为了进行有效鉴定，通过X射线晶体学[J.Mol.Biol.，112，535(1977)]、计算机模拟[Protein Engineering，7，1501(1994)]等，对抗体的三维结构进行了构建和分析。尽管这些对抗体的三维结构的研究已经提供了许多对于制备人源化抗体有用的信息，但还没有已确立的方法可用于制备能适应任何类型的抗体的人源化抗体。也就是说，目前，仍然需要进行试错方法，例如对于每种抗体制备几种修饰，并检查每种修饰与抗原结合活性的关联性。

人类抗体的VH和VL的FRs中的氨基酸残基的修饰，可以使用用于修饰的合成DNAs，通过上面1(5)中描述的PCR来进行。PCR扩增产物的核苷酸序列通过在上面1(2)中描述的方法来测定，以证实所需的修饰已经实现。

(7)人源化抗体表达载体的构建

人源化抗体表达载体，可以通过将上面1(5)和(6)中构建的编码人源化抗体的VH和VL的cDNAs插入到上面的1(1)中描述的用于表达本发明的重组抗体组合物的载体中编码人类抗体的CH和CL的基因上游的位点中，来进行构建。例如，人源化抗体表达载体可以如下构建：在上面1(5)和(6)中用于构建人源化抗体的VH和VL的合成的DNAs中，将适当的限制性酶的识别序列引入到存在于两端的合成DNAs的5’-末端中，并将它们插入到上面的1(1)中描述的用于表达本发明的重组抗体的载体中编码人类抗体的CH和CL的基因上游的位点中，从而以适当的形式表达它们。

(8)人源化抗体的稳定生产

能够稳定地生产人类嵌合抗体或人源化抗体的转化体，可以通过将上面1(4)和(7)中描述的人类嵌合抗体或人源化抗体表达载体导入适合的动物细胞来获得。

将人源化抗体表达载体导入动物细胞，可以通过电穿孔[日本公布的未经审查的专利申请No.257891/90；Cytotechnology，3，133(1990)]等来进行。

至于用于导入人类嵌合抗体或人源化抗体表达载体的动物细胞，可以使用任何能够生产人类嵌合抗体或人源化抗体的动物细胞。

动物细胞的例子包括小鼠骨髓瘤细胞系NS0和SP2/0、中华仓鼠卵巢细胞CHO/dhfr-和CHO/DG44、大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0和IR983F、叙利亚仓鼠肾脏来源的BHK细胞、以及人类骨髓瘤细胞系Namalwa。优选的是中华仓鼠卵巢细胞CHO/DG44和大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0。

在导入人类嵌合抗体或人源化抗体表达载体之后，可以使用含有试剂例如G418硫酸盐(在后文中称为G418；由SIGMA生产)的用于动物细胞培养的培养基，按照在日本公布的未经审查的专利申请No.257891/90中描述的方法，来筛选能够稳定生产人类嵌合抗体或人源化抗体的转化体。用于动物细胞培养的培养基的例子包括RPMI1640培养基(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.制造)、GIT培养基(NihonPharmaceutical Co.，Ltd.制造)、EX-CELL 302培养基(JRH制造)、IMDM培养基(GIBCO BRL制造)、杂交瘤-SFM培养基(GIBCO BRL制造)，以及通过在这些培养基中添加各种添加剂例如胎牛血清(在后文中称为FCS)而制备的培养基。通过在培养基中培养获得的转化体，可以在培养上清液中形成和积累人类嵌合抗体或人源化抗体。在培养上清液中产生的人类嵌合抗体或人源化抗体的量和抗原结合活性，可以通过酶联免疫吸附分析[在后文中称为ELISA；《抗体：实验室手册》，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，第14章(1998)；《单克隆抗体：原理和实践》，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，Academic Press Limited(1996)]等来进行测量。转化体生产的人类嵌合抗体或人源化抗体的量，可以通过利用DHFR基因扩增系统等，按照在日本公布的未经审查的专利申请No.257891/90中描述的方法来增加。

可以使用蛋白A柱[《抗体：实验室手册》，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，第8章(1988)；《单克隆抗体：原理和实践》，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，AcademicPress Limited(1996)]，从转化体的培养上清液中纯化人类嵌合抗体或人源化抗体。此外，也可以使用通常用于纯化蛋白的纯化方法。例如，纯化可以通过凝胶过滤、离子交换层析、超滤等的组合来进行。纯化的人类嵌合抗体或人源化抗体的H链、L链或整个抗体分子的分子量，可以通过SDS-变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳[在后文中称为SDS-PAGE；Nature，227，680(1970)]、Western印迹[《抗体：实验室手册》，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，第12章(1988)；《单克隆抗体：原理和实践》，Monoclonal Antibodies：Principles andPractice，Academic Press Limited(1996)]等来测量。

上面显示的是使用动物细胞作为宿主来生产抗体组合物的方法。抗体组合物也可以使用酵母、昆虫细胞、植物细胞、动物个体或植物个体通过类似的方法来生产。

因此，当宿主细胞能够表达抗体分子时，本发明的抗体组合物可以通过将编码抗体的基因导入表达抗体分子的宿主细胞、培养细胞、以及从培养物中纯化所需的抗体组合物来进行生产。

当酵母被用作宿主细胞时，可以使用YEP13(ATCC 37115)、YEp24(ATCC 37051)、YCp50(ATCC 37419)等作为表达载体。

至于启动子，可以使用任何能够在酵母菌株中表达的启动子。适合的启动子包括糖酵解途径的基因的启动子例如己糖激酶、PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal 10启动子、热休克蛋白启动子、MFα1启动子和CUP 1启动子。

适合的宿主细胞的例子是属于酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)和许旺酵母属(Schwanniomyces)的微生物，具体来说是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、Schwanniomycesalluvius等。

重组载体的导入可以通过任何将DNA导入酵母的方法来进行，例如电穿孔[Methods Enzymol.，194，182(1990)]、原生质球方法[Proc.Natl.Acad Sci.USA，84，1929(1978)]、乙酸锂方法[J.Bacteriology，153，163(1983)]以及在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929(1978)中描述的方法。

当动物细胞被用作宿主细胞时，可以使用pcDNAI、pcDM8(可以从Funakoshi Co.，Ltd.商购)、pAGE107[日本公布的未经审查的专利申请No.22979/91；Cytotechnology，3，133(1990)]、pAS3-3(日本公布的未经审查的专利申请No.227075/90)、pCDM8[Nature，329，840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen Corp.制造)、pREP4(Invitrogen Corp.制造)、pAGE103[J.Biochemistry，101，1307(1987)]、pAGE210等作为表达载体。

至于启动子，可以使用任何能够在动物细胞中表达的启动子。适合的启动子包括巨细胞病毒(CMV)的IE(立即早期)基因的启动子、SV40早期启动子、反转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子，等等。人类CMV的IE基因的增强子可以与启动子组合使用。

适合的宿主细胞的例子是人类来源的Namalwa细胞、猴子来源的COS细胞、中华仓鼠来源的CHO细胞、HBT5637(日本公布的未经审查的专利申请No.299/88)、大鼠骨髓瘤细胞、小鼠骨髓瘤细胞、源于叙利亚仓鼠肾脏的细胞、胚胎干细胞、受精卵细胞，等等。

当昆虫细胞被用作宿主细胞时，蛋白可以通过在《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)、《杆状病毒表达载体：实验室手册》(Baculovirus Expression Vectors，A LaboratoryManual，W.H.Freeman and Company，New York(1992))、Bio/Technology，6，47(1988)等中描述的方法来进行表达。

也就是说，将表达载体和杆状病毒共转染到昆虫细胞中，以在昆虫细胞的培养上清液中获得重组病毒，然后用重组病毒感染昆虫细胞，由此表达蛋白。

在本方法中可用的基因导入载体包括pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(Invitrogen Corp.的产品)等。

杆状病毒的例子是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，它是感染属于夜蛾科(Barathra)昆虫的病毒。

昆虫细胞的例子是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞Sf9和Sf21[《分子生物学现代方法》，Current Protocols in MolecularBiology；《杆状病毒表达载体：实验室手册》，Baculovirus ExpressionVectors，A Laboratory Manual，W.H.Freeman and Company，New York(1992)]以及粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)卵巢细胞High 5(Invitrogen Corp.制造)。

上述表达载体和上述杆状病毒共转染到用于制备重组病毒的昆虫细胞中，这可以通过磷酸钙方法(日本公布的未经审查的专利申请No.227075/90)、脂质转染[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]等来进行。

当植物细胞被用作宿主细胞时，可以使用Ti质粒、烟草花叶病毒载体等作为表达载体。

至于启动子，可以使用任何能够在植物细胞中表达的启动子。适合的启动子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子、水稻肌动蛋白1启动子等。

适合的宿主细胞的例子是植物例如烟草、土豆、西红柿、胡萝卜、大豆、油菜、苜蓿、水稻、小麦和大麦的细胞。

重组载体的导入可以通过任何将DNA导入植物细胞的方法来进行，例如使用土壤杆菌(Agrobacterium)的方法(日本公布的未经审查的专利申请Nos.140885/84和70080/85，WO94/00977)、电穿孔(日本公布的未经审查的专利申请No.251887/85)和使用微粒枪(基因枪)的方法(日本专利Nos.2606856和2517813)。

重组载体的导入可以通过任何将DNA导入动物细胞的方法来进行，例如电穿孔[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸钙方法(日本公布的未经审查的专利申请No.227075/90)、脂质转染[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]、注射方法(《操作小鼠胚胎：实验室手册》，Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual)、使用微粒枪(基因枪)的方法(日本专利Nos.2606856和2517813)、DEAE-葡聚糖方法[《生物手册丛书4——基因转移、表达和分析的方法》，BiomanualSeries 4-Methods of Gene Transfer，Expression和Analysis(Yodosha)，Takashi Yokota和Kenichi Arai主编(1994)]和病毒载体方法(《操作小鼠胚胎：实验室手册》，Manipulating the Mouse Embryo，A LaboratoryManual)。

编码抗体的基因的表达不仅可以通过直接表达来进行，也可以按照《分子克隆第二版》(Molecular Cloning，Second Edition)中描述的方法通过分泌生产、表达Fc区和另一种蛋白的融合蛋白等来进行。

抗体组合物的生产可以通过将上面获得的转化体在培养基中进行培养，使得抗体分子在培养物中形成和积累，以及从培养物中回收它们来进行。转化体在培养基中的培养可以通过培养宿主细胞的常规方法来进行。

为了培养用真核生物例如酵母作为宿主细胞获得的转化体，可以使用任何天然的培养基和合成的培养基，只要它是适合有效培养转化体、含有能够被所用的宿主同化的碳源、氮源、无机盐等的培养基即可。

至于碳源，可以使用任何能够被微生物同化的碳源。适合的碳源的例子包括碳水化合物例如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它们的糖蜜、淀粉和淀粉水解物，有机酸例如乙酸和丙酸，以及醇类例如乙醇和丙醇。

至于氮源，可以使用氨、有机或无机酸的铵盐例如氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵，和其它的含氮化合物，以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆饼、豆饼水解物、以及各种发酵的微生物细胞及其消化的产物。

无机盐的例子包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙，等等。

培养通常在有氧条件下进行，例如通过通气条件下的振荡培养或浸没式旋动培养。培养温度优选为15到40℃，培养时间通常为16小时到7天。在培养过程中pH维持在3.0到9。pH调节通过使用有机或无机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等来进行。

如果必要，在培养过程中可以在培养基中加入抗生素例如氨苄青霉素和四环素。

当对使用可诱导启动子的重组载体转化的微生物进行培养时，如果必要，可以在培养基中加入诱导剂。例如，在使用lac启动子的重组载体转化的微生物的情况下，可以在培养基中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等；在使用trp启动子的重组载体转化的微生物的情况下，可以加入吲哚丙烯酸等。

对于培养用动物细胞作为宿主获得的转化体来说，可以使用通用的培养基作为培养基，例如RPMI1640培养基[The Journal of theAmerican Medical Association，199，519(1967)]、Eagle′s MEM培养基[Science，122，501(1952)]、Dulbecco′s修改的MEM培养基[Virology，8，396(1959)]、199培养基[Proceeding of the Society for the BiologicalMedicine，73，1(1950)]和Whitten′s培养基[《发育工程实验指南——转基因小鼠的制备》，Developmental Engineering Experimentation Manual-Preparation of Transgenic Mice(Kodansha)，Motoya Katsuki主编(1987)]、向这些培养基中加入胎牛血清等制备的培养基，等等。

培养通常在pH 6.0到8.0、30到40℃、存在5％CO₂的条件下进行1到7天。

如果必要，在培养过程中可以在培养基中加入抗生素例如卡那霉素和青霉素。

对于培养用昆虫细胞作为宿主获得的转化体来说，可以使用通用的培养基作为培养基，例如TNM-FH培养基(Pharmingen，Inc.制造)、Sf-900 II SFM培养基(Life Technologies，Inc.制造)、ExCell 400和ExCell 405(JRH Biosciences，Inc.制造)和Grace′s昆虫培养基[Nature，195，788(1962)]。

培养通常在pH 6.0到7.0、25到30℃的条件下进行1到5天。

如果必要，在培养过程中可以在培养基中加入抗生素例如庆大霉素。

使用植物细胞作为宿主获得的转化体可以细胞本身的形式进行培养，或在分化成植物细胞或植物器官后进行培养。对于培养这样的转化体来说，可以使用通用的培养基作为培养基，例如Murashige-Skoog(MS)培养基和White培养基、通过在这些培养基中加入植物激素例如植物生长素和细胞分裂素而制备的培养基，等等。

培养通常在pH 5.0到9.0、20到40℃的条件下进行3到60天。

如果必要，在培养过程中可以在培养基中加入抗生素例如卡那霉素和潮霉素。

如上所述，可以通过按照常规的培养方法对源于动物细胞或植物细胞、并携带其中整合有编码抗体分子的DNA的表达载体的转化体进行培养，使得抗体组合物形成和积累，以及从培养物中回收抗体组合物，来生产抗体组合物。

编码抗体的基因的表达不仅可以通过直接表达来进行，也可以按照《分子克隆第二版》(Molecular Cloning，Second Edition)中描述的方法，通过分泌生产、融合蛋白表达等来进行。

抗体组合物可以通过在宿主细胞中进行细胞内表达来生产，可以通过从宿主细胞进行细胞外分泌来生产，或者可以在宿主细胞的外膜上生产。可以通过改变使用的宿主细胞的种类或要生产的抗体分子的结构来采用所需的生产方法。

当抗体组合物在宿主细胞中或宿主细胞的外膜上生产时，有可能通过采用Paulson等的方法[J.Biol.Chem.，264，17619(1989)]、Lowe等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，8227(1989)；Genes Develop.，4，1288(1990)]、或在日本公布的未经审查的专利申请No.336963/93、WO94/23021等中描述的方法，迫使抗体组合物分泌到宿主细胞外部。

也就是说，有可能通过将编码抗体分子的DNA和编码适合表达抗体分子的的信号肽的DNA插入到表达载体中，将表达载体导入宿主细胞，然后通过使用重组DNA技术表达抗体分子，来迫使目标抗体分子分泌到宿主细胞外部。

也可能通过利用使用二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系统，按照在日本公布的未经审查的专利申请No.227075/90中描述的方法，来增加产生的抗体组合物的量。

此外，抗体组合物可以使用其中导入了基因的动物个体(非人类转基因动物)或其中导入了基因的植物个体(转基因植物)来生产，所述个体是通过使其中导入了基因的动物或植物细胞重新分化而构建的。

当转化体是动物个体或植物个体时，可以通过以通常的方式饲养或栽培动物或植物，使得抗体组合物在其中形成和积累，并从动物个体或植物个体收集抗体组合物，来生产抗体组合物。

使用动物个体生产抗体组合物，可以通过在按照已知方法[American Journal of Clinical Nutrition，63，639S(1996)；AmericanJournal of Clinical Nutrition，63，627S(1996)；Bio/Technology，9，830(1991)]导入基因而构建的动物中生产所需的抗体组合物来进行。

在动物个体的情况下，可以通过例如饲养其中导入了编码抗体分子的DNA的非人类转基因动物，使得抗体组合物在动物中形成和积累，并从动物收集抗体组合物，来生产抗体组合物。抗体组合物形成和积累的地方包括动物的乳汁(日本公布的未经审查的专利申请No.309192/88)、卵等。至于该方法中的启动子，可以使用任何能够在动物中表达的启动子。优选的启动子包括乳腺细胞特异性启动子例如α-酪蛋白启动子、β-酪蛋白启动子、β-乳球蛋白启动子和乳清酸性蛋白启动子。

使用植物个体生产抗体组合物，可以通过栽培其中按照已知方法[Soshiki Baiyo(Tissue Culture)，20(1994)；Soshiki Baiyo(Tissue Culture)，21(1995)；Trends in Biotechnology，15，45(1997)]导入了编码抗体分子的DNA的转基因植物，使得抗体组合物在植物中形成和积累，并从植物收集抗体组合物来进行。

当通过其中导入了编码抗体分子的基因的转化体生产的抗体组合物以可溶形式在细胞中表达时，在完成培养后通过离心回收细胞，并悬浮在水性缓冲液中，然后使用超声仪、French压榨器、Manton Gaulin匀浆器、Dynomill等进行破坏，以获得无细胞提取物。可以通过将无细胞提取物离心以获得上清液，然后对上清液进行分离和纯化酶的常用方法，例如溶剂提取，用硫酸铵等盐析，脱盐，用有机溶剂沉淀，使用树脂例如二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖凝胶和DIAION HPA-75(Mitsubishi Chemical Corporation制造)的阴离子交换层析，使用树脂例如S-琼脂糖凝胶FF(Pharmacia制造)的阳离子交换层析，使用树脂例如丁基琼脂糖凝胶和苯基琼脂糖凝胶的疏水层析，使用分子筛的凝胶过滤，亲和层析，层析聚焦和电泳例如等点聚焦，以上的单独或组合，来获得抗体组合物的纯化制剂。

当抗体组合物被提供为细胞中的不溶体时，细胞进行类似的回收和破坏，然后离心，将抗体组合物的不溶体作为沉淀级份回收。回收的抗体组合物的不溶体用蛋白变性剂进行溶解。将溶解的抗体溶液稀释或透析，由此使抗体组合物复性，以具有正常的三维结构。然后可以通过与上述相同的分离和纯化方法来获得抗体组合物的纯化制剂。

当抗体组合物被分泌到细胞外时，可以在培养上清液中回收抗体组合物或其衍生物。也就是说，将培养物通过与上述相同的方法例如离心进行处理，以获得培养上清液。可以通过使用与上述相同的分离和纯化方法来从培养上清液中获得抗体组合物的纯化制剂。

2.本发明的重组抗体组合物产生细胞的制备

产生在本发明的重组抗体组合物中具有高度ADCC活性和高度CDC活性的抗体组合物的细胞，可以通过下面的技术制备生产本发明的重组抗体组合物的宿主细胞，然后将上面1(4)和(7)中描述的人类嵌合抗体或人源化抗体表达载体导入宿主细胞，来进行生产。

具体来说，筛选出其中与修饰结合到抗体分子的Fc上的N-糖苷连接的糖链相关的酶被失活的细胞，所述酶即与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶、或与其中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的糖链修饰有关的酶，或者可以使用通过下面描述的各种人工技术获得的细胞作为宿主细胞。详细情况描述如下。

(1)靶向编码酶的基因的基因破坏技术

用于生产产生具有高ADCC活性抗体(在后文中称为高ADCC活性抗体)的细胞的宿主细胞，可以通过基因破坏技术来制备，该技术靶向与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码基因，所述糖链修饰中，岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的。与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶包括GDP-甘露糖4，6-脱水酶(在后文中称为GMD)和GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖-3，5-差向异构酶(在后文中称为Fx)。

与糖链修饰有关的酶，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，包括α1，6-岩藻糖基转移酶、α-L-岩藻糖苷酶，等等。这里使用的基因包括DNA和RNA。

基因破坏方法可以是任何能够破坏编码酶的基因的方法。有用的方法包括反义方法、核酶方法、同源重组方法、RNA-DNA寡核苷酸方法(在后文中称为RDO方法)、RNA干扰方法(在后文中称为RNAi方法)、使用反转录病毒的方法和使用转座子的方法等。这些方法将在下面具体描述。

(a)通过反义方法或核酶方法制备生产高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞

用于生产高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，可以通过在Cell Technology，12，239(1993)；BIO/TECHNOLOGY，17，1097(1999)；Hum.Mol.Genet.，5，1083(1995)；Cell Technology，13，255(1994)；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96，1886(1999)等中描述的反义方法或核酶方法来制备，所述方法以例如下面的方式靶向的基因编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶，所述糖链修饰中，岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

制备了编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的cDNA或基因组DNA，所述糖链修饰中，岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。测定所制备的cDNA或基因组DNA的核苷酸序列。根据测定的DNA序列，设计了适当长度的反义基因或核酶，其含有编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的DNA部分、非翻译区或内含子，所述糖链修饰中，中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

为了在细胞中表达反义基因或核酶，通过将制备的DNA的片段或全长插入到适当的表达载体中启动子下游的位点中，制备了重组载体。

通过将重组载体导入适合表达载体的宿主细胞来获得转化体。

通过使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的活性作为指标，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，来筛选转化体，可以获得用于生产本发明的重组抗体组合物的宿主细胞，该重组抗体组合物含有的核酸分子在Fc区具有复合型N-糖苷连接的糖链，其中在组合物中包含的与Fc区结合的全部复合型N-糖苷连接的糖链中，岩藻糖没有结合到糖链还原末端中N-乙酰葡萄糖胺上的糖链的比率是20％或以上。用于生产高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，也可以通过使用细胞膜上糖蛋白的糖链结构或产生的抗体分子的糖链结构作为指标，筛选转化体来获得。

至于生产高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，可以使用任何酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等，只要它具有与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码基因即可，所述糖链修饰中，岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。宿主细胞的例子包括在上面1中描述的那些。

可以采用的表达载体是能够在上述宿主细胞中自主复制或整合到染色体中、并在适合转录所设计的反义基因或核酶的位置含有启动子的表达载体。表达载体的例子包括在上面1中描述的那些。

将基因导入各种宿主细胞，可以通过上面1中描述的适合将重组载体导入各种宿主细胞的方法来进行。

使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的活性作为指标，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，来筛选转化体，可以通过例如下面的方法来进行。

筛选转化体的方法

其中与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的活性被缺失的细胞，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，可以通过使用在Shin Seikagaku Jikken Koza(New Lectures onExperiments in Biochemistry)3-Saccharides I；《糖蛋白》(Glycoprotein(Tokyo Kagaku Dojin)，日本生物化学学会(Japanese BiochemicalSociety)主编(1988))；细胞技术特别版，实验方法丛书，糖生物学实验方法，糖蛋白、糖脂和蛋白多糖(Cell Technology，Extra Edition，Experimental Protocol Series，Glycobiology Experimental Protocol，Glycoprotein，Glycolipid and Proteoglycan(Shujunsha)，NaoyukiTaniguchi，Akemi Suzuki，Kiyoshi Furukawa和Kazuyuki Sugawara主编(1996))；《分子克隆第二版》(Molecular Cloning，Second Edition)；《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)等中描述的生物化学方法或遗传工程技术，测量与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的活性来进行筛选，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。生物化学方法的例子是其中使用酶特异性底物来评估酶活性的方法。遗传工程技术的例子包括Northern分析和其中测量编码酶的基因的mRNA量的RT-PCR。

使用细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为指标筛选转化体，可以通过例如下面2(5)中描述的方法来进行。使用产生的抗体分子的糖链结构作为指标筛选转化体，可以用过例如下面4或5中描述的方法来进行。

制备与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码cDNA，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，可以通过例如下面的方法来进行。

cDNA的制备方法

从各种宿主细胞组织或细胞制备总RNA或mRNA。

从获得的总RNA或mRNA制备cDNA文库。

根据与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的氨基酸序列，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，制备简并引物，使用制备的cDNA文库作为模板，通过PCR获得编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的基因片段，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

通过使用获得的基因片段作为探针筛选cDNA文库，可以获得与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码DNA，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

至于人类或非人类动物组织或细胞的mRNA，可以使用可商购的mRNA(例如Clontech制造的)，或者它可以通过下面的方式从人类或非人类动物组织或细胞制备。

从人类或非人类动物组织或细胞制备总RNA的方法包括异硫氰酸胍-三氟乙酸铯方法[Methods in Enzymology，154，3(1987)]、酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿(AGPC)方法[Analytical Biochemistry，162，156(1987)；Experimental Medicine，9，1937(1991)]，等等。

从总RNA制备mRNA作为poly(A)+RNA的方法包括固定有寡聚(dT)的纤维素柱方法(《分子克隆第二版》，Molecular Cloning，SecondEdition)。

使用可商购的试剂盒例如Fast Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen制造)或Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)制备mRNA，也是可能的。

cDNA文库从获得的人类或非人类动物组织或细胞的mRNA制备。制备cDNA文库的方法包括在《分子克隆》(第二版)(MolecularCloning，Second Edition)、《分子生物学现代方法》(Current Protocolsin Molecular Biology)、《实验室手册》(第二版)(A Laboratory Manual，2nd Ed.(1989))等中描述的方法，以及使用可商购试剂盒的方法，例如用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScript质粒系统(Life Technologies制造)和ZAP-cDNA合成试剂盒(STRATAGENE制造)。

至于制备cDNA文库的克隆载体，可以使用任何载体，例如噬菌体载体和质粒载体，只要它们能够在大肠杆菌K12中自主复制即可。适合的载体的例子包括ZAP Express[STRATAGENE制造；Strategies，5，58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research，17，9494(1989)]、λZAP II(STRATAGENE制造)、λgt10、λgt11[《DNA克隆实践方法》(DNA Cloning，A Practical Approach，1，49(1985)])、λTriplEx(Clontech制造)、λExCell(Pharmacia制造)、pT7T318U(Pharmacia制造)、pcD2[Mol.Cell.Biol.，3，280(1983)]、pUC18[Gene，33，103(1985)]，等等。

任何微生物都能够用作制备cDNA文库的宿主微生物，但是优选使用大肠杆菌。适合的宿主微生物的例子是大肠杆菌XL1-Blue MRF′[STRATAGENE制造；Strategies，5，81(1992)]、大肠杆菌C600[Genetics，39，440(1954)]、大肠杆菌Y1088[Science，222，778(1983)]、大肠杆菌Y1090[Science，222，778(1983)]、大肠杆菌NM522[J.Mol.Biol.，166，1(1983)]、大肠杆菌K802[J.Mol.Biol.，16，118(1966)]、大肠杆菌JM105[Gene，38，275(1985)]，等等。

在下面的分析中可以照原样使用cDNA文库。或者，为了通过降低部分cDNAs的比率以有效获得全长cDNAs，可以将使用Sugano等开发的oligo-cap方法[Gene，138，171(1994)；Gene，200，149(1997)；Protein，Nucleic Acid and Enzyme，41，603(1996)；Experimental Medicine，11，2491(1993)；《cDNA克隆》，cDNA Cloning(Yodosha)(1996)；《制备基因文库的方法》，Methods for Preparing Gene Libraries(Yodosha)(1994)]制备的cDNA文库，用于下面的分析。

根据酶的氨基酸序列，制备特异性针对下述核苷酸序列的5’-末端和3’-末端核苷酸序列的简并引物，所述核苷酸序列据推测用于编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的氨基酸序列，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。使用所制备的cDNA文库作为模板，通过PCR进行DNA扩增[《PCR方法》，PCRProtocols，Academic Press(1990)]，能够获得编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的基因片段，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

通过通用的核苷酸序列分析方法例如Sanger等的双脱氧方法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74，5463(1977)]，或使用核苷酸序列分析仪例如ABI PRISM 377 DNA测序仪(Applied Biosystems制造)，分析核苷酸序列，能够证实所获得的基因片段是与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码DNA，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

使用上述的基因片段作为探针进行菌落杂交或噬斑杂交(《分子克隆第二版》，Molecular Cloning，Second Edition)，从包含在人类或非人类动物组织或细胞中的mRNA合成的cDNA或cDNA文库中，能够获得与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码DNA，所述糖链修饰中，岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

也可以使用从包含在人类或非人类动物组织或细胞中的mRNA合成的cDNA或cDNA文库作为模板，并使用用于获得与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码基因片段的引物，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，通过PCR扩增来获得与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码cDNA，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码DNA的核苷酸序列，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，可以通过通用的核苷酸序列分析方法例如Sanger等的双脱氧方法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74，5463(1977)]、或使用核苷酸序列分析仪例如ABI PRISM 377 DNA测序仪(Applied Biosystems制造)来测定。

根据测定的cDNA的核苷酸序列，通过使用同源性搜索程序例如BLAST，对核苷酸序列数据库例如GenBank、EMBL或DDBJ进行搜索，能够证实获得的DNA是核苷酸序列数据库的基因中，编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的基因，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

通过上述方法获得的与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶的编码基因核苷酸序列的例子，包括SEQ ID NO：18或20所表示的核苷酸序列。

通过上述方法获得的与糖链修饰有关的酶的编码基因核苷酸序列的例子，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，包括SEQ ID NO：22或23所表示的核苷酸序列。

与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码cDNA，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，也可以根据测定的目标DNA的核苷酸序列，利用亚磷酰胺法，用DNA合成仪例如392型DNA合成仪(Perkin Elmer制造)，通过化学合成来获得。

编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的基因组DNA的制备，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，可以通过例如下面的方法来进行。

制备基因组DNA的方法

基因组DNA可以通过在《分子克隆第二版》(Molecular Cloning，Second Edition)、《分子生物学现代方法》(Current Protocols inMolecular Biology)等中描述的已知方法来制备。此外，编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的基因组DNA，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，也可以通过使用试剂盒来获得，例如基因组DNA文库筛选系统(Genome Systems制造)或通用GenomeWalker^TM试剂盒(CLONTECH制造)。

与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码DNA的核苷酸序列，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，可以通过常用的核苷酸分析方法例如Sanger等的双脱氧方法[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74，5463(1977)]、或使用核苷酸序列分析仪例如ABI PRISM 377 DNA测序仪(Applied Biosystems制造)来测定。

根据测定的基因组DNA的核苷酸序列，通过使用同源性搜索程序例如BLAST，对核苷酸序列数据库例如GenBank、EMBL或DDBJ进行搜索，能够证实获得的DNA是核苷酸序列数据库的基因中，与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码基因，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的基因组DNA，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，也可以根据测定的DNA的核苷酸序列，利用亚磷酰胺方法，用DNA合成仪例如392型DNA合成仪(Perkin Elmer制造)，通过化学合成来获得。

通过上述方法获得的编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶的基因组DNAs核苷酸序列的例子，包括SEQ ID NOs：26、27、28和29所表示的核苷酸序列。

通过上述方法获得的编码与糖链修饰有关的酶的基因组DNA核苷酸序列的例子，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，是SEQ IDNO：30所表示的核苷酸序列。

用于生产本发明的抗体组合物的宿主细胞，也可以不使用表达载体，通过将根据与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码核苷酸序列而设计的反义寡核苷酸或核酶，直接导入到宿主细胞中来获得，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

反义寡核苷酸或核酶可以通过已知的方法或使用DNA合成仪来制备。具体来说，根据寡核苷酸的序列信息，该寡核苷酸所具有的序列对应于编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的cDNA和基因组DNA的核苷酸序列中的5到150个、优选5到60个、更优选10到40个连续核苷酸，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，可以合成与含有寡核苷酸序列的上述寡核苷酸(反义寡核苷酸)或核酶互补的序列相对应的寡核苷酸。

寡核苷酸包括寡聚RNA和寡核苷酸的衍生物(在后文中称为寡核苷酸衍生物)。

寡核苷酸衍生物包括其中寡核苷酸中的磷酸二酯键被转换成硫代磷酸酯键的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸中的磷酸二酯键被转换成N3′-P5′氨基磷酸酯键的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸中的核糖-磷酸二酯键被转换成肽-核酸键的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸中的尿嘧啶被C-5丙炔基尿嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸中的尿嘧啶被C-5噻唑基尿嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸中的胞嘧啶被C-5丙炔基胞嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸中的胞嘧啶被吩呃嗪修饰的胞嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、其中寡核苷酸中的核糖被2′-O-丙基核糖取代的寡核苷酸衍生物、以及其中寡核苷酸中的核糖被2′-甲氧基乙氧基核糖取代的寡核苷酸衍生物[CellTechnology，16，1463(1997)]。

(b)通过同源重组方法制备用于生产高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞

用于生产高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，可以通过同源重组方法，修饰染色体上的靶基因来制备，所述同源重组方法靶向与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码基因，所述糖链修饰中，岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

染色体上靶基因的修饰，可以使用在《操作小鼠胚胎，实验室手册》(第二版)(Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994))(在后文中称为《操作小鼠胚胎：实验室手册》，″Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual″)；《基因定靶实用方法》(Gene Targeting，APractical Approach，IRL Press at Oxford University Press(1993))；《生物手册丛书8，基因定靶，使用ES细胞制备突变小鼠》(BiomanualSeries 8，Gene Targeting，Preparation of Mutant Mice Using ES Cells，Yodosha(1995))(在后文中称为《使用ES细胞制备突变小鼠》Preparation of Mutant Mice Using ES Cells)等中描述的方法，以例如下面的方式来进行。

制备编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的基因组DNA，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

根据基因组DNA的核苷酸序列，制备靶载体用于同源重组待修饰的靶基因(例如与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的结构基因或启动子基因，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合)。

通过将制备的靶载体导入宿主细胞，并筛选其中在染色体上的靶基因与靶载体之间发生了同源重组的细胞，能够制备用于生产高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞。

至于宿主细胞，可以使用任何酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等，只要它具有与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码基因即可，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。宿主细胞的例子包括在上面1中描述的那些。

编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链的修饰有关的酶的基因组DNA，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，可以通过上面1(1)(a)中描述的制备基因组DNA的方法来制备。

通过上述方法获得的编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶的基因组DNAs的核苷酸序列的例子，包括SEQ ID NOs：26、27、28和29所表示的核苷酸序列。

通过上述方法获得的编码与糖链修饰有关的酶的基因组DNA核苷酸序列的例子，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，是SEQ IDNO：30所表示的核苷酸序列。

用于染色体上靶基因的同源重组的靶载体，可以按照在《基因定靶实用方法》(Gene Targeting，A Practical Approach，IRL Press atOxford University Press(1993))、《生物手册丛书8，基因定靶，使用ES细胞制备突变小鼠》(Biomanual Series 8，Gene Targeting，Preparation of Mutant Mice Using ES Cells，Yodosha(1995))等中描述的方法来制备。靶载体可以是替代型的或插入型的。

将靶载体导入各种宿主细胞，可以通过在上面1中描述的适合将重组载体导入各种宿主细胞的方法来进行。

有效筛选同源重组体的方法包括在《基因定靶实用方法》(GeneTargeting，A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press(1993))、《生物手册丛书8，基因定靶，使用ES细胞制备突变小鼠》(Biomanual Series 8，Gene Targeting，Preparation of Mutant Mice UsingES Cells，Yodosha(1995))等中描述的阳性筛选、启动子筛选、阴性筛选和polyA筛选。从筛选到的细胞系中筛选所需同源重组体的方法包括用基因组DNA进行Southern杂交(《分子克隆第二版》，MolecularCloning，Second Edition)和PCR[《PCR方法》，PCR Protocols，AcademicPress(1990)]。

(c)通过RDO方法制备用于高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞

用于产生高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，可以通过RDO方法，以例如下面的方式来制备，所述RDO方法靶向与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码基因，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的。

通过上面1(1)(a)中描述的方法，制备编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的cDNA或基因组DNA，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。测定了制备的cDNA或基因组DNA的核苷酸序列。根据测定的DNA序列，设计并合成了长度适当的RDO构建物，其含有与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码部分、其非翻译区的部分或内含子的部分，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

通过将合成的RDO导入宿主细胞，然后筛选在靶酶中发生了突变的转化体，来获得宿主细胞，所述靶酶即与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

至于宿主细胞，可以使用任何酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等，只要它具有与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码基因即可，所述糖链修饰中，岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。宿主细胞的例子包括上面1中描述的那些。

将RDO导入各种宿主细胞，可以通过上面1中描述的适合将重组载体导入各种宿主细胞的方法来进行。

编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的cDNA，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，可以通过上述2(1)(a)中描述的制备cDNA的方法等来制备。

编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的基因组DNA，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，可以通过上述2(1)(b)中描述的制备基因组DNA的方法等来制备。

在用适当的限制性酶切开DNA后，可以通过将DNA片段亚克隆到质粒例如pBluescript SK(-)(Stratagene制造)中，对克隆进行通常用作核苷酸序列分析方法例如Sanger等的双脱氧方法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74，5463(1977)]等的反应，然后使用自动化核苷酸序列分析仪例如ABI PRISM 377 DNA测序仪(Applied Biosystems制造)等分析克隆，来测定DNA的核苷酸序列。

RDO可以通过常规方法或使用DNA合成仪来制备。筛选通过将RDO导入宿主细胞，而在编码酶的基因中发生了突变的细胞的方法，包括在《分子克隆第二版》(Molecular Cloning，Second Edition)、《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)等中描述的在染色体基因中直接检测突变的方法，所述酶即与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的与还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位连接，。

为了筛选转化体，也可以使用下面的方法：在上面的2(1)(a)中描述的使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的活性作为指标的方法，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合；在下面2(5)中描述的使用细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为指标的方法；以及在下面的4或5中描述的使用产生的抗体分子的糖链结构作为指标的方法。

按照在Science，273，1386(1996)；Nature Medicine，4，285(1998)；Hepatology，25，1462(1997)；Gene Therapy，5，1960(1999)；GeneTherapy，5，1960(1999)；J.Mol.Med.，75，829(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，8774(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，8768(1999)；Nuc.Acids Res.，27，1323(1999)；Invest.Dermatol.，111，1172(1998)；Nature Biotech.，16，1343(1998)；Nature Biotech.，18，43(2000)；NatureBiotech.，18，555(2000)等中的描述，来设计RDO。

(d)通过RNAi方法制备用于产生高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞

用于产生高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，可以通过RNAi方法，以例如下面的方式来制备，所述RNAi方法靶向与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码基因，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

通过上面2(1)(a)中描述的方法，制备与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码cDNA，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。测定了制备的cDNA的核苷酸序列。根据测定的cDNA序列，设计长度适当的RNAi基因，其含有与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码部分、或非翻译区的部分，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

为了在细胞中表达RNAi基因，通过将制备的cDNA的片段或全长插入到适当的表达载体中启动子下游的位点，制备重组载体。将重组载体导入适合表达载体的宿主细胞中，以获得转化体。用于制备高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，可以通过筛选转化体来获得，所述筛选使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的的活性、或产生的抗体分子或细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为指标，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

至于宿主细胞，可以使用任何酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等，只要它具有与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码基因即可，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。宿主细胞的例子包括上面1中描述的那些。

可以使用的表达载体是能够在上述宿主细胞中自主复制或整合到染色体中、并在适合转录所设计的RNAi基因的位置上含有启动子的表达载体。表达载体的例子包括上面1中描述的那些。

将基因导入各种宿主细胞，可以通过上面1中描述的适合将重组载体导入各种宿主细胞的方法来进行。

使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶的活性、或与糖链修饰有关的酶的活性作为指标筛选转化体的方法，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，包括在上面2(1)(a)中描述的方法。

使用细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为指标筛选转化体的方法，包括在2(5)中描述的方法。使用产生的抗体分子的糖链结构作为指标筛选转化体的方法包括在下面4或5中描述的方法。

与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码cDNA的制备方法，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，包括在上述2(1)(a)中描述的制备cDNA的方法等。

用于生产高CDC活性和高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，也可以不使用表达载体，通过将根据与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码核苷酸序列而设计的RNAi基因直接导入到宿主细胞中来获得，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

RNAi基因可以通过已知方法或使用DNA合成仪来制备。可以根据在Nature，391，806(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，15502(1998)；Nature，395，854(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，5049(1999)；Cell，95，1017(1998)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，1451(1999)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，13959(1998)；Nature Cell Biol.，2，70(2000)等中的描述，来设计RNAi基因构建物。

(e)通过使用转座子的方法制备生产高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞

用于生产高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，可以通过使用在Nature Genet.，25，35(2000)等中描述的转座子系统，然后使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶的活性、或与糖链修饰有关的酶的活性、或产生的抗体分子或细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为指标，筛选突变体来制备，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

转座子系统是通过将外源基因随机插入到染色体中而诱导突变的系统，其中通常插入到转座子中的外源基因被用作诱导突变的载体，用于将基因随机插入到染色体中的转座酶表达载体同时被导入到细胞中。

可以使用任何转座酶，只要它适合于所使用的转座子的序列即可。

至于外源基因，可以使用任何基因，只要它可以在宿主细胞的DNA中诱导突变即可。

至于宿主细胞，可以使用任何酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等，只要它具有与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码基因即可，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。宿主细胞的例子包括在上面1中描述的那些。将基因导入各种宿主细胞，可以通过在上面1中描述的适合将重组载体导入各种宿主细胞的方法来进行。

使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶、或与糖链修饰有关的酶的活性作为指标筛选突变体的方法，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，包括上面2(1)(a)中描述的方法。

使用细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为指标筛选突变体的方法，包括2(5)中描述的方法。使用产生的抗体分子的糖链结构作为指标筛选突变体的方法，包括下面4或5中描述的方法。

(2)导入酶的编码基因的显性失活突变体的技术

用于生产高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，可以通过使用导入靶基因的显性失活突变体的技术来制备，所述靶基因即与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码基因，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成有关的酶的例子包括GMD和Fx。与糖链修饰有关的酶的例子包括α1，6-岩藻糖基转移酶和α-L-岩藻糖苷酶，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

这些酶具有底物特异性并催化特定反应。通过破坏这些酶具有底物特异性和催化活性的活性中心，可以制备它们的显性失活突变体。显性失活突变体的制备在下面详细描述，使用GMD作为靶酶的例子。

作为源于大肠杆菌的GMD的三维结构分析的结果，已经揭示四个氨基酸(133位的苏氨酸，135位的谷氨酸，157位的酪氨酸和161位的赖氨酸)对于酶活性具有重要功能(Structure，8，2，2000)。也就是说，根据三维结构信息，通过用其它氨基酸取代上述四个氨基酸而制备的突变体，都显示出显著降低的酶活性。另一方面，在突变体与GMD辅酶NADP或底物GDP-甘露糖的结合能力方面观察到变化很少。因此，可以通过取代负责GMD酶活性的四个氨基酸来制备显性失活突变体。在源于大肠杆菌的GMD的显性失活突变体的制备结果的基础上，可以通过使用氨基酸序列信息进行同源性比较和三维结构预测，来制备显性失活突变体。例如，在源于CHO细胞的GMD(SEQ IDNO：19)的情况下，可以通过用其它氨基酸取代155位的苏氨酸、157位的谷氨酸、179位的酪氨酸和183位的赖氨酸，来制备显性失活突变体。制备这种带有导入的氨基酸取代的基因，可以通过在《分子克隆第二版》(Molecular Cloning，Second Edition)、《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)等中描述的位点定向突变来进行。

用于生产高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，可以按照在《分子克隆第二版》(Molecular Cloning，Second Edition)、《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)、《小鼠胚胎的操作》(第二版)(Manipulating the Mouse Embryo，Second Edition)等中描述的基因导入方法，使用按照上述制备的编码靶酶的显性失活突变体的基因(在后文中简称为显性失活突变体基因)，以例如下面的方式来制备。

制备编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶、或与糖链修饰有关的酶的显性失活突变体基因，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

基于所制备的显性失活突变体基因的全长DNA，根据需要制备适当长度的含有蛋白编码区的DNA片段。

通过将DNA片段或全长DNA插入到适当的表达载体中启动子下游的位点中，制备重组载体。将重组载体导入到适合表达载体的宿主细胞中，获得转化体。

用于制备高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，可以通过使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶的活性、或与糖链修饰有关的酶的活性、或产生的抗体分子或细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为指标，筛选转化体来获得，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

至于宿主细胞，可以使用任何酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等，只要它具有与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶或与糖链修饰有关的酶的编码基因即可，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。宿主细胞的例子包括上面1中描述的那些。

可以使用的表达载体是能够在上述宿主细胞中自主复制或整合到染色体中、并在适合转录所需显性失活突变体的编码DNA的的位置上含有启动子的表达载体。表达载体的例子包括上面1中描述的那些。

将基因导入各种宿主细胞，可以通过在上面1中描述的适合将重组载体导入各种宿主细胞的方法来进行。

使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶的活性、或与糖链修饰有关的酶的活性作为指标，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，筛选转化体的方法包括在下面2(1)(a)中描述的方法。

使用细胞膜上的糖蛋白的糖链结构作为指标筛选转化体的方法，包括在下面2(5)中描述的方法。使用产生的抗体分子的糖链结构作为指标筛选转化体的方法，包括在下面4或5中描述的方法。

(3)在酶中导入突变的技术

用于制备高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，可以如下制备：将突变导入基因，所述基因编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶、或糖链修饰有关的酶，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，然后筛选其中在酶中发生了突变的所需细胞系。

与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶的例子包括GMD和Fx等。与糖链修饰有关的酶的例子，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，包括α1，6-岩藻糖基转移酶、α-L-岩藻糖苷酶等。

将突变导入酶的方法包括：1)从亲本细胞系进行诱变或通过自发突变获得的突变体中，使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶的活性、或与糖链修饰有关的酶的活性作为指标，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，来筛选所需细胞系的方法；2)从亲本细胞系进行诱变或通过自发突变获得的突变体中，使用产生的抗体分子的糖链结构作为指标，来筛选所需细胞系的方法；以及3)从亲本细胞系进行诱变或通过自发突变获得的突变体中，使用细胞膜上糖蛋白的糖链结构作为指标，来筛选所需细胞系的方法。

诱变可以通过能够在亲本细胞系细胞的DNA中诱导点突变、缺失突变或移码突变的任何方法来进行。适合的方法包括用乙基亚硝基脲、亚硝基胍、苯并芘或吖啶染料和辐照进行处理。各种烷基化试剂和致癌剂也可以用作诱变剂。诱变剂被可以通过在《组织培养技术》(第三版)(Soshiki Baiyono Gijutsu(Tissue Culture Techniques)，ThirdEdition(Asakura Shoten)，日本组织培养协会(Japanese Tissue CultureAssociation)主编(1996))、Nature Genet.，24，314(2000)等中描述的方法作用在细胞上。

通过自发突变产生的突变体的例子，包括通过在正常的细胞培养条件下不作任何特定的诱变处理，进行连续传代培养而获得的自发突变体。

测定与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶、或与糖链的修饰有关的酶的活性的方法，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，包括在上面1(1)(a)中描述的方法。测定产生的抗体分子的糖链结构的方法，包括在下面4或5中描述的方法。测定细胞膜上的糖蛋白的糖链结构的方法，包括在上面2(5)中描述的方法。

(4)抑制酶的编码基因的转录或翻译的技术

用于制备高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，可以通过使用反义RNA/DNA技术[Bioscience and Industry，50，322(1992)；Chemistry，46，681(1991)；Biotechnology，9，358(1992)；Trends in Biotechnology，10，87(1992)；Trends in Biotechnology，10，152(1992)；Cell Technology，16，1463(1997)]、三螺旋技术[Trends in Biotechnology，10，132(1992)]等，抑制靶基因的转录或翻译来进行，所述靶基因即编码与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶、或与糖链修饰有关的酶的靶基因，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶的例子包括GMD和Fx等。与糖链修饰有关的酶的例子，包括α1，6-岩藻糖基转移酶、α-L-岩藻糖苷酶等，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合。

测定与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖合成有关的酶的活性、或与糖链修饰有关的酶的活性的方法，所述糖链修饰中岩藻糖的1-位通过α-键与复合型N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合，包括在上面2(1)(a)中描述的方法。

测定细胞膜上糖蛋白的糖链结构的方法包括在上面2(5)中描述的方法。测定产生的抗体分子的糖链结构的方法，包括在下面4或5中描述的方法。

(5)对外源凝集素具有抗性的细胞系的筛选技术，所述外源凝集素识别岩藻糖的1-位通过α-键与N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的糖链结构

用于制备高ADCC活性抗体产生细胞的宿主细胞，可以通过筛选对下述外源凝集素具有抗性的细胞系来制备，所述外源凝集素识别岩藻糖的1-位通过α-键与N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的糖链结构。

筛选对外源凝集素具有抗性的细胞系，所述外源凝集素识别岩藻糖的1-位通过α-键与N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的糖链结构，可以通过例如在Somatic Cell Mol.Genet.，12，51(1986)等中描述的使用外源凝集素的方法来进行。

至于外源凝集素，可以使用任何外源凝集素，只要它识别岩藻糖的1-位通过α-键与N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的糖链结构即可。具体的例子包括小扁豆外源凝集素LCA(源于扁豆(Lens culinaris)的小扁豆凝集素)、豌豆外源凝集素PSA(源于豌豆(Pisum sativum)的豌豆外源凝集素)、蚕豆外源凝集素VFA(源自于蚕豆(Vicia faba)的凝集素)和橙黄网孢盘菌(Aleuria aurantia)外源凝集素AAL(源于橙黄网孢盘菌的外源凝集素)。

具体来说，对外源凝集素具有抗性的细胞系，所述外源凝集素识别岩藻糖的1-位通过α-键与N-糖苷连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺的6-位结合的糖链结构，可以通过将细胞在含有浓度为1μg/ml到1mg/ml的上述外源凝集素的培养基中培养1天到两周，优选1天到1周，将存活细胞传代培养或挑取菌落，并将其转移到培养皿中，然后使用含有外源凝集素的培养基继续进行培养，来进行筛选。

3.抗体组合物活性的评估

可以使用在《单克隆抗体》(Monoclonal Antibodies)、《抗体工程》(Antibody Engineering)等中描述的已知方法，来测量纯化的抗体组合物的蛋白量、抗原结合活性或细胞毒性活性。

具体来说，当抗体组合物是人类嵌合抗体或人源化抗体时，可以通过ELISA、荧光抗体技术[Cancer Immunol.Immunother.，36，373(1993)]等，来测量与抗原的结合活性、或与抗原阳性的培养细胞系的结合活性。与抗原阳性的培养细胞系的细胞毒活性可以通过测量CDC活性、ADCC活性等[Cancer Immunol.Immunother.，36，373(1993)]来进行评估。

测量ADCC活性的方法包括使得用放射性同位素、荧光物质、染料等标记的靶细胞与抗体和效应细胞相接触，然后测量从受伤的靶细胞释放出的标记物质的活性的方法；使得靶细胞与抗体和效应细胞相接触，然后测量从受伤的靶细胞释放的酶的生物学活性的方法；等等。

测量CDC活性的方法包括使得用放射性同位素、荧光物质、染料等标记的靶细胞与抗体和生物学样品例如含有补体成分的血清相接触，然后测量从受伤的靶细胞释放出的标记物质的活性的方法；使得靶细胞与抗体和生物学样品例如含有补体成分的血清相接触，然后测量从受伤的靶细胞释放的酶的生物学活性的方法；等等。

抗体组合物在人类中的安全性和治疗效果，可以使用与人类相对接近的物种例如食蟹猴的适当动物模型来进行评估。

4.抗体组合物中糖链的分析

在各种细胞中表达的抗体分子的糖链结构，可以按照分析糖蛋白糖链结构的常用方法进行分析。例如，与IgG分子结合的糖链由中性糖例如半乳糖、甘露糖和岩藻糖，氨基糖例如N-乙酰葡萄糖胺，和酸性糖例如唾液酸组成，并可以使用例如糖组成分析和使用二维糖链作图的糖链结构分析这样的技术来进行分析。

(1)中性糖和氨基糖组成的分析

抗体组合物的糖链组成，可以通过用三氟乙酸等对糖链进行酸水解以释放中性糖和氨基糖并分析组成比例，来进行分析。

具体来说，可以通过使用Dionex制造的碳水化合物分析装置的方法来进行分析。BioLC是通过HPAEC-PAD(高效阴离子交换层析-脉冲安培检测)[J.Liq.Chromatogr.，6，1577(1983)]来分析糖组成的装置。

成分的比例也可以通过使用2-氨基吡啶的荧光标记方法来进行分析。具体来说，组成比例可以按照已知的方法[Agric.Biol.Chem.，55(1)，283-284(1991)]通过2-氨基吡啶化作用对酸水解的样品进行荧光标记，然后通过HPLC分析组成来进行计算。

(2)糖链结构的分析

抗体组合物的糖链结构可以通过二维糖链作图[Anal.Biochem.，171，73(1988)；Seibutsukagaku Jikkenho(生化实验方法)23-Totanpakushitsu Tosa Kenkyuho(“糖蛋白糖链的研究方法”)，GakkaiShuppan Center，Reiko Takahashi主编(1989)]进行分析。二维糖链作图是分别通过例如以反相色谱时糖链的持留时间或洗脱位置作为X轴，正相色谱时糖链的持留时间或洗脱位置作为Y轴进行作图，并将它们与已知糖链的结果进行比较，而推断糖链结构的方法。

具体来说，通过对抗体进行肼解将糖链从抗体上释放出来，并用2-氨基吡啶(在后文中称为PA)进行荧光标记[J.Biochem.，95，197(1984)]。在通过凝胶过滤与过量的PA处理试剂分离后，将糖链进行反相色谱。然后，将每个分级的糖链的峰进行正相色谱。通过将获得的结果在二维糖链图上进行作图，并将它们与糖链标准品(Takara ShuzoCo.，Ltd.制造)或文献中[Anal.Biochem.，171，73(1988)]的点进行比较，来推导出糖链的结构。

通过二维糖链作图推导的结构，可以通过对每个糖链进行质谱分析例如MALDI-TOF-MS来证实。

5.测定抗体分子的糖链结构的方法

抗体组合物包含具有与抗体的Fc区结合、具有不同糖链结构的抗体分子。在本发明的抗体组合物中，含有的抗体分子在Fc区具有复合型N-糖苷连接的糖链的重组抗体组合物，其中组合物中包含的与Fc区结合的全部复合型N-糖苷连接的糖链中，岩藻糖没有结合到还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺上的糖链的比率是20％以上，显示出高ADCC活性。这样的抗体组合物可以使用在上面4中描述的分析抗体分子的糖链结构的方法来测定。此外，它也可以通过使用外源凝集素的免疫分析来测定。

通过使用外源凝集素的免疫分析测定抗体分子的糖链结构，可以按照在文献[《单克隆抗体：原理与应用》，Monoclonal Antibodies：Principles and Applications，Wiley-Liss，Inc.(1995)；《酶免疫分析》(第三版)，Enzyme Immunoassay，3rd Ed.，Igaku Shoin(1987)；《酶抗体技术》(修订版)，Enzyme Antibody Technique，Revised Edition，GakusaiKikaku(1985)；等等]中描述的免疫分析，例如Western染色、RIA(放射免疫分析)、VIA(病毒免疫分析)、EIA(酶免疫分析)、FIA(荧光免疫分析)和MIA(金属免疫分析)，以例如下面的方式来进行。

将识别构成抗体组合物的抗体分子的糖链结构的外源凝集素进行标记，并将标记的外源凝集素与样品抗体组合物进行反应，然后测量标记的外源凝集素与抗体分子的复合物的量。

用于测定抗体分子的糖链结构的外源凝集素的例子包括WGA(源于T.vulgaris的麦芽凝集素)、ConA(源于矮生刀豆(C.ensiformis)的伴刀豆球蛋白A)、RIC(源于蓖麻(R.communis)的毒素)、L-PHA(源于菜豆(P.vulgaris)的白细胞凝集素)、LCA(源于扁豆(L.culinaris)的小扁豆凝集素)、PSA(源于豌豆(P.sativum)的豌豆外源凝集素)、AAL(橙黄网孢盘菌(Aleuria aurantia)的外源凝集素)、ACL(尾穗苋(Amaranthus caudatus)外源凝集素)、BPL(羊蹄甲(Bauhinia purpurea)的外源凝集素)、DSL(曼陀罗(Daturastramonium)的外源凝集素)、DBA(双花扁豆(Dolichos biflorus)凝集素)、EBL(接骨木皮外源凝集素)、ECL(鸡冠刺桐(Erythrinacristagalli)的外源凝集素)、EEL(欧洲卫矛(Euonymus europaeus)的外源凝集素)、GNL(雪花莲(Galanthus nivalis的外源凝集素)、GSL(加纳谷物(Griffonia simplicifolia)的外源凝集素)、HPA(罗曼蜗牛(Helix pomatia)的凝集素)、HHL(孤挺(Hippeastrum)杂交外源凝集素)、木菠萝凝集素、LTL(豇豆(Lotus tetragonolobus)的外源凝集素)、LEL(番茄(Lycopersicon esculentum)的外源凝集素)、MAL(朝鲜槐(Maackia amurensis)的外源凝集素)、MPL(橙桑(Maclura pomifera)的外源凝集素)、NPL(黄水仙(Narcissuspseudonarcissus)的外源凝集素)、PNA(花生凝集素)、E-PHA(四季豆(Phaseolus vulgaris)凝血素)、PTL(四棱豆(Psophocarpustetragonolobus)的外源凝集素)、RCA(蓖麻子(Ricinus communis)凝集素)、STL(马铃薯(Solanum tuberosum)的外源凝集素)、SJA(槐(Sophora japonica)凝集素)、SBA(大豆凝集素)、UEA(荆豆(Ulex europaeus)凝集素)、VVL(长柔毛野豌豆(Vicia villosa)的外源凝集素)和WFA(多花紫藤(Wisteria floribunda)凝集素)。

优选使用的外源凝集素特异性识别复合型N-糖苷连接的糖链中岩藻糖与还原末端中N-乙酰葡萄糖胺连接的糖链结构的外源凝集素。这样的外源凝集素的例子包括小扁豆外源凝集素LCA(源于扁豆(Lensculinaris)的小扁豆凝集素)、豌豆外源凝集素PSA(源于豌豆(Pisumsativum)的豌豆外源凝集素)、蚕豆外源凝集素VFA(源于蚕豆(Viciafaba)的凝集素)和橙黄网孢盘菌(Aleuria aurantia)外源凝集素AAL(源于橙黄网孢盘菌的外源凝集素)。

6.本发明的重组抗体组合物的利用

因为本发明的重组抗体组合物具有比IgG1抗体和IgG3抗体更高的CDC活性，因此它比常规的抗体组合物在治疗效果方面具有更优良的性质。此外，在本发明的重组抗体组合物中，因为含有的抗体分子在Fc区具有复合型N-糖苷连接的糖链的重组抗体组合物，其中在组合物中包含的与Fc区结合的全部复合型N-糖苷连接的糖链中，岩藻糖没有结合到糖链还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺上的糖链的比率是20％以上，这样的组合物具有比IgG1抗体和IgG3抗体更高的CDC活性和更高的ADCC活性，因此它比常规的抗体组合物在治疗效果方面具有更优良的性质。此外，在本发明的重组抗体组合物中，更优选的是含有的抗体分子在Fc区具有复合型N-糖苷连接的糖链的重组抗体组合物，其中在组合物中包含的与Fc区结合的全部复合型N-糖苷连接的糖链中，岩藻糖没有结合到糖链还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺上的糖链比率是100％。

含有本发明的重组抗体组合物的药物可以作为治疗药剂单独给药。但是，优选与一种或多种可药用的载体混合，提供成以制药学技术领域众所周知的任意方法生产的药物制剂。

将药物通过对治疗最有效的途径给药是适宜的。适合的给药途径包括口服给药和肠胃外给药，例如口内给药、气管内给药、直肠内给药、皮下给药、肌肉内给药和静脉内给药。在抗体制剂的情况下，静脉内给药是优选的。

药物可以是喷剂、胶囊、片剂、颗粒、糖浆、乳剂、栓剂、注射剂、膏剂、贴剂等的形式。

适合口服给药的制剂包括乳剂、糖浆、胶囊、片剂、粉末和颗粒。

液体制剂例如乳剂和糖浆可以使用例如水、糖(例如蔗糖、山梨糖醇和果糖)、多元醇(例如聚乙二醇和丙二醇)、油(例如芝麻油、橄榄油和大豆油)、防腐剂(例如对羟基苯甲酸酯)、香料(例如草莓香料和胡椒薄荷)等作为添加剂来制备。

胶囊、片剂、粉末、颗粒等可以使用赋形剂(例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇)、崩解剂(例如淀粉和藻酸钠)、润滑剂(例如硬脂酸镁和滑石粉)、粘合剂(例如聚乙烯醇、羟丙基纤维素和明胶)、表面活性剂(例如脂肪酸酯)、塑化剂(例如甘油)等作为添加剂来制备。

适合于肠胃外给药的药物制剂包括注射剂、栓剂和喷雾剂。

注射剂可以使用含有盐溶液、葡萄糖溶液或其混合物等的载体来制备。按照常规方法通过将抗体组合物冷冻干燥并向其中加入氯化钠来制备粉末注射剂，也是可能的。

栓剂可以使用载体例如可可脂、氢化脂肪和羧酸来制备。

抗体组合物本身可以以喷剂的形式使用，或者可以使用不刺激接受者的口腔或气管粘膜、并且可以将抗体组合物分散成细小的颗粒以便于其吸收的载体，来制备喷剂。

适合的载体包括乳糖和甘油。根据抗体组合物和使用的载体的性质，制备气溶胶、干粉等也是可能的。在这些肠胃外制剂的制备中，也可以添加上面提到的口服制剂的添加剂。

剂量和给药频率将依赖于所需的治疗效果、给药途径、治疗时间、患者的年龄、体重等而变化。但是，对于成人来说，活性成分的适合剂量一般为每天10μg/kg到20mg/kg。

抗体组合物针对各种肿瘤细胞的抗肿瘤效果，可以通过体外试验例如CDC活性测量和ADCC活性测量，以及体内试验例如在实验动物(例如小鼠)中使用肿瘤系统的抗肿瘤实验，来进行检测。

CDC活性和ADCC活性的测量以及抗肿瘤实验，可以按照文献[Cancer Immunology Immunotherapy，36，373(1993)；Cancer Research，54，1511(1994)等]中描述的方法来进行。

本发明提供了重组抗体组合物，它是人类IgG1抗体，含有CH2结构域，该结构域中由Kabat等中的EU索引指示的276位和339位氨基酸被其它的氨基酸替代，并且与含有氨基酸被替代前的CH2结构域的抗体相比，具有进一步改进的补体依赖性细胞毒活性；包含在重组抗体组合物中的抗体分子或抗体分子的重链恒定区的编码DNA；通过将DNA导入宿主细胞可获得的转化体；使用转化体生产重组抗体组合物的方法；以及含有重组抗体组合物作为活性成分的药物。

下面将根据实施例对本发明进行描述；但是，本发明不限于这些实施例。

实施例1

使用动物细胞制备抗CD20人类IgG1抗体、抗CD20人类IgG3抗体和抗CD20嵌合同种型抗体：

1.抗CD20人类IgG3嵌合抗体的表达载体的产生

从源自人类淋巴结的poly A+RNA(BD Biosciences Clontech制造)，使用cDNA合成试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech制造)按照其附带的说明书，合成cDNA。使用100ng cDNA作为模板，并使用KOD plus(TOYOBO制造)和含有SEQ ID NOs：1和2所表示的氨基酸序列的人类IgG恒定区特异性合成DNA引物(FASMAC制造)，按照KOD plus附带的说明书，进行PCR。PCR使用GeneAmp PCRSystem 9700(Applied Biosystems制造)进行，在94℃热变性1分钟后，进行由94℃15秒、62℃30秒和68℃90秒的反应组成的30个循环。在68℃进一步进行7分钟的反应后，在其中加入2.5U的Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo制造)，使其在68℃反应7分钟，以便在3′-末端加上腺嘌呤。使用1％琼脂糖凝胶对反应溶液进行电泳，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)回收被认为是IgG3重链恒定区基因的大约1.1kbp扩增片段。通过加入Ligation High溶液(TOYOBO制造)，进行与质粒pCRII-TOPO载体(Invitrogen制造)的连接反应，并使用该反应溶液转化大肠杆菌DH5α(TOYOBO制造)。从这样获得的转化体克隆制备每种质粒DNA，将其使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(Applied Biosystems制造)按照随附的说明书进行反应，然后通过同一公司的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析，以证实该序列是编码常规已知的人类IgG3重链恒定区同样氨基酸序列(GenBank登记号No.AAH33178)的核苷酸序列。

通过用限制性酶ApaI和NruI(均由Takara Shuzo制造)进行处理，从上述插入了人类IgG3重链恒定区基因的质粒中纯化了IgG3重链恒定区中1.13kbp的基因片段。抗CD20人类IgG1嵌合抗体的稳定的动物细胞表达载体(描述在WO03/055993中)pKANTEX2B8P，含有与抗CD20人类IgG1抗体美罗华的小鼠来源可变区相同的可变区、人类κ-型轻链恒定区和人类IgG1重链恒定区，将其用ApaI和NruI进行消化。抗CD20人类IgG3抗体的表达载体pKANTEX2B8γ3(图2)，是通过切下IgG1恒定区基因，纯化剩余的大约12.6kbp片段，并使用Ligation High溶液将它与上述IgG3恒定区基因片段进行连接而构建的。pKANTEX2B8γ3编码的抗CD20人类IgG3抗体的重链可变区、轻链可变区和轻链恒定区的氨基酸序列，与pKANTEX2B8P编码的抗CD20人类IgG1嵌合抗体的重链可变区、轻链可变区和轻链恒定区的氨基酸序列一致。

2.抗CD20嵌合同种型抗体表达载体的产生

抗CD20嵌合同种型抗体，其中重链可变区、轻链可变区和轻链恒定区的氨基酸序列与pKANTEX2B8P编码的抗CD20人类IgG1抗体的重链可变区、轻链可变区和轻链恒定区的氨基酸序列一致，并且重链恒定区的氨基酸序列含有pKANTEX2B8P编码的抗CD20人类IgG1抗体的重链恒定区的氨基酸序列、和pKANTEX2B8γ3编码的抗CD20人类IgG3抗体的重链恒定区的氨基酸序列，该抗体按照下面的程序来制备。重链恒定区中CH1和铰链区由来自人类IgG1抗体的氨基酸序列构成、Fc区由来自人类IgG3抗体的氨基酸序列构成的抗CD20嵌合同种型抗体，被称为1133型抗CD20嵌合同种型抗体，而重链恒定区中CH1和铰链区由来自人类IgG3抗体的氨基酸序列构成、Fc区由来自人类IgG1抗体的氨基酸序列构成的抗CD20嵌合同种型抗体，被称为3311型抗CD20嵌合同种型抗体。作为使用氨基酸序列数据库进行搜索的结果，发现这些抗CD20嵌合同种型抗体的重链恒定区的氨基酸序列是新的氨基酸序列。1133型抗CD20嵌合同种型抗体和3311型抗CD20嵌合抗体的每个结构域被派生的亚类，以及重链恒定区相应的氨基酸序列，显示在表1中。这些抗CD20抗体的示意图显示在图3中。

表1

(1)编码1133型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建

编码1133型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/1133，按照下面的方式构建(图4)。使用限制性酶ApaI(Takara Shuzo制造)和BmgBI(New England Biolabs制造)，从抗CD20人类IgG1抗体表达载体pKANTEX2B8P上切下大约430bp的编码人类IgG1抗体的CH1和铰链区的DNA片段，并进行纯化。另一方面，通过用限制性酶进行相似的处理，从本实施例的条目1中描述的抗CD20人类IgG3抗体表达载体pKANTEX2B8γ3中切下大约13kbp的DNA片段，并进行纯化。在将这些纯化的DNA制备物混合后，使用Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应，并使用反应溶液转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体克隆制备每种质粒DNA，将其使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(Applied Biosystems制造)按照随附的说明书进行反应，然后通过同一公司的DNA测序仪ABIPRISM 3700 DNA分析仪，对插入到质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析，以证实获得了在图4中显示的质粒pKTX93/1133。

(2)编码3311型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建

编码3311型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/3311，按照下面的方式构建(图5)。使用限制性酶ApaI(Takara Shuzo制造)和BmgBI(New England Biolabs制造)，从本实施例的条目1中描述的抗CD20人类IgG3嵌合抗体表达载体pKANTEX2B8γ3上切下大约570bp的编码人类IgG3抗体的CH1和铰链区的DNA片段，并进行纯化。另一方面，通过用限制性酶进行类似的处理，从抗CD20人类IgG1抗体表达载体pKANTEX2B8P中切下大约13kbp的DNA片段，并进行纯化。在将这些纯化的DNA制备物混合后，使用Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应，并使用反应溶液转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体克隆制备每种质粒DNA，将其使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(AppliedBiosystems制造)按照随附的说明书进行反应，然后通过同一公司的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析，以证实获得了在图5中显示的质粒pKTX93/3311。

3.各种抗CD20抗体在动物细胞中的稳定表达

稳定生产抗CD20人类IgG3抗体或抗CD20嵌合同种型抗体的细胞，其中在本实施例的条目1和2中制备的抗CD20人类IgG3抗体表达载体pKTX93/1133、和抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1133和pKTX93/3311，被插入到作为宿主细胞的CHO/DG44细胞[Somatic Cell Mol.Genet.，12，555(1986)]和其中α1，6-岩藻糖基转移酶基因被敲除的CHO/DG44细胞(在后文中称为CHO/FUT8^-/-)[Biotechnol.Bioeng.，87，614(2004)]中，按照下面的方式来制备。CHO/DG44细胞是广泛用于重组蛋白生产的宿主细胞。CHO/FUT8^-/-是其中CHO/DG44细胞基因组上的FUT8被敲除的宿主细胞。此外，抗CD20人类IgG1抗体表达载体pKANTEX2B8P被单独导入CHO/FUT8^-/-细胞，并以同样的方式制备了能够稳定生产抗CD20人类IgG1抗体的细胞。

在通过电穿孔方法[Cytotechnology，3，133(1990)]将8μg的每种表达载体导入1.6×10⁶个CHO/DG44细胞或CHO/FUT8^-/-细胞后，将细胞悬浮在40ml IMDM-(10)中[IMDM培养基(GIBCO-BRL制造)中含有10％透析过的胎牛血清(dFBS)]，以100μl/孔分配到96孔微孔板中(Sumitomo Bakelite制造)。在5％CO₂培养箱中于37℃培养24小时后，将细胞在含有浓度为500μg/ml的G418的IMDM-(10)中培养1到2周。培养后，从每个孔回收培养上清液，通过本实施例后面条目4中描述的ELISA，测定培养上清液中抗CD20嵌合同种型抗体的量。对于其中在培养上清液中发现了抗CD20嵌合同种型抗体表达的孔中的转化体来说，为了使用dhfr基因扩增系统增加抗体表达量，将细胞悬浮在含有浓度为500μg/ml的G418和浓度为50nM的氨甲蝶呤(在后文中称为MTX，SIGMA制造)的IMDM-(10)培养基中，其中氨甲蝶呤作为dhfr基因产物二氢叶酸还原酶的抑制剂，并在5％CO₂培养箱中于37℃培养大约1周，从而获得对50nM MTX具有抗性的转化体。随后，将MTX浓度连续升高到100nM，然后到200nM，以最终获得能够在含有浓度为500μg/ml的G418和200nM MTX的IMDM-(10)培养基中增殖、并还能够高水平表达相应的表达载体编码的抗体的转化体。

4.测量培养上清液中抗体的浓度(ELISA)

将山羊抗人IgG(H&L)抗体(American Qualex制造)用磷酸盐缓冲盐水(在后文中称为PBS)稀释到1μg/ml，以50μl/孔分配到用于ELISA的96孔板中(Greiner制造)，将其在室温放置1小时以进行吸附。反应后，将板用PBS清洗，在其中加入100μl/孔的含有1％牛血清白蛋白(在后文中称为BSA；Proliant Inc制造)的PBS(在后文中称为1％BSA-PBS)，使其在室温反应1小时，以阻断剩余的活性基团。在除去1％BSA-PBS后，加入50μl/孔待测量的培养上清液，使其在室温反应2小时。反应后，将每个孔用含有0.05％Tween 20的PBS(在后文中称为Tween-PBS)清洗，然后以50μl/孔加入用PBS稀释500倍的过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(Fc)抗体溶液(American Qualex制造)作为第二抗体溶液，使其在室温反应1小时。在用Tween-PBS清洗后，加入50μl/孔的ABTS底物溶液[通过将0.55g 2，2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)铵溶解在1升0.1M柠檬酸缓冲液(pH 4.2)中，并在使用前加入1μl/ml过氧化氢制备的溶液]以显色，并在415nm测量吸光度(在后文中称为OD415)。

5.各种抗CD20抗体的纯化

将在本实施例条目3中获得的每种能够表达不同抗CD20抗体的转化体以1×10⁵个细胞/ml的密度悬浮在含有200nM MTX的IMDM-FCS(10)中，然后以100ml分配到3个培养瓶中(Nalgenunc制造)，在5％CO₂培养箱中在37℃培养2天。从每个培养瓶取出培养上清液，培养瓶的内部用50ml PBS清洗，然后在培养瓶中加入100mlEXCELL 301培养基(JRH Biosciences制造)，在5％CO₂培养箱中在37℃继续培养5天。回收该培养上清液，在3000rpm和4℃离心5分钟，然后回收上清液，使用0.22μm PES膜(Iwaki制造)进行过滤除菌。使用装填有Prosep-A(蛋白A结合树脂；Millipore制造)或Prosep-G(蛋白G结合树脂；Millipore制造)的柱子，按照随附的说明书，从这样的无菌培养上清液中纯化各种抗CD20抗体。IgG1抗CD20抗体通过蛋白A纯化，但是因为IgG3抗CD20抗体不能通过蛋白A纯化，因此纯化使用蛋白G进行。对于抗CD20嵌合同种型抗体来说，3311型通过蛋白A纯化。另一方面，1133型不能用蛋白A纯化，但是能够通过蛋白G纯化。

每种抗体的表达载体和宿主细胞以及纯化的抗体样品的名称显示在表2中。就此而论，在表中，名称中具有(+F)的样品表示抗体样品使用其中岩藻糖结合到与Fc连接的糖链上的CHO/DG44作为宿主细胞生产，而名称中具有(-F)的样品表示抗体样品使用其中岩藻糖没有结合到与Fc连接的糖链上的CHO/FUT8^-/-作为宿主细胞生产

表2

6.通过SDS-PAGE评估各种抗CD20抗体样品的纯化程度

为了评估在本实施例条目5中获得的各种抗CD20抗体的纯化样品的纯化程度，按照常规已知的方法[Nature，227，680(1970)]，使用各种抗CD20抗体每种大约1μg的纯化样品，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(在后文中称为SDS-PAGE)。作为电泳程度的比较性对照，至于抗CD20人类IgG1抗体美罗华进行了同样的操作。在后文中，美罗华被称为CD20-IgG1(+F)。

结果，1133(+F)和1133(-F)显示出与人类IgG1抗体CD20-IgG1(+F)相似的电泳图案，而3311(+F)和3311(-F)显示与人类IgG3抗体CD20-IgG3(+F)相似的电泳图案。在CD20-IgG1(+F)、CD20-IgG1(-F)、1133(+F)和1133(-F)的情况下，H链的条带被发现是大约50千道尔顿(在后文中称为kDa)，L链的条带被发现是大约24kDa，而在CD20-IgG3(+F)、CD20-IgG3(-F)、3311(+F)和3311(-F)的情况下，H链的条带被发现是大约54kDa，L链的条带被发现是大约24kDa，因此证实了每种制备的抗CD20抗体由所需H链和L链构成。

根据上面的结果，证实了在本实施例的条目5中获得的相应抗CD20抗体的纯化样品中，包含了比例充足的由H链和L链构成的所需IgG分子。

实施例2

各种抗CD20抗体的活性评估：

通过下面的方式，对实施例1的条目5中获得的各种抗CD20抗体的纯化样品的各种活性进行了比较。

1.测量各种抗CD20抗体对CD20阳性细胞的结合活性

在与生物素化美罗华的竞争性抑制系统中，通过荧光抗体技术，使用流式细胞仪测量了在实施例1的条目5中获得的各种抗CD20抗体纯化样品对CD20阳性细胞的结合活性。作为阴性对照，使用了抗Her2人类IgG1抗体赫赛汀[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89，4285(1992)]和抗CCR4人类IgG1抗体KM3060[Cancer Res.，64，2127(2004)]。

将源自CD20阳性的Burkitt淋巴瘤细胞系Daudi细胞(ATCC：CCL-213)以每孔5×10⁵个细胞分配到96孔U型板中(Falcon制造)，然后在其中加入50μl/孔的FACS缓冲液[0.2mg/ml人类IgG(Sigma制造)，0.02％EDTA，0.05％NaN₃，1％BSA]，其中含有10μg/ml或1μg/ml在实施例1条目5中获得的相应CD20抗体、或阴性对照抗Her2抗体赫赛汀[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89，4285(1992)]和抗CCR4抗体KM3060(WO02/31140)，并含有0.5μg/ml生物素标记的抗CD20嵌合抗体美罗华[通过用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce制造)对美罗华进行生物素化而制备]。在暗处4℃反应60分钟后，将细胞用FACS缓冲液清洗两次，然后在其中加入50μl/孔的用FACS缓冲液稀释200倍的PE标记的链亲和素。在避光处4℃反应60分钟后，将细胞用FACS缓冲液清洗两次并悬浮在1ml FACS缓冲液中，然后使用流式细胞仪EPICS-XL(Coulter制造)测量荧光强度。

结果显示在图6中。阴性对照抗Her2抗体赫赛汀和抗CCR4抗体KM3060不抑制生物素标记的美罗华与CD20阳性细胞Daudi的结合，但是所有抗CD20嵌合同种型抗体、抗CD20人类IgG1抗体和抗CD20人类IgG3抗体浓度依赖性第抑制结合，其程度几乎相同。此外，在所有抗CD20抗体中，以CHO/DG44作为宿主细胞产生的抗体样品和以CHO/FUT8^-/-作为宿主细胞产生的抗体样品具有相似的结合抑制活性，在与抗体结合的糖链中存在或不存在岩藻糖对于结合抑制活性没有影响。根据这些结果，显示出抗CD20嵌合同种型抗体的抗原结合是CD20特异性的，抗CD20嵌合同种型抗体的抗原结合活性与抗CD20人类IgG1嵌合抗体的活性相似，在与Fc结合的糖链中存在或不存在岩藻糖对于抗原结合活性没有影响。

2.测量各种抗CD20抗体对Daudi细胞的CDC活性

使用CD20阳性Daudi细胞测量在实施例1条目5中获得的各种抗CD20抗体的纯化样品的体外CDC活性。

反应在96孔平底板(Sumitomo Bakelite制造)中进行，将含有Daudi细胞5×10⁴个细胞并含有0.3μg/ml纯化的抗体样品的人类补体稀释培养基[通过用含有10％FBS(JRH制造)的RPMI 1640培养基(GIBCO BRL制造)将人类补体(SIGMA制造)稀释6倍而制备]150μl分配到相应的反应孔中。此外，在没有诱导CDC的情况下，制备不含抗CD20嵌合同种型抗体的反应孔(0％反应孔)作为对照，在诱导了CDC的情况下，制备不含Daudi细胞的反应孔(100％反应孔)作为对照。在5％CO₂气氛下在37℃培养2小时后，在相应的反应孔中加入15μl的WST-1试剂(ROCHE制造)，在5％CO₂气氛下在37℃反应4小时。在反应完成后，测量每个孔中的OD450，使用下面的公式从每个孔的吸光度计算CDC活性(％)：

CDC活性(％)

＝100×{1-(反应孔吸光度-100％反应孔吸光度)/(0％反应孔吸光度-100％反应孔吸光度)}

结果显示在图7中。如图7所示，抗CD20人类IgG3抗体的CDC活性高于抗CD20人类IgG1抗体的CDC活性，因此证实了IgG3的CDC活性高于IgG1的CDC活性。但是，1133型抗CD20嵌合同种型抗体的CDC活性明显高于抗CD20人类IgG3抗体的CDC活性。另一方面，3311型抗CD20嵌合同种型抗体的CDC活性低，类似于抗CD20人类IgG1抗体。此外，在所有抗CD20抗体中，以CHO/DG44作为宿主细胞生产的抗体样品和以CHO/FUT8^-/-作为宿主细胞生产的抗体样品显示出几乎相同的CDC活性，与抗体结合的糖链中存在或不存在岩藻糖对CDC活性没有影响。此外，在抗体浓度为1μg/ml时发现了相似的结果。根据这些结果发现，1133型抗CD20嵌合同种型抗体的CDC活性高于抗CD20人类IgG1抗体和抗CD20人类IgG3抗体，并且与Fc结合的糖链中存在或不存在岩藻糖对CDC活性没有影响。

3.1133型抗CD20嵌合同种型抗体的CDC活性测定

为了进一步全面评估在本实施例的条目2中显示出特别高CDC活性的1133型抗CD20嵌合同种型抗体的CDC活性，以与本实施例条目2中相同的方式，使用源于CD20阳性Burkitt淋巴瘤的细胞系ST 486细胞(ATCC：CRL-1647)或源于Burkitt淋巴瘤的细胞系Raji细胞(ATCC：CCL-86)，进行CDC活性的测量。

结果显示在图8中。如图8所示，在ST 486细胞系(图8A)和Raji细胞系(图8B)的每一种中，抗CD20人类IgG3抗体的CDC活性高于抗CD20人类IgG1抗体的CDC活性，而1133型抗CD20嵌合同种型抗体显示出比抗CD20人类IgG1抗体和抗CD20人类IgG3抗体更高的CDC活性。此外，在所有这些抗CD20抗体中，以CHO/DG44作为宿主细胞生产的抗体样品和以CHO/FUT8^-/-作为宿主细胞生产的抗体样品显示出几乎相同的CDC活性，并显示出与抗体结合的糖链中存在或不存在岩藻糖对CDC活性没有影响。

4.测量各种抗CD20抗体对CD20阳性细胞系的ADCC活性

使用CD20阳性Daudi细胞作为靶细胞，以下述方式测量了在实施例1条目5中获得的各种抗CD20抗体的纯化样品的体外ADCC活性。测量中使用Cytotox 96试剂盒(Promega制造)。

(1)人类效应细胞悬浮液的制备

从健康的志愿者收集50ml外周血，与0.2ml肝素钠(TakedaPharmaceutical制造)轻柔混合。使用Lymphoprep(Daiichi PureChemicals制造)按照随附的说明书从中分离单核细胞级份，然后通过用RPMI 1640培养基离心一次和10％FBS-RPMI 1640培养基离心一次进行清洗，将细胞用作效应细胞。

(2)ADCC活性的测量

反应在96孔平底板(Falcon制造)中进行，将含有2×10⁵个效应细胞和1×10⁴个Daudi细胞或ST 486细胞并含有各种浓度的每种抗CD20抗体的10％FBS-RPMI 1640培养基200μl，分配到每个反应孔中。此外，分别制备不含有效应细胞、靶细胞和抗体的培养基孔，只含有效应细胞的效应细胞孔，只含有靶细胞的靶细胞孔，含有效应细胞和靶细胞但不含抗体的NK孔，只含有靶细胞并且在反应开始后3小时15分钟时在其中加入20μl试剂盒附带的裂解缓冲液的100％反应孔，以及不含效应细胞、靶细胞和抗体并且在反应开始后3小时15分钟时在其中加入20μl试剂盒附带的裂解缓冲液的100％反应对照孔，作为计算ADCC活性所必需的对象孔。每个反应孔在5％CO₂气氛下在37℃反应4小时后，将反应板离心，从每个孔回收50μl上清液。将孔中的上清液分别转移到96孔U型平底板(Sumitomo Bakelite制造)的孔中，在每个孔中加入50μl显色底物溶液(通过将试剂盒附带的一小瓶底物溶解在12ml试剂盒附带的分析缓冲液中来制备)。显色反应在37℃进行30分钟，在每个孔中加入50μl试剂盒附带的反应终止溶液，然后测量OD450，使用下面的公式从每个孔的吸光度计算ADCC活性(％)：

ADCC活性(％)＝100×(S-E-T)/(Max-T)

S＝样品反应孔吸光度-培养基孔吸光度

E＝效应细胞孔吸光度-培养基孔吸光度

T＝靶细胞孔吸光度-培养基孔吸光度

Max＝100％反应孔-100％反应对照孔

结果显示在图9中。如图9所示，在所有抗CD20抗体中，从CHO/FUT8^-/-生产的抗体样品显示出比从CHO/DG44生产的抗体样品更高的ADCC活性。从该结果也发现，在所有本实施例中制备的抗CD20嵌合同种型抗体的情况下，其中在与抗体的Fc结合的复合型N-糖苷连接的糖链中岩藻糖没有与还原末端中存在的N-乙酰葡萄糖胺结合的抗体组合物，与其中在与抗体的Fc结合的复合型N-糖苷连接的糖链中岩藻糖与还原末端中存在的N-乙酰葡萄糖胺结合的抗体组合物相比，ADCC活性增加。此外，证实了抗CD20人类IgG1抗体显示出比抗CD20人类IgG3抗体更高的ADCC活性，也就是说，IgG1的ADCC活性高于IgG3的ADCC活性。此外，1133型抗CD20嵌合同种型抗体维持了与抗CD20人类IgG1嵌合抗体相似水平的高ADCC活性。此外，发现了3311型抗CD20嵌合同种型抗体的ADCC活性低，与抗CD20人类IgG3抗体的水平相似。

5.测量各种抗CD20抗体与重组Fcγ受体IIIa的结合活性

为了分析在本实施例的条目4中证实1133型抗CD20嵌合同种型抗体增强ADCC活性的机制，按照常规已知的方法[Clin.Cancer Res.，10，6248(2004)]，测量了在实施例1条目5中获得的各种抗CD20抗体的纯化样品与表达在NK细胞表面上的Fc受体家族之一Fcγ受体IIIa(在后文中称为FcγRIIIa)的结合活性。

结果显示在图10中。如图10所示，由CHO/FUT8^-/-产生的抗CD20抗体显示出比用CHO/DG44产生的抗CD20抗体更高的对FcγRIIIa的结合活性。基于该结果，发现了与1133型抗CD20嵌合同种型抗体的Fc结合的复合型N-糖苷连接的糖链还原末端中存在的N-乙酰葡萄糖胺结合的岩藻糖的存在或不存在而导致的抗体ADCC活性增加，是由Fc区与Fc受体的结合活性增加而引起的。

根据上述，1133型抗CD20嵌合同种型抗体具有与其中重链恒定区的CH1和铰链区是人类IgG1抗体的氨基酸序列、Fc是人类IgG3抗体的氨基酸序列的抗CD20人类IgG1嵌合抗体美罗华相同的重链可变区、轻链可变区和轻链恒定区，其具有超过抗CD20人类IgG1抗体和抗CD20人类IgG3嵌合抗体的CDC活性，也具有与抗CD20人类IgG1抗体基本上相当的ADCC活性。此外，显示出与抗CD20人类IgG1抗体的情况相似，通过移除与Fc结合的复合型N-糖苷连接的糖链还原末端中的N-乙酰葡萄糖胺结合的岩藻糖，Fc与Fc受体的结合活性增加和ADCC活性改善。

根据在上面获得的结果，每个制备的嵌合同种型抗体的结构和活性之间的关系显示在表3中。在表中，ADCC活性和CDC活性以降序表示成+++、++和+。

表3

根据上述显示，所具有的重链恒定区中CH1和铰链区是人类IgG1抗体的氨基酸序列、而CH2和CH3是人类IgG3抗体的氨基酸序列的1133型抗CD20嵌合同种型抗体分子，具有高于人类IgG1抗体和人类IgG3抗体的CDC活性，并维持了与人类IgG1抗体基本上相当的高ADCC活性。

根据上面的结果发现，通过抗CD20人类IgG1抗体的重链恒定区中的Fc用抗CD20人类IgG3抗体的氨基酸序列进行交换，显著增加了抗CD20人类IgG1抗体的CDC活性。

实施例3

使用动物细胞生产1131型抗CD20嵌合同种型抗体和1113型抗CD20嵌合抗体：

1.1131型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体和1113型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的生产

接下来，为了调查Fc区的哪个结构域与人类IgG3抗体的氨基酸序列进行交换将增加CDC活性，制备了其中1133型的每个CH2结构域或CH3结构域被人类IgG1抗体的每个氨基酸序列替代的嵌合同种型抗体。测量了CDC活性以比较哪个结构域对于增加CDC的活性是重要的。所具有的重链恒定区中CH1、铰链区和CH3是人类IgG1抗体、只有CH2结构域是人类IgG3抗体的抗CD20嵌合同种型抗体被称为1131型，而具有的重链恒定区中CH1、铰链区和CH2是人类IgG1抗体、只有CH3结构域是人类IgG3抗体的抗CD20嵌合同种型抗体被称为1113型。在所有的抗CD20嵌合同种型抗体中，重链可变区、轻链可变区和轻链恒定区的氨基酸序列，分别与pKANTEX2B8P编码的抗CD20人类IgG1抗体的重链可变区、轻链可变区和轻链恒定区的氨基酸序列相同。抗CD20嵌合同种型抗体的重链恒定区结构域结构和氨基酸序列显示在表4中。所有这些嵌合同种型抗体具有新的重链恒定区。此外，每个嵌合同种型的示意图显示在图11中。

表4

(1)编码1131型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建

编码1131型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/1131(图12)按照下面的程序来构建。首先，用限制性酶ApaI(Takara Shuzo制造)和SmaI(Takara Shuzo制造)，从本实施例条目1中描述的1133型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1133上切下并纯化编码CH1、铰链区和CH2的大约700bp的DNA片段。另一方面，通过用限制性酶进行同样的处理，从抗CD20人类IgG1抗体表达载体pKANTEX2B8P上切下并纯化大约13kbp的DNA片段。在将这些纯化的DNA制备物混合后，使用Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应，并使用反应溶液转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体克隆制备每种质粒DNA，将其使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(Applied Biosystems制造)按照随附的说明书进行反应，然后通过同一公司的DNA测序仪ABIPRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析，以证实获得了在图12中显示的质粒pKTX93/1131。

(2)编码1113型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建编码1113型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/1113(图13)按照下面的程序来构建。首先，用限制性酶ApaI(Takara Shuzo制造)和SmaI(Takara Shuzo制造)，从本实施例条目1中描述的抗CD20人类IgG1抗体表达载体pKANTEX2B8P上切下并纯化编码CH1、铰链区和CH2的大约700bp的DNA片段。另一方面，通过进行同样的限制性酶处理，从本实施例条目1中描述的1133型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1133上切下并纯化大约13kbp的DNA片段。在将这些纯化的DNA制备物混合后，使用Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应，使用反应溶液转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体克隆制备每种质粒DNA，将其使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(AppliedBiosystems制造)按照随附的说明书进行反应，然后通过同一公司的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析，以证实获得了在图13中显示的质粒pKTX93/1113。

2.1113型抗CD20嵌合同种型抗体和1131型抗CD20嵌合同种型抗体在动物细胞中的稳定表达

按照与实施例1条目3中相同的方式，通过将本实施例条目1中制备的抗CD20嵌合同种型抗体表达载体导入实施例1条目3中描述的作为宿主细胞的CHO/FUT8^-/-中，制备了稳定表达抗CD20嵌合同种型抗体的细胞。

3.1113型抗CD20嵌合同种型抗体和1131型抗CD20嵌合同种型抗体的纯化

在本实施例条目2中获得的能够表达1113型抗CD20嵌合同种型抗体和1131型抗CD20嵌合同种型抗体的转化体，以与实施例1条目5中相同的方式进行培养和纯化。1113型抗CD20嵌合同种型抗体和1131型抗CD20嵌合同种型抗体使用装填有Prosep-G(蛋白G结合树脂；Millipore制造)的柱子进行纯化。此外，当使用装填有Prosep-A(蛋白A结合树脂；Millipore制造)的柱子纯化1133型抗CD20嵌合同种型抗体、1113型抗CD20嵌合同种型抗体和1131型抗CD20嵌合同种型抗体时，只有1131型抗CD20嵌合同种型抗体能够被纯化。作为宿主细胞，在每种情况下使用CHO/FUT8^-/-。

每种嵌合同种型抗体的表达载体和纯化抗体的名称显示在表5中。

表5

4.通过SDS-PAGE评估1113型抗CD20嵌合同种型抗体和1131型抗CD20嵌合同种型抗体的纯化程度

为了测量在本实施例条目3中获得的各种抗CD20嵌合同种型抗体的纯化程度，按照与实施例1条目6中相同的方式进行SDS-PAGE。作为电泳的比较性对照，对在实施例1条目5中制备的各种CD20-IgG1(-F)、CD20-IgG3(-F)和1133(-F)也进行了相同的操作。

结果显示在图14中。1113(-F)和1131(-F)分别显示出了与CD20-IgG1(-F)和1133(-F)相似的电泳图形。从构成1113(-F)和1131(-F)的H链和L链的氨基酸序列推导的分子量彼此相似，H链是大约50kDa，L链是大约24kDa。因为这些分子量与CD20-IgG1(-F)和1133(-F)的H链和L链分子量相似，电泳图形也与之相似，因此证实了1113(-F)和1131(-F)由所需H链和L链构成。此外，从构成CD20-IgG3(-F)的L链的氨基酸序列推导的分子量是大约24kDa，与CD20-IgG1(-F)的相似，但是构成CD20-IgG3(-F)的H链是大约54kDa，大于CD20-IgG1(-F)的H链的分子量，因此CD20-IgG3(-F)的L链出现在与CD20-IgG1(-F)的L链相似的位置，但是CD20-IgG3(-F)的H链的条带位于CD20-IgG1(-F)的H链条带的高分子量侧。根据上述结果，证实了在本实施例条目3中获得的各种抗CD20嵌合同种型抗体中，包含了充分比例的分别由H链和L链构成的所需IgG分子。

实施例4

1113型抗CD20嵌合同种型抗体和1131型抗CD20嵌合同种型抗体的活性的评估：

使用在实施例3条目3中获得的各种抗CD20嵌合同种型抗体的纯化样品，以下面的方式对各种活性进行比较。

1.测量1113型抗CD20嵌合同种型抗体和1131型抗CD20嵌合同种型抗体的CDC活性

使用在实施例1条目5中获得的抗CD20人类IgG1抗体CD20-IgG1(-F)、抗CD20人类IgG3抗体CD20-IgG3(-F)和1133型抗CD20嵌合同种型抗体1133(-F)，以及在实施例3的条目3中获得的1131型抗CD20嵌合同种型抗体1131(-F)和1113型抗CD20嵌合同种型抗体1113(-F)，按照与实施例2条目2中相同的程序，使用CD20阳性ST486细胞或Raji细胞，评估了对CD20阳性细胞系的CDC活性。

结果显示在图15中。如图15所示，1133(-F)对ST486细胞系(图15A)和Raji细胞系(15B)都显示出比CD20-IgG1(-F)和CD20-IgG3(-F)更高的CDC活性。1113(-F)和1131(-F)显示出比CD20-IgG1(-F)和CD20-IgG3(-F)更高、但是比1133(-F)低的CDC活性。因此，在这些抗体中，了解到CDC活性强度以下面的次序降低：1133(-F)＞1131(-F)＞1113(-F)＞IgG3(-F)＞IgG1(-F)。

根据这些结果，发现通过将人类IgG1抗体的Fc与人类IgG3抗体的Fc交换而增加的1133型抗CD20嵌合同种型抗体的CDC活性，通过用人类IgG1抗体替代人类IgG3抗体Fc中的CH2结构域而大为降低。

上述结果表明，为了增加CDC活性，将人类IgG1抗体的Fc中CH2结构域的氨基酸序列用人类IgG3抗体的氨基酸序列进行交换，有多么重要。

2.测量1113型抗CD20嵌合同种型抗体和1131型抗CD20嵌合同种型抗体对CD20阳性细胞系的ADCC活性

使用在实施例1条目5中获得的抗CD20人类IgG1抗体CD20-IgG1(-F)、抗CD20人类IgG3抗体CD20-IgG3(-F)和1133型抗CD20嵌合同种型抗体1133(-F)，以及在实施例3的条目3中获得的1131型抗CD20嵌合同种型抗体1131(-F)和1113型抗CD20嵌合同种型抗体1113(-F)，按照与实施例2条目5中相同的程序，使用CD20阳性Daudi细胞作为靶细胞，测量体外ADCC活性。在测量中使用Cytotox 96试剂盒(Promega)。

结果显示在图16中。因此，1113(-F)和1131(-F)显示出与CD20-IgG1(-F)和1133(-F)相似的ADCC活性。

3.测量1113型抗CD20嵌合同种型抗体和1131型抗CD20嵌合同种型抗体的蛋白A结合活性

使用在实施例1条目5中获得的抗CD20人类IgG1抗体CD20-IgG1(-F)、抗CD20人类IgG3抗体CD20-IgG3(-F)和1133型抗CD20嵌合同种型抗体1133(-F)，以及在实施例3的条目3中获得的1131型抗CD20嵌合同种型抗体1131(-F)和1113型抗CD20嵌合同种型抗体1113(-F)，按照下面的程序，测量蛋白A的结合活性。

用PBS将抗人类κ链抗体(Sigma制造)稀释到5μg/mL，以50μl/孔分配到96孔ELISA板中(Grainer制造)，使其在室温放置过夜进行吸附。反应后，将板用PBS清洗，加入100μL/孔的1％BSA-PBS，反应在室温进行1小时以阻断剩余的活性基团。然后，移除1％BSA-PBS，加入50μL/孔的各种待测抗CD20抗体，反应在室温进行2小时。在反应完成后，将孔用Tween-PBS清洗，加入50μL/孔用PBS稀释5000倍的过氧化物酶标记的蛋白A(Amersham Bioscience制造)，在37℃进行2小时反应。反应后，将孔用Tween-PBS清洗，加入50μL/孔的ABTS底物溶液进行显色。接下来，测量415nm处的吸光度(在后文中称为OD415)。

结果显示在图17中。1133(-F)和1113(-F)与CD20-IgG3(-F)相似，没有显示出蛋白A结合活性，而1131(-F)与CD20-IgG1(-F)相似，显示出蛋白A结合活性。

表6显示了根据这些结果阐明的这样构建的每种嵌合同种型抗体的结构和活性之间的关系。在该表中，ADCC活性和CDC活性以降序表示成+++++、++++、+++、++和+。对于蛋白A结合活性来说，+表示抗体显示出蛋白A结合活性，而-表示抗体没有显示出蛋白A结合活性。

表6

在实施例4的条目1中，发现了通过将人类IgG1抗体的Fc与人类IgG3抗体的Fc交换而增加的1133型抗CD20嵌合同种型抗体的CDC活性，通过用人类IgG1抗体替代Fc中的CH2结构域而大为降低。该结果表明，为了增加CDC活性，将CH2结构域中Fc的氨基酸序列用人类IgG3抗体的氨基酸序列进行交换，有多么重要。

还表明了，其中CH1和铰链区具有人类IgG1抗体的氨基酸序列、Fc是人类IgG1抗体和人类IgG3抗体的嵌合同种型的抗体的ADCC活性，与人类IgG1抗体相当；由于除去了与Fc连接的糖链的还原末端中N-乙酰葡萄糖胺连接的岩藻糖而导致的其ADCC活性的增加，也与人类IgG1抗体相当。

实施例5

1.使用动物细胞构建各种抗CD20嵌合同种型抗体(CH2结构域中氨基酸序列的分析和1133型抗CD20嵌合同种型抗体的CDC活性)

为了分析人类IgG3抗体的CH2结构域中哪个区对于增加CDC活性是重要的，以下面的方式构建了所具有的1133型的CH2结构域被人类IgG1抗体部分代替的各种抗体

首先，对人类IgG1抗体和人类IgG3抗体中CH2结构域的氨基酸序列进行了比较。按照在Kabat等的EU索引，证实了在274、276、296、300和339位的氨基酸残基是不同的(图18)。因此，设计了其中在1133型抗CD20嵌合同种型抗体中这5个位置上的氨基酸残基被人类IgG1的氨基酸序列中的残基替代的抗体。其中274位氨基酸残基被人类IgG1抗体替代的抗CD20嵌合同种型抗体被称为1133(274-IgG1)型；其中276位氨基酸残基被人类IgG1抗体替代的抗CD20嵌合同种型抗体被称为1133(276-IgG1)型；其中296位氨基酸残基被人类IgG1抗体替代的抗CD20嵌合同种型抗体被称为1133(296-IgG1)型；其中300位氨基酸残基被人类IgG1抗体替代的抗CD20嵌合同种型抗体被称为1133(300-IgG1)型；其中339位氨基酸残基被人类IgG1抗体替代的抗CD20嵌合同种型抗体被称为1133(339-IgG1)型。每个这些抗体的CH3结构域是人类IgG3抗体的CH3结构域。表7显示了这些抗体中上述5个位置处的氨基酸残基(即是人类IgG1抗体的还是人类IgG3抗体的)。

表7

(1)编码1133(274-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建

按照下面的程序构建了编码1133(274-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/1133(274-IgG1)(图19)。首先，使用KODplus(TOYOBO)和具有SEQ ID NOs：12和13所表示的核苷酸序列的合成DNA引物(FASMAC制造)，使用在实施例1中描述的1133型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1133作为模板，按照KODplus随附的说明书，进行PCR。通过该PCR，合成了编码1133(274-IgG1)型嵌合同种型的CH2结构域的基因。使用GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems)，通过在94℃热变性4分钟，然后进行25个循环，每个循环由如下反应组成：94℃30秒、55℃30秒和68℃60秒，进行PCR。在PCR完成后，将反应混合物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)回收含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。将回收的DNA片段用限制性酶BmgBI(New England Biolabs制造)和Bsp1407I(Takara Shuzo制造)消化，切下并纯化含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。另一方面，将实施例1中描述的1133型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1133进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约13kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA混合在一起，使用LigationHigh溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(Applied Biosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了在图19中显示的质粒pKTX93/1133(274-IgG1)。

(2)编码1133(276-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建

按照下面的程序构建编码1133(276-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/1133(276-IgG1)(图19)。首先，使用KOD p1us(TOYOBO)和具有SEQ ID NOs：13和14所表示的核苷酸序列的合成DNA引物(FASMAC制造)，使用在实施例1中描述的1133型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1133作为模板，按照KOD plus随附的说明书，进行PCR。通过该PCR，合成了编码1133(276-IgG1)型嵌合同种型的CH2结构域的基因。使用GeneAmp PCR系统9700(AppliedBiosystems)，通过在94℃热变性4分钟，然后进行25个循环，每个循环由如下反应组成：94℃30秒、55℃30秒和68℃60秒，进行PCR。在PCR完成后，将反应混合物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)回收含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。将回收的DNA片段用限制性酶BmgBI(New England Biolabs制造)和Bsp1407I(Takara Shuzo制造)消化，切下并纯化含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。另一方面，将实施例1中描述的1133型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1133进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约13kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA混合在一起，使用Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(AppliedBiosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了在图19中显示的质粒pKTX93/1133(276-IgG1)。

(3)编码1133(296-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建

按照下面的程序构建编码1133(296-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/1133(296-IgG1)(图19)。首先，使用KOD(TOYOBO)和具有SEQ ID NOs：15和16所表示的核苷酸序列的合成DNA引物(FASMAC制造)，按照KOD随附的说明书，进行PCR。通过该PCR，合成了编码1133(296-IgG1)型嵌合同种型的CH2结构域的基因。使用GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems)，通过在96℃热变性5分钟，然后进行25个循环，每个循环由如下反应组成：96℃30秒、55℃10秒和74℃15秒，而进行PCR。在PCR完成后，将反应混合物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)回收含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。将回收的DNA片段用限制性酶BmgBI(New EnglandBiolabs制造)和Bsp1407I(Takara Shuzo制造)消化，切下并纯化含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。另一方面，将实施例1中描述的1133型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1133进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约13kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA混合在一起，使用Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(AppliedBiosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了在图19中显示的质粒pKTX93/1133(296-IgG1)。

(4)编码1133(300-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建

按照下面的程序构建编码1133(300-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/1133(300-IgG1)(图19)。首先，使用KOD(TOYOBO)和具有SEQ ID NOs：16和17所表示的核苷酸序列的合成DNA引物(FASMAC制造)，按照KOD随附的说明书，进行PCR。通过该PCR，合成了编码1133(300-IgG1)型嵌合同种型的CH2结构域的基因。使用GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems)，通过在96℃热变性5分钟，然后进行25个循环，每个循环由如下反应组成：96℃30秒、55℃10秒和74℃15秒，进行PCR。在PCR完成后，将反应混合物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)回收含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。将回收的DNA片段用限制性酶BmgBI(New England Biolabs制造)和Bsp1407I(Takara Shuzo制造)消化，切下并纯化含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。另一方面，将实施例1中描述的1133型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1133进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约13kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA混合在一起，使用Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(Applied Biosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABIPRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了在图19中显示的质粒pKTX93/1133(300-IgG1)。

(5)编码1133(339-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建

按照下面的程序构建编码1133(339-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/1133(339-IgG1)(图19)。首先，使用KOD plus(TOYOBO)和具有SEQ ID NOs：31和32所表示的核苷酸序列的合成DNA引物(FASMAC制造)，使用在实施例1中描述的1133型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1133作为模板，按照KOD plus随附的说明书，进行PCR。通过该PCR，合成了编码1133(339-IgG1)型嵌合同种型的CH2结构域的基因。使用GeneAmp PCR系统9700(AppliedBiosystems)，通过在94℃热变性4分钟，然后进行25个循环，每个循环由如下反应组成：94℃30秒、55℃30秒和68℃60秒，进行PCR。在PCR完成后，将反应混合物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)回收含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。将回收的DNA片段用限制性酶BmgBI(New England Biolabs制造)和Bsp1407I(Takara Shuzo制造)消化，切下并纯化含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。另一方面，将实施例1中描述的1133型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1133进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约13kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA混合在一起，使用Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(AppliedBiosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了在图19中显示的质粒pKTX93/1133(339-IgG1)。

2.各种抗CD20嵌合同种型抗体在动物细胞中的稳定表达

将本实施例条目1中构建的每种抗CD20嵌合同种型抗体表达载体转化到实施例1条目3中描述的宿主细胞CHO/FUT8^-/^-中，从而通过与实施例1条目3中相同的程序制备能够稳定生产抗CD20嵌合同种型抗体的细胞。

3.各种抗CD20嵌合同种型抗体的纯化

将在本实施例条目2中获得的表达相应的抗CD20嵌合同种型抗体的每种转化体，通过与实施例1条目5中相同的程序进行培养和纯化。每种抗CD20嵌合同种型抗体使用装填有Prosep-G(蛋白G结合树脂；Millipore制造)的柱子进行纯化。

表8显示了对应于每种嵌合同种型抗体的表达载体和纯化抗体的名称。在每种情况下使用CHO/FUT8^-/^-作为宿主细胞。

表8

4.通过SDS-PAGE评估各种纯化的抗CD20嵌合同种型抗体样品的纯化程度

为了评估在本实施例条目3中获得纯化的抗CD20嵌合同种型抗体样品的纯化程度，按照与实施例1条目6中相同的程序进行了SDS-PAGE。为了对电泳进行比较，对在实施例1-5中制备的纯化的CD20-IgG1(-F)和1133(-F)样品、以及在实施例3中制备的纯化的1131(-F)和1113(-F)样品进行了相同方式的处理。

结果显示在图20中。在本实施例条目3中获得的1133(274-IgG1)(-F)、1133(276-IgG1)(-F)、1133(296-IgG1)(-F)、1133(300-IgG1)(-F)和1133(339-IgG1)(-F)，显示出了与CD20-IgG1(-F)、1133(-F)、1131(-F)和1113(-F)相似的电泳图形。从氨基酸序列估算，在本实施例条目3中获得的构成抗CD20嵌合同种型抗体的H链和L链的分子量，彼此相似。也就是说，H链和L链的分子量分别为大约50kDa和大约24kDa。即，这些分子量与CD20-IgG1(-F)、1133(-F)、1131(-F)和1113(-F)的H链和L链的分子量相似，电泳图形也与它们相似。根据这些事实，证实了在本实施例条目3中获得的抗CD20嵌合同种型抗体由H链和L链构成。

根据这些结果，证实了在本实施例条目3中获得的抗CD20嵌合同种型抗体的纯化样品中，含有比例充分的由H链和L链组成的所需IgG分子。

实施例6

测量各种抗CD20嵌合同种型抗体的CDC活性(分析CH2结构域中的氨基酸序列和1133型抗CD20嵌合同种型抗体的CDC活性)：

为了评估在实施例5条目3中获得的各种抗CD20嵌合同种型抗体对CD20阳性细胞系的CDC活性，使用CD20阳性细胞系Raji细胞进行了实施例2条目2中的程序。

结果显示在图21中。如图21所示，1133(-F)显示了最高的CDC活性，CD20-IgG1(-F)显示了最低的CDC活性，1113(-F)的活性在它们之间。这些结果表明，通过将抗CD20人类IgG1抗体的CH2和CH3结构域中的氨基酸序列与人类IgG3抗体的氨基酸序列交换而增加的CDC活性，通过用IgG1型氨基酸序列替代CH2结构域中5个位置上替代的所有IgG3型氨基酸序列，而被大为降低。尽管1133(296-IgG1)(-F)和1133(300-IgG1)(-F)显示出与1133(-F)相当的CDC活性，但1133(274-IgG1)(-F)、1133(276-IgG1)(-F)和1133(339-IgG1)(-F)的CDC活性低于1133(-F)。特别是，1133(276-IgG1)(-F)的CDC活性与1113(-F)相当。表9显示了每种抗体的氨基酸序列与活性之间的关系，其中CDC活性以降序表示为+++++、++++、+++、++和+。

表9

上述结果表明，在由人类IgG1抗体的CH1和铰链区以及人类IgG1抗体和人类IgG3抗体的嵌合同种型的Fc构成的抗体中，为了增加CDC活性，274、276和339位的氨基酸残基优选用IgG3的代替，更优选，276和339位的氨基酸残基用IgG3的代替。

实施例7

1.使用动物细胞构建各种抗CD20嵌合同种型抗体(对CH2结构域中的氨基酸序列和1131型抗CD20嵌合同种型抗体的CDC活性的分析)：

为了更详细地分析CH2结构域中的氨基酸序列与CDC活性之间的关联性，通过用人类IgG1抗体的CH2结构域，部分代替只具有人类IgG3抗体的CH2结构域的1131型抗CD20嵌合同种型抗体的CH2结构域，设计了下面显示的各种抗体。

首先，设计了1131(296/300-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体，其中在1133型中没有观察到CDC活性降低的1131型嵌合同种型抗体的296和300位氨基酸序列，回复到人类IgG1型氨基酸序列。然后，设计了各种嵌合同种型抗体，其中274、276和339位上的氨基酸序列，每个都在1133型中观察到CDC活性降低，将其回复到人类IgG1型氨基酸序列。这些抗体包括1131(274/296/300-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体，其中除了296和300位之外，274位的氨基酸序列也回复成人类IgG1类型；1131(274/276/296/300-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体，其中除了296和300位之外，274和276位的氨基酸序列也回复成人类IgG1类型；1131(274/276/300/339-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体，其中除了296和300位之外，274和339位的氨基酸序列也回复成人类IgG1型；以及1131(276/296/300/339-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体，其中除了296和300位之外，276和339位氨基酸序列也回复成人类IgG1型.

表10显示了这些抗体中上述5个位置上的氨基酸残基(即是人类IgG1抗体还是人类IgG3抗体的)。

表10

上面设计的各种抗CD20嵌合同种型抗体通过下面的程序构建。

(1)编码1131(296/300-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建

按照下面的程序构建编码1131(296/300-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/1131(296/300-IgG1)(图22)。首先，使用KOD plus(TOYOBO)和具有SEQ ID NOs：13和31所表示的核苷酸序列的合成DNA引物(FASMAC制造)，使用pKANTEX2B8P作为模板，按照KOD plus随附的说明书，进行PCR。通过该PCR，合成了编码1131(296/300-IgG1)型嵌合同种型的CH2结构域的基因。使用GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems)，通过在94℃热变性4分钟，然后进行25个循环，每个循环由如下反应组成：94℃30秒、55℃30秒和68℃60秒，进行PCR。在PCR完成后，将反应混合物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)回收含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。将回收的DNA片段用限制性酶BmgBI(New England Biolabs制造)和Bsp 1407I(Takara Shuzo制造)消化，切下并纯化含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。另一方面，将实施例3中描述的1131型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1131进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约13kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA混合在一起，使用Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(Applied Biosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了在图22中显示的质粒pKTX93/1131(296/300-IgG1)。

(2)编码1131(274/296/300-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建

按照下面的程序构建编码1131(274/296/300-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/1131(274/296/300-IgG1)(图22)。首先，使用KOD plus(TOYOBO)和具有SEQ ID NOs：12和13所表示的核苷酸序列的合成DNA引物(FASMAC制造)，使用pKANTEX2B8P作为模板，按照KOD plus随附的说明书，进行PCR。通过该PCR，合成了编码1131(274/296/300-IgG1)型嵌合同种型的CH2结构域的基因。使用GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems)，通过在94℃热变性4分钟，然后进行25个循环、每个循环由如下反应组成：94℃30秒、55℃30秒和68℃60秒，进行PCR。在PCR完成后，将反应混合物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)回收含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。将回收的DNA片段用限制性酶BmgBI(New England Biolabs制造)和Bsp1407I(Takara Shuzo制造)消化，切下并纯化含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。另一方面，将实施例3中描述的1131型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1131进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约13kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA混合在一起，使用Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(Applied Biosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABI PRISM 3700DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了图22中显示的质粒pKTX93/1131(274/296/300-IgG1)。

(3)编码1131(274/276/296/300-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建

按照下面的程序构建编码1131(274/276/296/300-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/1131(274/276/296/300-IgG1)(图22)。首先，使用KOD plus(TOYOBO)和具有SEQ ID NOs：13和38所表示的核苷酸序列的合成DNA引物(FASMAC制造)，使用pKANTEX2B8P作为模板，按照KOD plus随附的说明书，进行PCR。通过该PCR，合成了编码1131(274/276/296/300-IgG1)型嵌合同种型的CH2结构域的基因。使用GeneAmp PCR系统9700(AppliedBiosystems)，通过在94℃热变性4分钟，然后进行25个循环，每个循环由如下反应组成：94℃30秒、55℃30秒和68℃60秒，进行PCR。在PCR完成后，将反应混合物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)回收含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。将回收的DNA片段用限制性酶BmgBI(New England Biolabs制造)和Bsp1407I(Takara Shuzo制造)消化，切下并纯化含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。另一方面，将实施例3中描述的1131型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1131进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约13kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA混合在一起，使用Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(AppliedBiosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了在图22中显示的质粒pKTX93/1131(274/276/296/300-IgG1)。

(4)编码1131(274/296/300/339-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建

按照下面的程序构建编码1131(274/296/300/339-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/1131(274/296/300/339-IgG1)(图22)。首先，使用KOD plus(TOYOBO)和具有SEQ ID NOs：12和32所表示的核苷酸序列的合成DNA引物(FASMAC制造)，使用pKANTEX2B8P作为模板，按照KOD plus随附的说明书，进行PCR。通过该PCR，合成了编码1131(274/296/300/339-IgG1)型嵌合同种型的CH2结构域的基因。使用GeneAmp PCR系统9700(AppliedBiosystems)，通过在94℃热变性4分钟，然后进行25个循环，每个循环由如下反应组成：94℃30秒、55℃30秒和68℃60秒，进行PCR。在PCR完成后，将反应混合物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)回收含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。将回收的DNA片段用限制性酶BmgBI(New England Biolabs制造)和Bsp1407I(Takara Shuzo制造)消化，切下并纯化含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。另一方面，将实施例3中描述的1131型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1131进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约13kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA混合在一起，使用Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(AppliedBiosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了在图22中显示的质粒pKTX93/1131(274/296/300/339-IgG1)。

(5)编码1131(276/296/300/339-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体的构建

按照下面的程序构建编码1131(276/296/300/339-IgG1)型抗CD20嵌合同种型抗体的表达载体pKTX93/1131(276/296/300/339-IgG1)(图22)。首先，使用KOD plus(TOYOBO)和具有SEQ ID NOs：14和32所表示的核苷酸序列的合成DNA引物(FASMAC制造)，使用pKANTEX2B8P作为模板，按照KOD plus随附的说明书，进行PCR。通过该PCR，合成了编码1131(276/296/300/339-IgG1)型嵌合同种型的CH2结构域的基因。使用GeneAmp PCR系统9700(AppliedBiosystems)，通过在94℃热变性4分钟，然后进行25个循环，每个循环由如下反应组成：94℃30秒、55℃30秒和68℃60秒，进行PCR。在PCR完成后，将反应混合物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)回收含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。将回收的DNA片段用限制性酶BmgBI(New England Biolabs制造)和Bsp1407I(Takara Shuzo制造)消化，切下并纯化含有CH2结构域编码基因的大约250bp的DNA片段。另一方面，将实施例3中描述的1131型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1131进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约13kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA混合在一起，使用Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(AppliedBiosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了在图22中显示的质粒pKTX93/1131(276/296/300/339-IgG1)。

2.各种抗CD20嵌合同种型抗体在动物细胞中的稳定表达

将本实施例条目1中构建的每种抗CD20嵌合同种型抗体表达载体转化到实施例1条目3中描述的宿主细胞CHO/FUT8^-/^-中，从而通过与实施例1条目3中相同的程序制备能够稳定生产抗CD20嵌合同种型抗体的细胞。

3.各种抗CD20嵌合同种型抗体的纯化

将在本实施例条目2中获得的表达相应的抗CD20嵌合同种型抗体的每种转化体，通过与实施例1条目5中相同的程序进行培养和纯化。每种抗CD20嵌合同种型抗体使用装填有Prosep-A(蛋白A结合树脂；Millipore制造)的柱子进行纯化。

表11显示了对应于嵌合同种型抗体的表达载体和纯化抗体的名称。在每种情况下都使用CHO/FUT8^-/^-作为宿主细胞。

表11

4.通过SDS-PAGE评估各种纯化的抗CD20嵌合同种型抗体的纯化程度

为了评估在本实施例条目3中获得的纯化的抗CD20嵌合同种型抗体的纯化程度，按照与实施例1条目6中相同的程序进行了SDS-PAGE。

结果显示在图23中。从氨基酸序列估算，在本实施例条目3中获得的构成相应抗CD20嵌合同种型抗体的H链和L链的分子量彼此相近。也就是说，H链和L链的分子量分别为大约50kDa和大约24kDa。即，这些分子量与CD20-IgG1(-F)和1131(-F)的H链和L链的分子量相近，电泳图形也与在实施例4和6中获得的相似。根据这些事实，证实了在本实施例条目3中获得的抗CD20嵌合同种型抗体由所需的H链和L链构成。

根据这些结果，证实了在本实施例条目3中获得的抗CD20嵌合同种型抗体的纯化样品中，含有比例充分的由H链和L链组成的所需IgG分子。

实施例8

测量各种抗CD20嵌合同种型抗体的各种活性(对1131型抗CD20嵌合同种型抗体的CH2结构域中的氨基酸序列和CDC活性的分析)：

如下，对在实施例7条目3中获得的抗CD20嵌合同种型抗体的各种活性进行比较。

1.测量各种抗CD20嵌合同种型抗体的CDC活性

为了评估在实施例7条目3中获得的抗CD20嵌合同种型抗体对CD20阳性细胞系的CDC活性，使用CD20阳性细胞系Raji细胞进行了实施例2条目2中的程序。

结果显示在图24中。如图24所示，1133(-F)显示了最高的CDC活性，CD20-IgG1(-F)显示了最低的CDC活性，1131(-F)的活性略低于1133(-F)。尽管1131(296/300-IgG1)(-F)、1131(274/296/300-IgG1)(-F)和1131(274/276/296/300-IgG1)(-F)显示出与1131(-F)相当或甚至更高的CDC活性，但1131(274/296/300/339-IgG1)(-F)和1131(276/296/300/339-IgG1)(-F)显示出了低于1131(-F)的CDC活性。特别是，1131(276/296/300/399-IgG1)(-F)的CDC活性低，并与IgG3(-F)相似。表12显示了每种抗体的氨基酸序列与CDC活性强度之间的关系，其中CDC活性以降序表示为++++++、+++++、++++、+++、++和+。

表12

这些结果表明，在由人类IgG1抗体氨基酸序列的CH1和铰链区以及人类IgG1抗体和人类IgG3抗体的嵌合同种型的Fc构成的抗体中，为了增加CDC活性，至少276和339位的氨基酸残基优选为人类IgG3的氨基酸残基。

2.测量各种抗CD20嵌合同种型抗体的蛋白A结合活性

在本实施例1条目1中各显示出特别高CDC活性的1131(296/300-IgG1)(-F)、1131(274/296/300-IgG1)(-F)和1131(274/276/296/300-IgG1)(-F)的蛋白A结合活性，按照实施例4条目3进行测定。

结果显示在图25中。如图25所示，1131(296/300-IgG1)(-F)、1131(274/296/300-IgG1)(-F)和1131(274/276/296/300-IgG1)(-F)显示出与CD20-IgG1(-F)和1131(-F)相似的蛋白A结合活性。这些结果表明，嵌合同种型抗体的蛋白A结合活性，不受IgG3型同种型抗体的276和/或339位处氨基酸序列的影响。

根据这些结果发现，在由人类IgG1抗体氨基酸序列的CH1和铰链区以及人类IgG1抗体和人类IgG3抗体的嵌合同种型的Fc构成、具有蛋白A结合活性的抗体中，为了增加CDC活性，276和339位氨基酸残基优选分别为赖氨酸和苏氨酸，它们是人类IgG3型的氨基酸残基。

实施例9

使用动物细胞构建抗Campath人类IgG1抗体、1133型抗Campath嵌合同种型抗体和1131型抗Campath嵌合同种型抗体：

1.各种载体的构建

根据实施例2和4的结果，发现通过用人类IgG3的氨基酸序列交换抗CD20人类IgG1抗体的CH2或Fc，CDC活性增加。为了证实在针对另一种抗原的抗体中CDC活性增加，构建了人源化抗Campath抗体Campath-1H的人类IgG1、1133型和1131型抗体，并对CDC活性进行了比较。

(1)编码1133型抗Campath嵌合同种型抗体基因序列的表达载体的构建

按照下面的程序，构建了编码1133型抗Campath嵌合同种型抗体的表达载体(图26)，该抗体特异性识别人类Campath抗原(CD52)，并在CH1和铰链区中具有人类IgG1氨基酸序列，在CH2和CH3中具有人类IgG3氨基酸序列。

首先，从国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation，NCBI)数据库获得人源化抗Campath抗体Campath-1H的重链可变区(登记号S79311)和轻链可变区(登记号S79307)的氨基酸序列和基因序列。人源化抗Campath抗体Campath-1H的重链可变区的氨基酸序列和基因序列分别由SEQ ID NOs：39和40表示，人源化抗Campath抗体Campath-1H的轻链可变区的氨基酸序列和基因序列分别由SEQ ID NOs：41和42表示。根据这些序列数据，设计了SEQ IDNO：43表示的1133型抗Campath嵌合同种型抗体重链的氨基酸序列，其含有人源化抗Campath抗体Campath-1H的重链可变区和1133型嵌合同种型重链恒定区，以及SEQ ID NO：44表示的抗Campath抗体的轻链的氨基酸序列，其含有人源化抗Campath抗体Campath-1H的轻链可变区和人类抗体轻链恒定区序列。

接下来，设计了SEQ ID NO：45所表示的核苷酸序列。在该核苷酸序列中，限制性酶NotI识别序列被加到SEQ ID NO：40显示的人源化抗Campath抗体Campath-1H重链可变区基因序列的5′-末端侧，而另一个限制性酶ApaI识别序列被添加到其3′-末端侧。根据SEQ ID NO：45所表示的核苷酸序列，分别设计了SEQ ID NOs：46、47、48和49所表示的核苷酸序列。这些核苷酸序列的设计是通过将SEQ ID NO：45所表示的核苷酸序列分成4个部分，使得互相毗邻的序列具有大约20bp的交叠序列，并以交互的次序设计正义链和反义链。

在实践中，制备了具有SEQ ID NOs：46、47、48和49所表示的核苷酸序列的合成寡聚DNAs(FASMAC制造)，并使用它进行PCR。为了将位于两个末端的两种合成寡聚DNAs中的每一种的终浓度调整到0.5μM，位于内部的两种合成寡聚DNAs中的每一种的终浓度调整到0.1μM，制备了PCR溶液[0.02U/μl KOD+DNA聚合酶(TOYOBO制造)，0.2mM dNTPs，1mM硫酸镁，1/10体积稀释10倍的PCR缓冲液(TOYOBO制造，KOD DNA聚合酶附带)]。使用DNA热循环仪GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems制造)，通过在94℃热变性4分钟，然后进行25个循环，每个循环由如下反应组成：94℃30秒、50℃30秒和68℃60秒，进行PCR。在PCR完成后，将反应混合物在琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)回收大约480bp的PCR产物。将这样回收的PCR产物用限制性酶NotI(Takara Shuzo制造)和ApaI(Takara Shuzo制造)消化，将反应混合物在琼脂糖凝胶上进行电泳。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)，切下并纯化大约450bp的DNA片段。另一方面，将实施例1中构建的1133型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1133进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约13kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA混合在一起，加入Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(AppliedBiosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了1133型嵌合同种型表达载体，其中重链可变区被编码抗Campath人源化抗体Campath-1H重链可变区的核苷酸序列替代。

接下来，设计了SEQ ID NO：50所表示的核苷酸序列。在该核苷酸序列中，限制性酶EcoRI识别序列被加到SEQ ID NO：42显示的人源化抗Campath抗体Campath-1H轻链可变区基因序列的5′-末端一侧，另一个限制性酶BsiWI识别序列被添加到其3′-末端一侧。根据SEQ IDNO：50所表示的核苷酸序列，分别设计了SEQ ID NOs：51、52、53和54所表示的核苷酸序列。这些核苷酸序列的设计是通过将SEQ IDNO：50所表示的核苷酸序列分成4个部分，使得互相毗邻的序列具有大约20bp的交叠序列，并以交互的次序设计正义链和反义链。使用这4种合成的寡聚DNAs，进行PCR以扩增具有SEQ ID NO：50显示的核苷酸序列的DNA片段。

在实践中，制备了具有SEQ ID NOs：51、52、53和54所表示的核苷酸序列的合成寡聚DNAs(FASMAC制造)，并使用它进行PCR。为了将位于两个末端的两种合成寡聚DNAs中的每一种的终浓度调整到0.5μM，而位于内部的两种合成寡聚DNAs中的每一种的终浓度调整到0.1μM，制备了PCR溶液[0.02U/μl KOD+DNA聚合酶(TOYOBO制造)，0.2mM dNTPs，1mM硫酸镁，1/10体积稀释10倍的PCR缓冲液(TOYOBO制造，KOD DNA聚合酶附带)]。使用DNA热循环仪GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems制造)，通过在94℃热变性4分钟，然后进行25个循环，每个循环由如下反应组成：94℃30秒、50℃30秒和68℃60秒，进行PCR。在PCR完成后，将反应混合物在琼脂糖凝胶上进行电泳，使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)回收大约420bp的PCR产物。将这样回收的PCR产物用限制性酶EcoRI(Takara Shuzo制造)和BsiWII(TOYOBO制造)消化，将反应混合物在琼脂糖凝胶上进行电泳。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)，切下并纯化大约400bp的DNA片段。另一方面，本文中构建的1133型嵌合同种型表达载体，其中重链可变区被编码人源化抗Campath抗体Campath-1H重链可变区的核苷酸序列替代，对其进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约13kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA片段混合在一起，加入Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(AppliedBiosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了1133型抗Campath嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/Campath1H-1133。

(2)编码抗Campath人类IgG1抗体基因序列的表达载体的构建

通过下面的程序构建了编码特异性识别人类Campath抗原(CD52)的抗Campath人类IgG1抗体的表达载体，该抗体中重链恒定区具有人类IgG1的氨基酸序列(图27)。

将这里构建的1133型抗Campath抗体表达载体pKTX93/Campath1H-1133，用EcoRI(Takara Shuzo制造)和另一种限制性酶ApaI(Takara Shuzo制造)进行消化，将反应混合物在琼脂糖凝胶上进行电泳。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)，切下并纯化大约3300bp的DNA片段。另一方面，对于抗CD20人源化嵌合抗体表达载体pKANTEX2B8P进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约10kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA混合在一起，加入Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(Applied Biosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABI PRISM 3700 DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了抗Campath人类IgG1抗体表达载体pKTX93/Campath1H-IgG1。

(3)编码1131型抗Campath抗体基因序列的表达载体的构建

通过下面的程序构建编码特异性识别人类Campath抗原(CD52)的1131型抗Campath嵌合同种型抗体的表达载体，在该抗体重链恒定区的氨基酸序列中，CH1和铰链区具有人类IgG1的氨基酸序列，CH2具有人类IgG3的氨基酸序列，CH3具有人类IgG1的氨基酸序列(图28)。

将本实施例条目1中构建的1133型抗Campath抗体表达载体pKTX93/Campath1H-1133，用EcoRI(Takara Shuzo制造)和另一种限制性酶ApaI(Takara Shuzo制造)进行消化，将反应混合物在琼脂糖凝胶上进行电泳。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen制造)，切下并纯化大约3300bp的DNA片段。另一方面，对在实施例3中构建的1131型抗CD20嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/1131进行同样的限制性酶处理，切下并纯化大约10kbp的DNA片段。将这些纯化的DNA混合在一起，加入Ligation High溶液(TOYOBO制造)进行连接反应。使用反应混合物转化大肠杆菌XL1-BLUE MRF′(Stratagene制造)。从这样获得的转化体的克隆制备每种质粒DNA。在使用Big Dye终止剂循环测序试剂盒v3.1(Applied Biosystems制造)按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司制造的DNA测序仪ABI PRISM 3700DNA分析仪，对插入到每种质粒中的DNA的核苷酸序列进行分析。从而证实获得了1131型抗Campath嵌合同种型抗体表达载体pKTX93/Campath1H-1131。

2.各种抗Campath抗体在动物细胞中的稳定表达

按照实施例1条目3中的描述，将在本实施例条目1中构建的每种抗Campath抗体表达载体转化到宿主细胞CHO/FUT8^-/^-中，因此通过与实施例1条目3中相同的程序制备了能够稳定生产抗Campath抗体的细胞。

3.各种抗Campath抗体的纯化

通过与实施例1条目5中相同的程序，对每种在本实施例条目2中获得的表达相应抗Campath嵌合同种型抗体的转化体，进行培养和纯化。抗Campath人类IgG1抗体和1131型抗Campath嵌合同种型抗体使用装填有Prosep-A(蛋白A结合树脂，Millipore制造)的柱子进行纯化。1133型抗Campath嵌合同种型抗体使用装填有Prosep-G(蛋白G结合树脂，Millipore制造)的柱子进行纯化。

表8显示了对应于嵌合同种型抗体的表达载体和纯化抗体的名称。在每种情况下，使用CHO/FUT8^-/^-作为宿主细胞。

表13

4.通过SDS-PAGE评估各种纯化的抗Campath抗体样品的纯化程度

为了评估在本实施例条目3中获得的修饰的抗体的纯化样品的纯化程度，通过与实施例1条目6中相同的程序进行了SDS-PAGE。作为结果，证实了在本实施例条目3中获得的抗CD20嵌合同种型抗体的纯化样品中，含有足够比例的由H链和L链构成的所需IgG分子。

实施例10

测量各种抗Campath抗体的CDC活性：

为了评估在实施例9条目3中获得的抗Campath人类IgG1抗体和1131型抗Campath嵌合同种型抗体的纯化样品，对Campath抗原阳性的人类慢性B细胞白血病细胞系MEC-1(DSMZ：ACC497)、MEC-2(DSMZ：ACC500)和EHEB(DSMZ：ACC67)的CDC活性，进行了实施例2条目2中的程序。结果显示在图29中。在每种细胞系MEC-1、MEC-2和EHEB上，Campath1H-1131(-F)显示出比Campath1H-IgG(-F)更高的CDC活性。当以相同的方式测试1133型抗Campath嵌合同种型抗体的纯化样品时，在每种细胞系MEC-1、MEC-2和EHEB上，Campath1H-1133(-F)显示出比Campath1H-IgG(-F)更高的CDC活性。

这些结果表明，与抗CD20抗体相似，在由人类IgG1抗体的氨基酸序列的CH1和铰链区与人类IgG1抗体和人类IgG3抗体的嵌合同种型的Fc构成的抗Campath抗体中，在Fc区中氨基酸序列与人类IgG3抗体的氨基酸序列的交换对于增加CDC活性是重要的部分，位于CH2结构域中。

工业实用性

本发明涉及重组抗体组合物，它是人类IgG1抗体，含有CH2结构域，该结构域中由Kabat等中的EU索引指示的276位和339位氨基酸被其它氨基酸替代，并且与含有氨基酸被替代前的CH2结构域的抗体相比，具有进一步改进的补体依赖性细胞毒性活性；包含在重组抗体组合物中的抗体分子或抗体分子的重链恒定区的编码DNA；通过将DNA导入宿主细胞可获得的转化体；使用转化体生产重组抗体组合物的方法；以及含有重组抗体组合物作为活性成分的药物。

序列列表中的自由文本：

SEQ ID NO：1-人工序列描述：合成的DNA

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SEQ ID NO：52-人工序列描述：合成的DNA

SEQ ID NO：53-人工序列描述：合成的DNA

SEQ ID NO：54-人工序列描述：合成的DNA

序列表

<110>协和发酵麒麟株式会社(KYOWA HAKKO KOGYO CO.，LTD.)

<120>具有增强的效应子活性的遗传重组抗体组合物(EFFECTOR FUNCTION ENHANCEDRECOMBINANT ANTIBODY COMPOSITION)

<130>SCT092885-00

<150>JP2007-013640

<151>2007-01-24

<160>54

<170>PatentIn Ver.2

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>1

caaaggtacc caagggccca tcggtcttcc                                    30

<210>2

<211>45

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>2

gtttggatcc tcgcgagtcg cactcattta cccggagaca gggag                   45

<210>3

<211>330

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic Peptide

<400>3

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225                 230                 235                 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>4

<211>377

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic Peptide

<400>4

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro

            100                 105                 110

Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg

        115                 120                 125

Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys

    130                 135                 140

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

145                 150                 155                 160

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

                165                 170                 175

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

            180                 185                 190

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

        195                 200                 205

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

    210                 215                 220

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

225                 230                 235                 240

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

                245                 250                 255

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

            260                 265                 270

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

        275                 280                 285

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

    290                 295                 300

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

305                 310                 315                 320

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

                325                 330                 335

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

            340                 345                 350

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

        355                 360                 365

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

    370                 375

<210>5

<211>330

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic Peptide

<400>5

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225                 230                 235                 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>6

<211>330

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic Peptide

<400>6

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225                 230                 235                 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>7

<211>330

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic Peptide

<400>7

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Lys Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225                 230                 235                 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>8

<211>330

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic Peptide

<400>8

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225                 230                 235                 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>9

<211>330

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic Peptide

<400>9

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225                 230                 235                 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>10

<211>330

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic Peptide

<400>10

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225                 230                 235                 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>11

<211>330

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic Peptide

<400>11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phc Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225                 230                 235                 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>12

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>12

cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtcaag ttcaagtggt acgtgg     56

<210>13

<211>71

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>13

catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta cacctgtggt tctcggggct gtcctttggt 60

tttggagatg g                                                      71

<210>14

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>14

cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaactggt acgtgg     56

<210>15

<211>158

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>15

cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaagtggt acgtggacgg 60

cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgttccg 120

tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggc                         158

<210>16

<211>155

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic Peptide

<400>16

catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta cacctgtggt tctcggggct gtcctttggt 60

tttggagatg gttttctcga tgggggctgg gagggctttg ttggagacct tgcacttgta 120

ctccttgccg ttcagccagt cctggtgcag gacgg                            155

<210>17

<211>158

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>17

cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaagtggt acgtggacgg 60

cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagttcaaca gcacgtaccg 120

tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggc                         158

<210>18

<211>1504

<212>DNA

<213>Cricetulus griseus

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1119)

<400>18

atg gct cac gct ccc gct agc tgc ccg agc tcc agg aac tct ggg gac   48

Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp

  1               5                  10                  15

ggc gat aag ggc aag ccc agg aag gtg gcg ctc atc acg ggc atc acc    96

Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr

             20                  25                  30

ggc cag gat ggc tca tac ttg gca gaa ttc ctg ctg gag aaa gga tac    144

Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr

         35                  40                  45

gag gtt cat gga att gta cgg cga tcc agt tca ttt aat aca ggt cga    192

Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg

     50                  55                  60

att gaa cat tta tat aag aat cca cag gct cat att gaa gga aac atg    240

Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met

 65                  70                  75                  80

aag ttg cac tat ggt gac ctc acc gac agc acc tgc cta gta aaa atc    288

Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile

                 85                  90                  95

atc aat gaa gtc aaa cct aca gag atc tac aat ctt ggt gcc cag agc    336

Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser

            100                 105                 110

cat gtc aag att tcc ttt gac tta gca gag tac act gca gat gtt gat    384

His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp

        115                 120                 125

gga gtt ggc acc ttg cgg ctt ctg gat gca att aag act tgt ggc ctt    432

Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu

    130                 135                 140

ata aat tct gtg aag ttc tac cag gcc tca act agt gaa ctg tat gga    480

Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly

145                 150                 155                 160

aaa gtg caa gaa ata ccc cag aaa gag acc acc cct ttc tat cca agg    528

Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg

                165                 170                 175

tcg ccc tat gga gca gcc aaa ctt tat gcc tat tgg att gta gtg aac    576

Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn

            180                 185                 190

ttt cga gag gct tat aat ctc ttt gcg gtg aac ggc att ctc ttc aat    624

Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn

        195                 200                 205

cat gag agt cct aga aga gga gct aat ttt gtt act cga aaa att agc    672

His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser

    210                 215                 220

cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc agt ttg    720

Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu

225                 230                 235                 240

gga aat ctg gac gcc aaa cga gac tgg ggc cat gcc aag gac tat gtc    768

Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val

                245                 250                 255

gag gct atg tgg ctg atg tta caa aat gat gaa cca gag gac ttt gtc    816

Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val

            260                 265                 270

ata gct act ggg gaa gtt cat agt gtc cgt gaa ttt gtt gag aaa tca    864

Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser

        275                 280                 285

ttc atg cac att gga aag acc att gtg tgg gaa gga aag aat gaa aat    912

Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn

    290                 295                 300

gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa att cat gtg act gtg gat    960

Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp

305                 310                 315                 320

ctg aaa tac tac cga cca act gaa gtg gac ttc ctg cag gga gac tgc    1008

Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys

                325                 330                 335

tcc aag gcg cag cag aaa ctg aac tgg aag ccc cgc gtt gcc ttt gac    1056

Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp

            340                 345                 350

gag ctg gtg agg gag atg gtg caa gcc gat gtg gag ctc atg aga acc    1104

Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr

        355                 360                 365

aac ccc aac gcc tga gcacctctac aaaaaaattc gcgagacatg gactatggtg    1159

Asn Pro Asn Ala

    370

cagagccagc caaccagagt ccagccactc ctgagaccat cgaccataaa ccctcgactg  1219

cctgtgtcgt ccccacagct aagagctggg ccacaggttt gtgggcacca ggacggggac  1279

actccagagc taaggccact tcgcttttgt caaaggctcc tctcaatgat tttgggaaat  1339

caagaagttt aaaatcacat actcatttta cttgaaatta tgtcactaga caacttaaat  1399

ttttgagtct tgagattgtt tttctctttt cttattaaat gatctttcta tgacccagca  1459

aaaaaaaaaa aaaaaaggga tataaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa                  1504

<210>19

<211>372

<212>PRT

<213>Cricetulus griseus

<400>19

Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp

  1               5                  10                  15

Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr

             20                  25                  30

Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr

         35                  40                  45

Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg

     50                  55                  60

Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met

 65                  70                  75                  80

Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile

                 85                  90                  95

Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser

            100                 105                 110

His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp

        115                 120                 125

Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu

    130                 135                 140

Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly

145                 150                 155                 160

Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg

                165                 170                 175

Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn

            180                 185                 190

Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn

        195                 200                 205

His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser

    210                 215                 220

Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu

225                 230                 235                 240

Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val

                245                 250                 255

Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val

            260                 265                 270

Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser

        275                 280                 285

Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn

    290                 295                 300

Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp

305                 310                 315                 320

Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys

                325                 330                 335

Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp

            340                 345                 350

Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr

        355                 360                 365

Asn Pro Asn Ala

    370

<210>20

<211>1316

<212>DNA

<213>Cricetulus griseus

<400>20

gccccgcccc ctccacctgg accgagagta gctggagaat tgtgcaccgg aagtagctct 60

tggactggtg gaaccctgcg caggtgcagc aacaatgggt gagccccagg gatccaggag 120

gatcctagtg acagggggct ctggactggt gggcagagct atccagaagg tggtcgcaga 180

tggcgctggc ttacccggag aggaatgggt gtttgtctcc tccaaagatg cagatctgac 240

ggatgcagca caaacccaag ccctgttcca gaaggtacag cccacccatg tcatccatct 300

tgctgcaatg gtaggaggcc ttttccggaa tatcaaatac aacttggatt tctggaggaa 360

gaatgtgcac atcaatgaca acgtcctgca ctcagctttc gaggtgggca ctcgcaaggt 420

ggtctcctgc ctgtccacct gtatcttccc tgacaagacc acctatccta ttgatgaaac 480

aatgatccac aatggtccac cccacagcag caattttggg tactcgtatg ccaagaggat 540

gattgacgtg cagaacaggg cctacttcca gcagcatggc tgcaccttca ctgctgtcat 600

ccctaccaat gtctttggac ctcatgacaa cttcaacatt gaagatggcc atgtgctgcc 660

tggcctcatc cataaggtgc atctggccaa gagtaatggt tcagccttga ctgtttgggg 720

tacagggaaa ccacggaggc agttcatcta ctcactggac ctagcccggc tcttcatctg 780

ggtcctgcgg gagtacaatg aagttgagcc catcatcctc tcagtgggcg aggaagatga 840

agtctccatt aaggaggcag ctgaggctgt agtggaggcc atggacttct gtggggaagt 900

cacttttgat tcaacaaagt cagatgggca gtataagaag acagccagca atggcaagct 960

tcgggcctac ttgcctgatt tccgtttcac acccttcaag caggctgtga aggagacctg 1020

tgcctggttc accgacaact atgagcaggc ccggaagtga agcatgggac aagcgggtgc 1080

tcagctggca atgcccagtc agtaggctgc agtctcatca tttgcttgtc aagaactgag 1140

gacagtatcc agcaacctga gccacatgct ggtctctctg ccagggggct tcatgcagcc 1200

atccagtagg gcccatgttt gtccatcctc gggggaaggc cagaccaaca ccttgtttgt 1260

ctgcttctgc cccaacctca gtgcatccat gctggtcctg ctgtcccttg tctaga     1316

<210>21

<211>321

<212>PRT

<213>Cricetulus griseus

<400>21

Met Gly Glu Pro Gln Gly Ser Arg Arg Ile Leu Val Thr Gly Gly Ser

  1               5                  10                  15

Gly Leu Val Gly Arg Ala Ile Gln Lys Val Val Ala Asp Gly Ala Gly

             20                  25                  30

Leu Pro Gly Glu Glu Trp Val Phe Val Ser Ser Lys Asp Ala Asp Leu

         35                  40                  45

Thr Asp Ala Ala Gln Thr Gln Ala Leu Phe Gln Lys Val Gln Pro Thr

     50                  55                  60

His Val Ile His Leu Ala Ala Met Val Gly Gly Leu Phe Arg Asn Ile

 65                  70                  75                  80

Lys Tyr Asn Leu Asp Phe Trp Arg Lys Asn Val His Ile Asn Asp Asn

                 85                  90                  95

Val Leu His Ser Ala Phe Glu Val Gly Thr Arg Lys Val Val Ser Cys

            100                 105                 110

Leu Ser Thr Cys Ile Phe Pro Asp Lys Thr Thr Tyr Pro Ile Asp Glu

        115                 120                 125

Thr Met Ile His Asn Gly Pro Pro His Ser Ser Asn Phe Gly Tyr Ser

    130                 135                 140

Tyr Ala Lys Arg Met Ile Asp Val Gln Asn Arg Ala Tyr Phe Gln Gln

145                 150                 155                 160

His Gly Cys Thr Phe Thr Ala Val Ile Pro Thr Asn Val Phe Gly Pro

                165                 170                 175

His Asp Asn Phe Asn Ile Glu Asp Gly His Val Leu Pro Gly Leu Ile

            180                 185                 190

His Lys Val His Leu Ala Lys Ser Asn Gly Ser Ala Leu Thr Val Trp

        195                 200                 205

Gly Thr Gly Lys Pro Arg Arg Gln Phe Ile Tyr Ser Leu Asp Leu Ala

    210                 215                 220

Arg Leu Phe Ile Trp Val Leu Arg Glu Tyr Asn Glu Val Glu Pro Ile

225                 230                 235                 240

Ile Leu Ser Val Gly Glu Glu Asp Glu Val Ser Ile Lys Glu Ala Ala

                245                 250                 255

Glu Ala Val Val Glu Ala Met Asp Phe Cys Gly Glu Val Thr Phe Asp

            260                 265                 270

Ser Thr Lys Ser Asp Gly Gln Tyr Lys Lys Thr Ala Ser Asn Gly Lys

        275                 280                 285

Leu Arg Ala Tyr Leu Pro Asp Phe Arg Phe Thr Pro Phe Lys Gln Ala

    290                 295                 300

Val Lys Glu Thr Cys Ala Trp Phe Thr Asp Asn Tyr Glu Gln Ala Arg

305                 310                 315                 320

Lys

<210>22

<211>2008

<212>DNA

<213>Cricetulus griseus

<400>22

aacagaaact tattttcctg tgtggctaac tagaaccaga gtacaatgtt tccaattctt  60

tgagctccga gaagacagaa gggagttgaa actctgaaaa tgcgggcatg gactggttcc  120

tggcgttgga ttatgctcat tctttttgcc tgggggacct tattgtttta tataggtggt 180

catttggttc gagataatga ccaccctgac cattctagca gagaactctc caagattctt 240

gcaaagctgg agcgcttaaa acaacaaaat gaagacttga ggagaatggc tgagtctctc 300

cgaataccag aaggccctat tgatcagggg acagctacag gaagagtccg tgttttagaa 360

gaacagcttg ttaaggccaa agaacagatt gaaaattaca agaaacaagc taggaatgat 420

ctgggaaagg atcatgaaat cttaaggagg aggattgaaa atggagctaa agagctctgg 480

ttttttctac aaagtgaatt gaagaaatta aagaaattag aaggaaacga actccaaaga 540

catgcagatg aaattctttt ggatttagga catcatgaaa ggtctatcat gacagatcta 600

tactacctca gtcaaacaga tggagcaggt gagtggcggg aaaaagaagc caaagatctg 660

acagagctgg tccagcggag aataacatat ctgcagaatc ccaaggactg cagcaaagcc 720

agaaagctgg tatgtaatat caacaaaggc tgtggctatg gatgtcaact ccatcatgtg 780

gtttactgct tcatgattgc ttatggcacc cagcgaacac tcatcttgga atctcagaat 840

tggcgctatg ctactggagg atgggagact gtgtttagac ctgtaagtga gacatgcaca 900

gacaggtctg gcctctccac tggacactgg tcaggtgaag tgaaggacaa aaatgttcaa 960

gtggtcgagc tccccattgt agacagcctc catcctcgtc ctccttactt acccttggct 1020

gtaccagaag accttgcaga tcgactcctg agagtccatg gtgatcctgc agtgtggtgg 1080

gtatcccagt ttgtcaaata cttgatccgt ccacaacctt ggctggaaag ggaaatagaa 1140

gaaaccacca agaagcttgg cttcaaacat ccagttattg gagtccatgt cagacgcact 1200

gacaaagtgg gaacagaagc agccttccat cccattgagg aatacatggt acacgttgaa 1260

gaacattttc agcttctcga acgcagaatg aaagtggata aaaaaagagt gtatctggcc 1320

actgatgacc cttctttgtt aaaggaggca aagacaaagt actccaatta tgaatttatt 1380

agtgataact ctatttcttg gtcagctgga ctacacaacc gatacacaga aaattcactt 1440

cggggcgtga tcctggatat acactttctc tcccaggctg acttccttgt gtgtactttt 1500

tcatcccagg tctgtagggt tgcttatgaa atcatgcaaa cactgcatcc tgatgcctct 1560

gcaaacttcc attctttaga tgacatctac tattttggag gccaaaatgc ccacaaccag 1620

attgcagttt atcctcacca acctcgaact aaagaggaaa tccccatgga acctggagat 1680

atcattggtg tggctggaaa ccattggaat ggttactcta aaggtgtcaa cagaaaacta 1740

ggaaaaacag gcctgtaccc ttcctacaaa gtccgagaga agatagaaac agtcaaatac 1800

cctacatatc ctgaagctga aaaatagaga tggagtgtaa gagattaaca acagaattta 1860

gttcagacca tctcagccaa gcagaagacc cagactaaca tatggttcat tgacagacat 1920

gctccgcacc aagagcaagt gggaaccctc agatgctgca ctggtggaac gcctctttgt 1980

gaagggctgc tgtgccctca agcccatg                                    2008

<210>23

<211>1728

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>23

atgcgggcat ggactggttc ctggcgttgg attatgctca ttctttttgc ctgggggacc 60

ttgttatttt atataggtgg tcatttggtt cgagataatg accaccctga tcactccagc 120

agagaactct ccaagattct tgcaaagctt gaacgcttaa aacagcaaaa tgaagacttg 180

aggcgaatgg ctgagtctct ccgaatacca gaaggcccca ttgaccaggg gacagctaca 240

ggaagagtcc gtgttttaga agaacagctt gttaaggcca aagaacagat tgaaaattac 300

aagaaacaag ctagaaatgg tctggggaag gatcatgaaa tcttaagaag gaggattgaa 360

aatggagcta aagagctctg gttttttcta caaagcgaac tgaagaaatt aaagcattta 420

gaaggaaatg aactccaaag acatgcagat gaaattcttt tggatttagg acaccatgaa 480

aggtctatca tgacagatct atactacctc agtcaaacag atggagcagg ggattggcgt 540

gaaaaagagg ccaaagatct gacagagctg gtccagcgga gaataacata tctccagaat 600

cctaaggact gcagcaaagc caggaagctg gtgtgtaaca tcaataaagg ctgtggctat 660

ggttgtcaac tccatcacgt ggtctactgt ttcatgattg cttatggcac ccagcgaaca 720

ctcatcttgg aatctcagaa ttggcgctat gctactggtg gatgggagac tgtgtttaga 780

cctgtaagtg agacatgtac agacagatct ggcctctcca ctggacactg gtcaggtgaa 840

gtaaatgaca aaaacattca agtggtcgag ctccccattg tagacagcct ccatcctcgg 900

cctccttact taccactggc tgttccagaa gaccttgcag accgactcct aagagtccat 960

ggtgaccctg cagtgtggtg ggtgtcccag tttgtcaaat acttgattcg tccacaacct 1020

tggctggaaa aggaaataga agaagccacc aagaagcttg gcttcaaaca tccagttatt 1080

ggagtccatg tcagacgcac agacaaagtg ggaacagaag cagccttcca ccccatcgag 1140

gagtacatgg tacacgttga agaacatttt cagcttctcg cacgcagaat gcaagtggat 1200

aaaaaaagag tatatctggc tactgatgat cctactttgt taaaggaggc aaagacaaag 1260

tactccaatt atgaatttat tagtgataac tctatttctt ggtcagctgg actacacaat 1320

cggtacacag aaaattcact tcggggtgtg atcctggata tacactttct ctcacaggct 1380

gactttctag tgtgtacttt ttcatcccag gtctgtcggg ttgcttatga aatcatgcaa 1440

accctgcatc ctgatgcctc tgcgaacttc cattctttgg atgacatcta ctattttgga 1500

ggccaaaatg cccacaatca gattgctgtt tatcctcaca aacctcgaac tgaagaggaa 1560

attccaatgg aacctggaga tatcattggt gtggctggaa accattggga tggttattct 1620

aaaggtatca acagaaaact tggaaaaaca ggcttatatc cctcctacaa agtccgagag 1680

aagatagaaa cagtcaagta tcccacatat cctgaagctg aaaaatag              1728

<210>24

<211>575

<212>PRT

<213>Cricetulus griseus

<400>24

Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe

  1               5                  10                  15

Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp

             20                  25                  30

Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala

         35                  40                  45

Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala

     50                  55                  60

Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr

 65                  70                  75                  80

Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln

                 85                  90                  95

Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Asp Leu Gly Lys Asp His

            100                 105                 110

Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe

        115                 120                 125

Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Glu Gly Asn Glu

    130                 135                 140

Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu

145                 150                 155                 160

Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala

                165                 170                 175

Gly Glu Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln

            180                 185                 190

Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg

        195                 200                 205

Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu

    210                 215                 220

His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr

225                 230                 235                 240

Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu

                245                 250                 255

Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu

            260                 265                 270

Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val Gln Val

        275                 280                 285

Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu

    290                 295                 300

Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His

305                 310                 315                 320

Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile

                325                 330                 335

Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Arg Glu Ile Glu Glu Thr Thr Lys Lys

            340                 345                 350

Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp

        355                 360                 365

Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val

    370                 375                 380

His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Glu Arg Arg Met Lys Val Asp

385                 390                 395                 400

Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu

                405                 410                 415

Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile

            420                 425                 430

Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg

        435                 440                 445

Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val

    450                 455                 460

Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln

465                 470                 475                 480

Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile

                485                 490                 495

Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro

            500                 505                 510

His Gln Pro Arg Thr Lys Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile

        515                 520                 525

Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asn Gly Tyr Ser Lys Gly Val Asn

    530                 535                 540

Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu

545                 550                 555                 560

Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys

                565                 570                 575

<210>25

<211>575

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>25

Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe

  1               5                  10                  15

Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp

             20                  25                  30

Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala

         35                  40                  45

Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala

     50                  55                  60

Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr

 65                  70                  75                  80

Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln

                 85                  90                  95

Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Gly Leu Gly Lys Asp His

            100                 105                 110

Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe

        115                 120                 125

Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys His Leu Glu Gly Asn Glu

    130                 135                 140

Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu

145                 150                 155                 160

Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala

                165                 170                 175

Gly Asp Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln

            180                 185                 190

Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg

        195                 200                 205

Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu

    210                 215                 220

His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr

225                 230                 235                 240

Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu

                245                 250                 255

Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu

            260                 265                 270

Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Asn Asp Lys Asn Ile Gln Val

        275                 280                 285

Val Glu Leu Pro Ile Val Asp Ser Leu His Pro Arg Pro Pro Tyr Leu

    290                 295                 300

Pro Leu Ala Val Pro Glu Asp Leu Ala Asp Arg Leu Leu Arg Val His

305                 310                 315                 320

Gly Asp Pro Ala Val Trp Trp Val Ser Gln Phe Val Lys Tyr Leu Ile

                325                 330                 335

Arg Pro Gln Pro Trp Leu Glu Lys Glu Ile Glu Glu Ala Thr Lys Lys

            340                 345                 350

Leu Gly Phe Lys His Pro Val Ile Gly Val His Val Arg Arg Thr Asp

        355                 360                 365

Lys Val Gly Thr Glu Ala Ala Phe His Pro Ile Glu Glu Tyr Met Val

    370                 375                 380

His Val Glu Glu His Phe Gln Leu Leu Ala Arg Arg Met Gln Val Asp

385                 390                 395                 400

Lys Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Thr Leu Leu Lys Glu

                405                 410                 415

Ala Lys Thr Lys Tyr Ser Asn Tyr Glu Phe Ile Ser Asp Asn Ser Ile

            420                 425                 430

Ser Trp Ser Ala Gly Leu His Asn Arg Tyr Thr Glu Asn Ser Leu Arg

        435                 440                 445

Gly Val Ile Leu Asp Ile His Phe Leu Ser Gln Ala Asp Phe Leu Val

    450                 455                 460

Cys Thr Phe Ser Ser Gln Val Cys Arg Val Ala Tyr Glu Ile Met Gln

465                 470                 475                 480

Thr Leu His Pro Asp Ala Ser Ala Asn Phe His Ser Leu Asp Asp Ile

                485                 490                 495

Tyr Tyr Phe Gly Gly Gln Asn Ala His Asn Gln Ile Ala Val Tyr Pro

            500                 505                 510

His Lys Pro Arg Thr Glu Glu Glu Ile Pro Met Glu Pro Gly Asp Ile

        515                 520                 525

Ile Gly Val Ala Gly Asn His Trp Asp Gly Tyr Ser Lys Gly Ile Asn

    530                 535                 540

Arg Lys Leu Gly Lys Thr Gly Leu Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Arg Glu

545                 550                 555                 560

Lys Ile Glu Thr Val Lys Tyr Pro Thr Tyr Pro Glu Ala Glu Lys

                565                 570                 575

<210>26

<211>383

<212>DNA

<213>Cricetulus griseus

<400>26

gttaactggg gctcttttaa accctgaatt tttctaaatc cccacctcca agagtttggt 60

ttaaactgat ttttttaatg aatacctttt gaagaataga gcattgtctc atcatgcaaa 120

gcttctcagg gattcagcta gcatgttgaa gaaacataag ggtgttaaat tgtttgtcac 180

aagtgctgaa taaatattga cgtagtcttc agctattcta tactggaagt agatgatatt 240

ctcattggaa attctgttag gaagtaaccc ttcttgtctt cttacctgca tagaatccca 300

ggatataaaa cttgtgcttg tcgcccttgc cattgtctct cactggtggc ctttattgca 360

tctcatatct gccttctctt tcc丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂 383

<210>27

<211>504

<212>DNA

<213>Cricetulus griseus

<400>27

taagaattcc tgtgcccagc tgtatgtgag gctctctgca ggtgtaggga tgtttctgct 60

ttctttctgc acatgcttca cagctgaagt cctttgggtg tgagattgac attcagatag 120

actaaagtga ctggacttgt tgggaaacat actgtatgca ttattgccgt tgcctccagg 180

tgaaattaac acctcattca ccaatccctg ttcatccaaa ctttctaccc acatcacttt 240

aaatagaaat tagacccaat atgactcctt ttttcctaag ctgtttatag agattgtgct 320

ggagcagtga gcttttgtgt ttgtttgttt gttttgtaat tttccccatg aaaatttctc 300

taaactcaaa cctaagaggg aaaaaaaaaa aacagactta tatgtgccac acttgtaaaa 360

aaaaatcatg aaagatgtat atgatatttt taaacagttt gaatattaag atcacaattt 420

ctattttaaa aacaatcttg ttttacatat caatcaccca attcccttgc cttcccatcc 480

tcccattccc cccactgatc cccc 丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂 504

<210>28

<211>120

<212>DNA

<213>Cricetulus griseus

<400>28

atgaatgttc attctttggg tatatgccca agagtagaat tgctaaatat tgaggtagac 60

tgattcccat tttcttgagg agtcgccata ttgatttcca aagtgactgt acaagttaac 120

<210>29

<211>274

<212>DNA

<213>Cricetulus griseus

<400>29

aggcactagg taaatatttt tgaagaaaga atgagtatct cctatttcag aaaaactttt 60

attgacttaa atttaggata tcagaattag aaaacagtaa aaatttatag gagagttttt 120

aatgaatgtt attttaaggt tccatacaaa tagtaattaa aacttacaca aactatttgt 180

agtaatgatt cagtctggta taccctgatg agcattatac acttttaaat tctttttgta 240

aattttttta ttagttcaaa ttaggaacaa gctt丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂丂 274

<210>30

<211>9196

<212>DNA

<213>Cricetulus griseus

<400>30

tctagaccag gctggtctcg aactcacaga gaaccacctg cctctgccac ctgagtgctg 60

ggattaaagg tgtgcaccac caccgcccgg cgtaaaatca tatttttgaa tattgtgata 120

atttacatta taattgtaag taaaaatttt cagcctattt tgttatacat ttttgcgtaa 180

attattcttt tttgaaagtt ttgttgtcca taatagtcta gggaaacata aagttataat 240

ttttgtctat gtatttgcat atatatctat ttaatctcct aatgtccagg aaataaatag 300

ggtatgtaat agcttcaaca tgtggtatga tagaattttt cagtgctata taagttgtta 360

cagcaaagtg ttattaattc atatgtccat atttcaattt tttatgaatt attaaattga 420

atccttaagc tgccagaact agaattttat tttaatcagg aagccccaaa tctgttcatt 480

ctttctatat atgtggaaag gtaggcctca ctaactgatt cttcacctgt tttagaacat 540

ggtccaagaa tggagttatg taaggggaat tacaagtgtg agaaaactcc tagaaaacaa 600

gatgagtctt gtgaccttag tttctttaaa aacacaaaat tcttggaatg tgttttcatg 660

ttcctcccag gtggatagga gtgagtttat ttcagattat ttattacaac tggctgttgt 720

tacttgtttc tatgtcttta tagaaaaaca tatttttttt gccacatgca gcttgtcctt 780

atgattttat acttgtgtga ctcttaactc tcagagtata aattgtctga tgctatgaat 840

aaagttggct attgtatgag acttcagccc acttcaatta ttggcttcat tctctcagat 900

cccaccacct ccagagtggt aaacaacttg aaccattaaa cagactttag tctttatttg 960

aatgatagat ggggatatca gatttatagg cacagggttt tgagaaaggg agaaggtaaa 1020

cagtagagtt taacaacaac aaaaagtata ctttgtaaac gtaaaactat ttattaaagt 1080

agtagacaag acattaaata ttccttggga ttagtgcttt ttgaattttg ctttcaaata 1140

atagtcagtg agtatacccc tcccccattc tatattttag cagaaatcag aataaatggt 1200

gtttctggta cattcttttg tagagaattt attttctttg ggtttttgtg catttaaagt 1260

caataaaaat taaggttcag taatagaaaa aaaactctga tttttggaat cccctttctt 1320

cagcttttct atttaatctc ttaatgataa tttaatttgt ggccatgtgg tcaaagtata 1380

tagccttgta tatgtaaatg ttttaaccaa cctgccttta cagtaactat ataattttat 1440

tctataatat atgacttttc ttccatagct ttagagttgc ccagtcactt taagttacat 1500

tttcatatat gttctttgtg ggaggagata attttatttc taagagaatc ctaagcatac 1560

tgattgagaa atggcaaaca aaacacataa ttaaagctga taaagaacga acatttggag 1620

tttaaaatac atagccaccc taagggttta actgttgtta gccttctttt ggaattttta 1680

ttagttcata tagaaaaatg gattttatcg tgacatttcc atatatgtat ataatatatt 1740

tacatcatat ccacctgtaa ttattagtgt ttttaaatat atttgaaaaa ataatggtct 1800

ggtttgatcc atttgaacct tttgatgttt ggtgtggttg ccaattggtt gatggttatg 1860

ataacctttg cttctctaag gttcaagtca gtttgagaat atgtcctcta aaaatgacag 1920

gttgcaagtt aagtagtgag atgacagcga gatggagtga tgagaatttg tagaaatgaa 1980

ttcacttata ctgagaactt gttttgcttt tagataatga acatattagc ctgaagtaca 2040

tagccgaatt gattaattat tcaaagatat aatcttttaa tccctataaa agaggtatta 2100

cacaacaatt caagaaagat agaattagac ttccagtatt ggagtgaacc atttgttatc 2160

aggtagaacc ctaacgtgtg tggttgactt aaagtgttta ctttttacct gatactgggt 2220

agctaattgt ctttcagcct cctggccaaa gataccatga aagtcaactt acgttgtatt 2280

ctatatctca aacaactcag ggtgtttctt actctttcca cagcatgtag agcccaggaa 2340

gcacaggaca agaaagctgc ctccttgtat caccaggaag atctttttgt aagagtcatc 2400

acagtatacc agagagacta attttgtctg aagcatcatg tgttgaaaca acagaaactt 2460

attttcctgt gtggctaact agaaccagag tacaatgttt ccaattcttt gagctccgag 2520

aagacagaag ggagttgaaa ctctgaaaat gcgggcatgg actggttcct ggcgttggat 2580

tatgctcatt ctttttgcct gggggacctt attgttttat ataggtggtc atttggttcg 2640

agataatgac caccctgacc attctagcag agaactctcc aagattcttg caaagctgga 2700

gcgcttaaaa caacaaaatg aagacttgag gagaatggct gagtctctcc ggtaggtttg 2760

aaatactcaa ggatttgatg aaatactgtg cttgaccttt aggtataggg tctcagtctg 2820

ctgttgaaaa atataatttc tacaaaccgt ctttgtaaaa ttttaagtat tgtagcagac 2880

tttttaaaag tcagtgatac atctatatag tcaatatagg tttacatagt tgcaatctta 2940

ttttgcatat gaatcagtat atagaagcag tggcatttat atgcttatgt tgcatttaca 3000

attatgttta gacgaacaca aactttatgt gatttggatt agtgctcatt aaattttttt 3060

attctatgga ctacaacaga gacataaatt ttgaaaggct tagttactct taaattctta 3120

tgatgaaaag caaaaattca ttgttaaata gaacagtgca tccggaatgt gggtaattat 3180

tgccatattt ctagtctact aaaaattgtg gcataactgt tcaaagtcat cagttgtttg 3240

gaaagccaaa gtctgattta aatggaaaac ataaacaatg atatctattt ctagatacct 3300

ttaacttgca gttactgagt ttacaagttg tctgacaact ttggattctc ttacttcata 3360

tctaagaatg atcatgtgta cagtgcttac tgtcacttta aaaaactgca gggctagaca 3420

tgcagatatg aagactttga cattagatgt ggtaattggc actaccagca agtggtatta 3480

agatacagct gaatatatta ctttttgagg aacataattc atgaatggaa agtggagcat 3540

tagagaggat gccttctggc tctcccacac cactgtttgc atccattgca tttcacactg 3600

cttttagaac tcagatgttt catatggtat attgtgtaac tcaccatcag ttttatcttt 3660

aaatgtctat ggatgataat gttgtatgtt aacactttta caaaaacaaa tgaagccata 3720

tcctcggtgt gagttgtgat ggtggtaatt gtcacaatag gattattcag caaggaacta 3780

agtcagggac aagaagtggg cgatactttg ttggattaaa tcattttact ggaagttcat 3840

cagggagggt tatgaaagtt gtggtctttg aactgaaatt atatgtgatt cattattctt 3900

gatttaggcc ttgctaatag taactatcat ttattgggaa tttgtcatat gtgccaattt 3960

gtcatgggcc agacagcgtg ttttactgaa tttctagata tctttatgag attctagtac 4020

tgttttcagc cattttacag atgaagaatc ttaaaaaatg ttaaataatt tagtttgccc 4080

aagattatac gttaacaaat ggtagaacct tctttgaatt ctggcagtat ggctacacag 4140

tccgaactct tatcttccta agctgaaaac agaaaaagca atgacccaga aaattttatt 4200

taaaagtctc aggagagact tcccatcctg agaagatctc ttttcccttt tataatttag 4260

gctcctgaat aatcactgaa ttttctccat gttccatcta tagtactgtt atttctgttt 4320

tccttttttc ttaccacaaa gtatcttgtt tttgctgtat gaaagaaaat gtgttattgt 4380

aatgtgaaat tctctgtccc tgcagggtcc cacatccgcc tcaatcccaa ataaacacac 4440

agaggctgta ttaattatga aactgttggt cagttggcta gggcttctta ttggctagct 4500

ctgtcttaat tattaaacca taactactat tgtaagtatt tccatgtggt cttatcttac 4560

caaggaaagg gtccagggac ctcttactcc tctggcgtgt tggcagtgaa gaggagagag 4620

cgatttccta tttgtctctg cttattttct gattctgctc agctatgtca cttcctgcct 4680

ggccaatcag ccaatcagtg ttttattcat tagccaataa aagaaacatt tacacagaag 4740

gacttccccc atcatgttat ttgtatgagt tcttcagaaa atcatagtat cttttaatac 4800

taatttttat aaaaaattaa ttgtattgaa aattatgtgt atatgtgtct gtgtgtcgat 4860

ttgtgctcat aagtagcatg gagtgcagaa gagggaatca gatctttttt taagggacaa 4920

agagtttatt cagattacat tttaaggtga taatgtatga ttgcaaggtt atcaacatgg 4980

cagaaatgtg aagaagctgg tcacattaca tccagagtca agagtagaga gcaatgaatt 5040

gatgcatgca ttcctgtgct cagctcactt ttcctggagc tgagctgatt gtaagccatc 5100

tgatgtcttt gctgggaact aactcaaagg caagttcaaa acctgttctt aagtataagc 5160

catctctcca gtccctcata tggtctctta agacactttc tttatattct tgtacataga 5220

aattgaattc ctaacaactg cattcaaatt acaaaatagt ttttaaaagc tgatataata 5280

aatgtaaata caatctagaa catttttata aataagcata ttaactcagt aaaaataaat 5340

gcatggttat tttccttcat tagggaagta tgtctcccca ggctgttctc tagattctac 5400

tagtaatgct gtttgtacac catccacagg ggttttattt taaagctaag acatgaatga 5460

tggacatgct tgttagcatt tagacttttt tccttactat aattgagcta gtatttttgt 5520

gctcagtttg atatctgtta attcagataa atgtaatagt aggtaatttc tttgtgataa 5580

aggcatataa attgaagttg gaaaacaaaa gcctgaaatg acagttttta agattcagaa 5640

caataatttt caaaagcagt tacccaactt tccaaataca atctgcagtt ttcttgatat 5700

gtgataaatt tagacaaaga aatagcacat tttaaaatag ctatttactc ttgatttttt 5760

tttcaaattt aggctagttc actagttgtg tgtaaggtta tggctgcaaa catctttgac 5820

tcttggttag ggaatccagg atgatttacg tgtttggcca aaatcttgtt ccattctggg 5880

tttcttctct atctaggtag ctagcacaag ttaaaggtgt ggtagtattg gaaggctctc 5940

aggtatatat ttctatattc tgtatttttt tcctctgtca tatatttgct ttctgtttta 6000

ttgatttcta ctgttagttt gatacttact ttcttacact ttctttggga tttattttgc 6060

tgttctaaga tttcttagca agttcatatc actgatttta acagttgctt cttttgtaat 6120

atagactgaa tgccccttat ttgaaatgct tgggatcaga aactcagatt tgaacttttc 6180

ttttttaata tttccatcaa gtttaccagc tgaatgtcct gatccaagaa tatgaaatct 6240

gaaatgcttt gaaatctgaa acttttagag tgataaagct tccctttaaa ttaatttgtg 6300

ttctatattt tttgacaatg tcaacctttc attgttatcc aatgagtgaa catattttca 6360

atttttttgt ttgatctgtt atattttgat ctgaccatat ttataaaatt ttatttaatt 6420

tgaatgttgt gctgttactt atctttatta ttatttttgc ttattttcta gccaaatgaa 6480

attatattct gtattatttt agtttgaatt ttactttgtg gcttagtaac tgccttttgt 6540

tggtgaatgc ttaagaaaaa cgtgtggtct actgatattg gttctaatct tatatagcat 6600

gttgtttgtt aggtagttga ttatgctggt cagattgtct tgagtttatg caaatgtaaa 6660

atatttagat gcttgttttg ttgtctaaga acaaagtatg cttgctgtct cctatcggtt 6720

ctggtttttc cattcatctc ttcaagctgt tttgtgtgtt gaatactaac tccgtactat 6780

cttgttttct gtgaattaac cccttttcaa aggtttcttt tctttttttt tttaagggac 6840

aacaagttta ttcagattac attttaagct gataatgtat gattgcaagg ttatcaacat 6900

ggcagaaatg tgaagaagct aggcacatta catccacatg gagtcaagag cagagagcag 6960

tgaattaatg catgcattcc tgtggtcagc tcacttttcc tattcttaga tagtctagga 7020

tcataaacct ggggaatagt gctaccacaa tgggcatatc cacttacttc agttcatgca 7080

atcaaccaag gcacatccac aggaaaaact gatttagaca acctctcatt gagactcttc 7140

ccagatgatt agactgtgtc aagttgacaa ttaaaactat cacacctgaa gccatcacta 7200

gtaaatataa tgaaaatgtt gattatcacc ataattcatc tgtatccctt tgttattgta 7260

gattttgtga agttcctatt caagtccctg ttccttcctt aaaaacctgt tttttagtta 7320

aataggtttt ttagtgttcc tgtctgtaaa tactttttta aagttagata ttattttcaa 7380

gtatgttctc ccagtctttg gcttgtattt tcatcccttc aatacatata tttttgtaat 7440

ttattttttt tatttaaatt agaaacaaag ctgcttttac atgtcagtct cagttccctc 7500

tccctcccct cctcccctgc tccccaccta agccccaatt ccaactcctt tcttctcccc 7560

aggaagggtg aggccctcca tgggggaaat cttcaatgtc tgtcatatca tttggagcag 7620

ggcctagacc ctccccagtg tgtctaggct gagagagtat ccctctatgt ggagagggct 7680

cccaaagttc atttgtgtac taggggtaaa tactgatcca ctatcagtgg ccccatagat 7740

tgtccggacc tccaaactga cttcctcctt cagggagtct ggaacagttc tatgctggtt 7800

tcccagatat cagtctgggg tccatgagca accccttgtt caggtcagtt gtttctgtag 7860

gtttccccag cccggtcttg acccctttgc tcatcacttc tccctctctg caactggatt 7920

ccagagttca gctcagtgtt tagctgtggg tgtctgcatc tgcttccatc agctactgga 7980

tgagggctct aggatggcat ataaggtagt catcagtctc attatcagag aagggctttt 8040

aaggtagcct cttgattatt gcttagattg ttagttgggg tcaaccttgt aggtctctgg 8100

acagtgacag aattctcttt aaacctataa tggctccctc tgtggtggta tcccttttct 8160

tgctctcatc cgttcctccc ctgactagat cttcctgctc cctcatgtcc tcctctcccc 8220

tccccttctc cccttctctt tcttctaact ccctctcccc tccacccacg atccccatta 8280

gcttatgaga tcttgtcctt attttagcaa aacctttttg gctataaaat taattaattt 8340

aatatgctta tatcaggttt attttggcta gtatttgtat gtgtttggtt agtgttttta 8400

accttaattg acatgtatcc ttatatttag acacagattt aaatatttga agtttttttt 8460

tttttttttt ttaaagattt atttattttt tatgtcttct gcctgcatgc cagaagaggg 8520

caccagatct cattcaaggt ggttgtgagc caccatgtgg ttgctgggaa ttgaactcag 8580

gacctctgga agaacagtca gtgctcttaa ccgctgagcc atctctccag cccctgaagt 8640

gtttctttta aagaggatag cagtgcatca tttttccctt tgaccaatga ctcctacctt 8700

actgaattgt tttagccatt tatatgtaat gctgttacca ggtttacatt ttcttttatc 8760

ttgctaaatt tcttccctgt ttgtctcatc tcttattttt gtctgttgga ttatataggc 8820

ttttattttt ctgtttttac agtaagttat atcaaattaa aattatttta tggaatgggt 8880

gtgttgacta catgtatgtc tgtgcaccat gtgctgacct ggtcttggcc agaagaaggt 8940

gtcatattct ctgaaactgg tattgtggat gttacgaact gccatagggt gctaggaatc 9000

aaaccccagc tcctctggaa aagcagccac tgctctgagc cactgagtcc tctcttcaag 9060

caggtgatgc caacttttaa tggttaccag tggataagag tgcttgtatc tctagcaccc 9120

atgaaaattt atgcattgct atatgggctt gtcacttcag cattgtgtga cagagacagg 9180

aggatcccaa gagctc                                                 9196

<210>31

<211>56

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>31

cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc cgaggtccag ttcaagtggt acgtgg     56

<210>32

<211>59

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>32

catctcctat gggggcaggg cctgtggttc tcggggctgt cctttggctt tggagatgg  59

<210>33

<211>330

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic peptide

<400>33

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225                 230                 235                 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>34

<211>330

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic peptide

<400>34

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Lys Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225                 230                 235                 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>35

<211>330

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic peptide

<400>35

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225                 230                 235                 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>36

<211>330

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic peptide

<400>36

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Lys Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225                 230                 235                 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>37

<211>330

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic peptide

<400>37

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

  1               5                  10                  15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

             20                  25                  30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

         35                  40                  45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

     50                  55                  60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

 65                  70                  75                  80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

                 85                  90                  95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

            100                 105                 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

        115                 120                 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

    130                 135                 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

145                 150                 155                 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

                165                 170                 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

            180                 185                 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

        195                 200                 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

    210                 215                 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225                 230                 235                 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

                245                 250                 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

            260                 265                 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

        275                 280                 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

    290                 295                 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305                 310                 315                 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                325                 330

<210>38

<211>50

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>38

cgtggtggtg agccacgaag accccgaggt caagttcaac tggtacgtgg           50

<210>39

<211>121

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic peptide

<400>39

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe

             20                  25                  30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

         35                  40                  45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro

     50                  55                  60

Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln

 65                  70                  75                  80

Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr

                 85                  90                  95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

            100                 105                 110

Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>40

<211>363

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>40

caggtccaac tgcaggagag cggtccaggt cttgtgagac ctagccagac cctgagcctg 60

acctgcaccg tgtctggctt caccttcacc gatttctaca tgaactgggt gagacagcca 120

cctggacgag gtcttgagtg gattggattt attagagaca aagctaaagg ttacacaaca 180

gagtacaatc catctgtgaa ggggagagtg acaatgctgg tagacaccag caagaaccag 240

ttcagcctga gactcagcag cgtgacagcc gccgacaccg cggtctatta ttgtgcaaga 300

gagggccaca ctgctgctcc ttttgattac tggggtcaag gcagcctcgt cacagtctcc 360

tca                                                               363

<210>41

<211>107

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic peptide

<400>41

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Lys Tyr

             20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Ile Ser Arg Pro Arg

                 85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

            100                 105

<210>42

<211>321

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>42

gacatccaga tgacccagag cccaagcagc ctgagcgcca gcgtgggtga cagagtgacc 60

atcacctgta aagcaagtca gaatattgac aaatacttaa actggtacca gcagaagcca 120

ggtaaggctc caaagctgct gatctacaat acaaacaatt tgcaaacggg tgtgccaagc 180

agattcagcg gtagcggtag cggtaccgac ttcaccttca ccatcagcag cctccagcca 240

gaggacatcg ccacctacta ctgcttgcag catataagta ggccgcgcac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a                                           321

<210>43

<211>451

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic peptide

<400>43

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln

  1               5                  10                  15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Phe

             20                  25                  30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

         35                  40                  45

Gly Phe Ile Arg Asp Lys Ala Lys Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro

     50                  55                  60

Ser Val Lys Gly Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln

 65                  70                  75                  80

Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr

                 85                  90                  95

Tyr Cys Ala Arg Glu Gly His Thr Ala Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly

            100                 105                 110

Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

        115                 120                 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

    130                 135                 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145                 150                 155                 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

                165                 170                 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

            180                 185                 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

        195                 200                 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

    210                 215                 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225                 230                 235                 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

                245                 250                 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

            260                 265                 270

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

        275                 280                 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe

    290                 295                 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305                 310                 315                 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

                325                 330                 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

            340                 345                 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

        355                 360                 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

    370                 375                 380

Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro

385                 390                 395                 400

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

                405                 410                 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met

            420                 425                 430

His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

        435                 440                 445

Pro Gly Lys

    450

<210>44

<211>214

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic peptide

<400>44

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

  1               5                  10                  15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ile Asp Lys Tyr

             20                  25                  30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

         35                  40                  45

Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

     50                  55                  60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

 65                  70                  75                  80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Ile Ser Arg Pro Arg

                 85                  90                  95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

            100                 105                 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

        115                 120                 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

    130                 135                 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145                 150                 155                 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

                165                 170                 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

            180                 185                 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

        195                 200                 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

    210

<210>45

<211>476

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>45

cccacaagct gcggccgcga cccctcacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg 60

tagcaacagc tacaggtgtc cactcccagg tccaactgca ggagagcggt ccaggtcttg 120

tgagacctag ccagaccctg agcctgacct gcaccgtgtc tggcttcacc ttcaccgatt 180

tctacatgaa ctgggtgaga cagccacctg gacgaggtct tgagtggatt ggatttatta 240

gagacaaagc taaaggttac acaacagagt acaatccatc tgtgaagggg agagtgacaa 300

tgctggtaga caccagcaag aaccagttca gcctgagact cagcagcgtg acagccgccg 360

acaccgcggt ctattattgt gcaagagagg gccacactgc tgctcctttt gattactggg 420

gtcaaggcag cctcgtcaca gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttc     476

<210>46

<211>131

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>46

cccacaagct gcggccgcga cccctcacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg 60

tagcaacagc tacaggtgtc cactcccagg tccaactgca ggagagcggt ccaggtcttg 120

tgagacctag c                                                      131

<210>47

<211>140

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>47

gctttgtctc taataaatcc aatccactca agacctcgtc caggtggctg tctcacccag 60

ttcatgtaga aatcggtgaa ggtgaagcca gacacggtgc aggtcaggct cagggtctgg 120

ctaggtctca caagacctgg                                             140

<210>48

<211>140

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>48

ggattggatt tattagagac aaagctaaag gttacacaac agagtacaat ccatctgtga 60

aggggagagt gacaatgctg gtagacacca gcaagaacca gttcagcctg agactcagca 120

gcgtgacagc cgccgacacc                                             140

<210>49

<211>131

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>49

gaagaccgat gggcccttgg tggaggctga ggagactgtg acgaggctgc cttgacccca  60

gtaatcaaaa ggagcagcag tgtggccctc tcttgcacaa taatagaccg cggtgtcggc  120

ggctgtcacg c                                                       131

<210>50

<211>421

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>50

cccacaagct gaattcgcct cctcaaaatg ggatggagct gtatcatcct cttcttggta 60

gcaacagcta caggtgtcca ctccgacatc cagatgaccc agagcccaag cagcctgagc 120

gccagcgtgg gtgacagagt gaccatcacc tgtaaagcaa gtcagaatat tgacaaatac 180

ttaaactggt accagcagaa gccaggtaag gctccaaagc tgctgatcta caatacaaac 240

aatttgcaaa cgggtgtgcc aagcagattc agcggtagcg gtagcggtac cgacttcacc 300

ttcaccatca gcagcctcca gccagaggac atcgccacct actactgctt gcagcatata 360

agtaggccgc gcacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaacgtac ggtggctgca 420

c                                                                 421

<210>51

<211>120

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>51

cccacaagct gaattcgcct cctcaaaatg ggatggagct gtatcatcct cttcttggta 60

gcaacagcta caggtgtcca ctccgacatc cagatgaccc agagcccaag cagcctgagc 120

<210>52

<211>117

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>52

ggagccttac ctggcttctg ctggtaccag tttaagtatt tgtcaatatt ctgacttgct 60

ttacaggtga tggtcactct gtcacccacg ctggcgctca ggctgcttgg gctctgg    117

<210>53

<211>125

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>53

gcagaagcca ggtaaggctc caaagctgct gatctacaat acaaacaatt tgcaaacggg 60

tgtgccaagc agattcagcg gtagcggtag cggtaccgac ttcaccttca ccatcagcag 120

cctcc                                                             125

<210>54

<211>123

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic DNA

<400>54

gtgcagccac cgtacgtttg atttccacct tggtcccttg gccgaacgtg cgcggcctac 60

ttatatgctg caagcagtag taggtggcga tgtcctctgg ctggaggctg ctgatggtga 120

agg                                                               123