甘草中glycyrrhisoflavone的筛选方法﹑提取方法﹑含量测定方法及用途

摘要

本发明涉及甘草中glycyrrhisoflavone的筛选方法、提取方法、含量测定方法及用途。采用多种仪器分析方式，结合α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选方法，确认了甘草提取物中的glycyrrhisoflavone，并提供了从甘草中提取glycyrrhisoflavone的方法，该方法可最大限度的富集甘草中的glycyrrhisoflavone，该提取物可以进一步开发成为作为治疗与预防II型糖尿病的新型药物及保健食品上应用，本发明还提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的新的高效液相色谱定量方法，该方法快速、简便、重现性好，准确度高，为控制甘草及其产品的质量提供了可行的方案。

说明书

技术领域：

本发明涉及中药材有效成分的分析、提取技术，还涉及化工技术，特别是甘草中glycyrrhisoflavone的确认方法、提取方法、含量测定方法及用途。

背景技术：

抑制α-葡萄糖苷酶可以显著降低进食碳水化合物后的血糖浓度，因此可以成为调节II型糖尿病人及高危人群餐后血糖浓度的重要方法，参见RammohanSubramanian.M.Zaini Asmawi and Amirin Sadikun.2008.In vitroα-glucosidase and α-amylase enzyme inhibitory effects of Andrographispaniculata extract and andrographolide.Acta Biochemica polonica55(2)：391-398。同时，α-葡萄糖苷酶抑制剂易与其他类型糖尿病治疗药物并用等种种因素，都使α-葡萄糖苷酶抑制剂成为糖尿病治疗中的重要药物。目前临床使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂主要包括阿卡波糖(Acarbose)，伏格列波糖(Voglibose)和米格列醇(Miglitol)三种。然而，阿卡波糖和伏格列波糖具有强烈的肠道副作用，以及由于其分解产物在肠道内吸收而引起的肝损伤副作用。而米格列醇虽然降低了肠道副作用，而且尚无肝损伤副作用报道，但其临床用量的1/2以未变化体形式在小肠上部被吸收，对体内的存在的α-葡萄糖苷酶的影响仍然需要关注。基于以上，作为糖尿病治疗药物的新型α-葡萄糖苷酶抑制剂的研制与开发仍须进一步研发和完善。

甘草为豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza)植物的根和根状茎，在《神农本草经》中作为上品收载，其主要功效是和中缓急、润肺、解毒、调和诸药等，是临床应用最为广泛的传统中药。甘草含有多种活性成分为皂苷类、黄酮类和异黄酮类化合物。其黄酮类成分有治疗糖尿病的生物活性，参见KakuNakagawa，Hideyuki Kishida；Naoki Arai，Tozo Nishiyama，and TatsumasaMae.2004.Licorice flavonoids suppress abdominal fat accumulation and increase inblood glucose level in obese diabetic KK-Ay Mice Biol.Pharm.Bull 27(11)，1775-1778。

Glycyrrhisoflavone一词没有规范的中文译文，属于黄酮类物质，Isoflavone是异黄酮的意思。

发明内容：

本发明的目的之一是提供一种甘草中glycyrrhisoflavone的筛选方法；

本发明的目的之二是提供两种甘草中glycyrrhisoflavone的提取方法；

本发明的目的之三是提供一种glycyrrhisoflavone的用途；

本发明的目的之四是提供一种甘草中glycyrrhisoflavone含量的定量分析方法。

本发明的目的按照下述技术方案实现：

甘草中glycyrrhisoflavone的筛选方法，包括以下工艺过程：

1)甘草乙醇提取物(LF)用水悬浊后使用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯层LE。

2)利用silica对LE进行柱层析，依次使用氯仿，氯仿-甲醇和氯仿-甲醇-水系统进行梯度洗脱，对流出液依照硅胶薄层层析结果进行合并，得到14个分离部位LE1-9，LEa-e；在1mg/mL浓度下进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测定，LE8对蔗糖酶和麦芽糖酶的抑制活性最高。

3)利用反相ODS硅胶柱对LE8进行层析，使用甲醇-水和甲醇系统进行洗脱，得到2个分离部位LE81，LE82，分离部位LE81在1mg/mL浓度下对蔗糖酶和麦芽糖酶的抑制活性最高。

4)LE81上高效液相色谱，使用甲醇-水-含三氟乙酸进行洗脱，得到9个分离部位LE811-819；分离部位LE818在1mg/mL浓度对蔗糖酶和麦芽糖酶的抑制活性最高。

5)通过核磁共振法确定了LE818的结构，为化合物glycyrrhisoflavone，其分子式为：C₂₀H₁₈O₆，化学结构式为：

甘草中glycyrrhisoflavone的一种提取方法，其工艺过程为：将甘草乙醇提取物用水混悬后加入乙酸乙酯提取，乙酸乙酯层上silica柱层析进一步分离，氯仿-甲醇洗脱，根据硅胶薄层层析结果将含有glycyrrhisoflavone的部分进行合并，上高效液相色谱，使用甲醇-水-三氟乙酸进行洗脱，得到含有glycyrrhisoflavone的部分，再利用HP-20大孔树脂柱除去三氟乙酸，得到glycyrrhisoflavone。

甘草中glycyrrhisoflavone的另一种提取方法，将甘草乙醇提取物上HP-20大孔树脂，依次用甲醇-水、甲醇洗脱，含有glycyrrhisoflavone部分上silica柱层析进一步分离，氯仿-甲醇洗脱，根据硅胶薄层层析结果将含有glycyrrhisoflavone的部分进行合并，上高效液相色谱，流动相甲醇-水-三氟乙酸，根据高效液相色谱仪检查结果，得到含有glycyrrhisoflavone的部分，再利用HP-20大孔树脂柱除去三氟乙酸，得到glycyrrhisoflavone。

glycyrrhisoflavone作为α-葡萄糖苷酶抑制剂在制备治疗或预防II型糖尿病药物与保健食品上的应用。

甘草中glycyrrhisoflavone含量的定量分析方法，采用高效液相色谱法，色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈-水-三氟乙酸；流速：1.2mL/min；检测波长：260nm；柱温：40℃；进样量10μL；以标准glycyrrhisoflavone为对照品，用甲醇溶解制成对照品溶液，分浓度上柱进行测定，根据所测数据回归线性方程式；供试品的准备：定量甘草样品用甲醇溶液超声提取，提取液减压蒸干，加甲醇使溶解，过滤，滤液置于25mL量瓶中，加甲醇至刻度，供试品进柱测定，根据测定值通过线性方程式得出含量值。

本发明采用多种仪器分析方式，结合α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选方法，确认了甘草提取物中的glycyrrhisoflavone，并提供了从甘草中提取glycyrrhisoflavone的方法，该方法可最大限度的富集甘草中的glycyrrhisoflavone，该提取物可以进一步开发成为作为治疗与预防II型糖尿病的新型药物及保健食品上应用，本发明还提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂的新的高效液相色谱定量方法，该方法快速、简便、重现性好，准确度高，为控制甘草及其产品的质量提供了可行的方案。

具体实施方式：

一、Glycyrrhisoflavone的活性筛选

(1)甘草95％乙醇提取物(LF)用水悬浊后使用乙酸乙酯及正丁醇萃取得到乙酸乙酯层(LE)，乙酸乙酯提取部(LE)利用silica柱层析，依次使用氯仿(5.5L)，氯仿-甲醇(97∶3)(1.5L)，氯仿-甲醇(95∶5)(4L)，氯仿-甲醇(93∶7)(5L)，氯仿-甲醇(9∶1)(5L)和氯仿-甲醇-水(60∶20∶3)(4L)，氯仿-甲醇-水(60∶29∶6)(4L)，氯仿-甲醇-水(6∶4∶1)(4.5L)系统进行梯度洗脱，每个分离部位500mL共得到67个分离部位，依照硅胶薄层层析结果进行合并，得到14个分离部位LE1-14；在1mg/mL浓度下进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测定，LE8活性最强，对蔗糖酶和麦芽糖酶的抑制活性分别为20.7％和47.5％。

(2)甘草黄酮分离部位LE8利用反相ODS硅胶柱层析，使用甲醇-水(70∶30)(500mL)和甲醇(500mL)系统进行洗脱，分别得到分离部位LE81和LE82；两分离部位分别在1mg/mL浓度评价了其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，分离部位LE81抑制活性较强，对蔗糖酶和麦芽糖酶的抑制活性分别为56.8％和80.0％。甘草黄酮分离部位LE81利用JASCO PU-1580高效液相色谱仪，Shodex RI-71示差检测器，Waters X-Bridge ODS制备柱，流速为5mL/min，流动相甲醇-0.06％三氟乙酸70∶30(v/v)，使用甲醇-水(含0.06％三氟乙酸)进行洗脱，得到9个分离部位LE811-819；各分离部位分别在1mg/mL浓度评价了其对α-葡萄糖苷酶的抑制活性；在各分离部位中，保留时间为35.4min的分离部位LE818抑制活性最强，在1mg/mL浓度时，对蔗糖酶和麦芽糖酶的抑制活性分别为117.8％和129.1％，完全抑制了蔗糖酶和麦芽糖酶的活性；

(3)通过核磁共振法确定了LE818的结构，为化合物glycyrrhisoflavone，该化合物具有下述光谱化学和物理特性。

分子式：C₂₀H₁₈O₆

ESI-MS(positive)m/z：377[M+Na]⁺

¹H NMR(400MHz，CD₃OD)(δ)

1.73(6H，s)，3.34(2H，d，J＝7.6Hz)，5.34(1H，brt)，6.22(1H，d，J＝2.1Hz)，6.34(1H，d，J＝2.1Hz)，6.72(1H，d，J＝2.0Hz)，6.87(1H，d，J＝2.3Hz)，7.99(1H，s).

二、提取方法：两种甘草种化合物glycyrrhisoflavone的提取分离方法主要步骤如下：

(1)将50g宁夏乌拉尔甘草分别用95％乙醇8L，6.4L，4.8L在75℃回流提取三次，分别提取2小时，2小时，1小时，回流液过滤，减压浓缩，得到的浸膏在70℃下干燥，粉碎得固体10g。将所得固体用水混悬后加入乙酸乙酯提取，乙酸乙酯层上silica柱层析(填料高25cm，柱直径3.4cm)进一步分离，用氯仿-甲醇95∶5洗脱，根据硅胶薄层层析结果将含有glycyrrhisoflavone的部分进行合并，旋干后得固体0.301g。利用JASCO PU-1580高效液相色谱仪，ShodexRI-71示差检测器，Waters X-Bridge ODS柱制备柱，流速为5mL/min，流动相甲醇-0.06％三氟乙酸70∶30(v/v)使用甲醇-水(含0.06％三氟乙酸)进行洗脱制备，根据高效液相色谱仪检查结果，得到含有glycyrrhisoflavone的部分，再利用HP-20大孔树脂柱用30％甲醇洗脱至洗脱液呈中性除去三氟乙酸，旋干后得到glycyrrhisoflavone10.05mg

(2)将50g宁夏乌拉尔甘草分别用乙醇8L，6.4L，4.8L在75℃回流提取三次，分别提取2小时，2小时，1小时，回流液过滤，减压浓缩，得到的浸膏在70℃下干燥，粉碎得固体10g。将所得固体上HP-20大孔树脂柱(填料高40cm，柱直径3.4cm)，依次用甲醇-水70∶30、甲醇-水90∶10、甲醇各1000ml洗脱，根据高效液相色谱仪检查结果90％甲醇部分含有glycyrrhisoflavone，旋干的得固体1.446g。将HP-20大孔树脂柱所得样品上silica柱层析(填料高25cm，柱直径3.4cm)进一步分离，用氯仿-甲醇95∶5洗脱，根据硅胶薄层层析结果将含有glycyrrhisoflavone的部分进行合并，旋干后得固体0.262g。利用JASCOPU-1580高效液相色谱仪，Shodex RI-71示差检测器，Waters X-Bridge ODS柱制备柱，流速为5mL/min，流动相甲醇-0.06％三氟乙酸70∶30(v/v)使用甲醇-水(含0.06％三氟乙酸)进行洗脱制备，根据高效液相色谱仪检查结果，得到含有glycyrrhisoflavone的部分，再利用HP-20大孔树脂柱用30％甲醇洗脱至洗脱液呈中性除去三氟乙酸，旋干后得到glycyrrhisoflavone10.83mg。

将上述α-葡萄糖苷酶的抑制活性测定实验叙述如下：

(1)基质的配置：将蔗糖、麦芽糖分别配制成20mg/mL的溶液，作为活性测定的基质。

56μm马来酸溶液的配置：取马来酸0.56g，加蒸馏水100mL，溶解后，用水酸化的NaOH溶液调pH值到6.0。

(2)粗酵素液的配置：大鼠肠管粉末100mg，用56μm马来酸溶液900μL超声提取20分钟，离心分离(4℃，3000rpm，10min)，取上清液，冷冻保存。

(3)测定用酵素溶液的配置：取粗酵素液，用56μm马来酸溶液按1∶1(蔗糖)和1∶40(麦芽糖)的比例稀释(使测定的吸光度＜1.3)

(4)样品溶液的配置：将GU818用甲醇配置成0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.5mg/mL以及1mg/mL的一系列浓度的溶液。

样品溶液的混合如下表所示：

  名称  基质溶  液  (μL)  56μm马来酸  (μL)  溶媒  (μL)  样品溶  液  (μL)  阴性对照  100  40  10  -

  名称  基质溶  液  (μL)  56μm马来酸  (μL)  溶媒  (μL)  样品溶  液  (μL)  阴性对照  空白  100  140  10  -  样品  100  40  -  10  样品空白  100  140  -  10

(5)上述各溶液混合后，37℃恒温震荡反应1h后，再102℃灭活10min，取出，取灭活后的溶液每孔10μL，加入已经装有发色液(每孔300μL)的板内，37℃恒温震荡10min，取出，510nm测定吸光度。抑制率为[(OD_阴性对照-OD_{阴性对照空白})-(OD_样品-OD_样品空白)]/(OD_阴性对照-OD_{阴性对照空白})×100％。

由上述方法测得glycyrrhisoflavoneIC₅₀，结果如下图所示：

三、利用高效液相色谱仪法测定甘草中glycyrrhisoflavone的含量

(1)色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5μm，250×4.6mm)；流动相：乙腈-0.06％三氟乙酸42∶58；流速：1.2mL/min；检测波长：260nm；柱温：40℃；进样量10μL。

(2)供试品溶液的制备

取不同产地及来源的干草样品粉末，各取2g，加甲醇40mL，超声提取60min，提取3次，提取液减压蒸干，残渣加甲醇使溶解，用Sep-Pak(Waters C18)柱滤过，滤液置于25mL量瓶中，加甲醇至刻度。

(3)检测限(LOD)和定量限(LOQ)的测定

将对照品GU818用甲醇制成对照品溶液，进行测定，检测限(LODsignal/noise＞3)为0.5μg/mL(2.5ng)；定量限(LOQ signal/noise＞10)5μg/mL(5ng)

(4)仪器精密度试验

精密量取含GU818对照品溶液(50μg/mL)20μL，重复进样5次测定峰面积，RSD为0.3％(n＝5)。

(5)线性关系的测定

将GU818对照品用甲醇配置成每1mL含5，10，50，100，200和500μg的溶液，各取20μL，注入高效液相色谱仪，测定，测定结果GU818在浓度(5～500)μg/mL之间线性关系良好，回归方程：Y＝0.0272X-0.0472(Y为峰面积×10-6)R²＞0.999。

(6)重复性实验的测定

取宁夏盐池县甘草样品，取4份，每份2g，按含量测定的方法测定，每个样品测定3次，RSD＝2％。

(7)回收率实验的测定

取宁夏盐池县甘草样品，取4份，每份1g，分别加入不同量的GU818对照品按含量测定的方法测定，每个样品测定3次，回收率为98.2％-102.0％.RSD＝1.8％。